Деструкція ксенобіотиків з використанням культурального фільтрату ксилотрофів Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

S)

УДК 582.284+57.083.132: 579.24

Федотов О.В.

ДЕСТРУКЦ1Я КСЕНОБ1ОТИК1В З ВИКОРИСТАННЯМ КУЛЬТУРАЛЬНОГО Ф1ЛЬТРАТУ КСИЛОТРОФ1В

Донецький нащональний утверситет, м. Втниця, Украхна, e-mail: [email protected]

Дослужено ефектившсть бiодеградацii забруднювачiв на модельнш сполуцi -барвнику Methyl Orange культуральним фьльтратом (КФ) штамiв ксилотрофiв, при ix культивуваннi глибинним методом на стандартному глюкозо-пептонному середовищi (ГПС). Мета роботи - скриншг 81 штаму 19 видiв ксилотрофiв за показником ефективност бiодеградацii барвника, та вивчення можливостi iндукцii даного показника шляхом модифшацп живильного середовища. Ефектившсть бюдеградацп визначали наступним методом. Встановлену юльюсть КФ (дослiд) чи живильного середовища (контроль) додавали до 0,001% розчину Methyl Orange в натрш-ацетатному буферь Водневий показник реакцiйноi сумiшi становив 4,4 од. Проби шкубували при +40°С протягом 48 годин. Шсля цього встановлювали рН реакцiйноi сумiшi на рiвнi 3,1 од. за допомогою натрiй-ацетатного буферу та вимiрювали оптичну густину розчинiв при довжиш xвилi 506 нм. Ефектившсть бюдеградацп розраховували за рiзницею оптичноi густини контролю та дослЦу у вЦсотках. Вiдiбрано найбiльш перспективнi для бюдеградацп штами - F. velutipes F-1105, P. eryngii P-er, T. hirsuta Th-11 i D. quercina Dq-08. Для них модифiковано склад глюкозо-пептонного середовища шляхом введення до нього лпносульфонату, твiн-80, розчину мшеральних елементiв за Крком та шдбору концентрацп цих компонентiв. Встановлено, що з метою деградацп полютантiв дощльно культивувати штам F. velutipes F-1105 на модифшованому ГПС, яке додатково мштить, на 1 л: лпносульфонат - 3,5 г, Твш-80 - 1,0 г, розчин мшеральних елеменпв Кiрка - 70 мл; штам P. eryngii P-er - 5,0 г, 1,0 г, 70 мл; штам T. hirsuta Th-11 - 5,0 г, 1,0 г, 105 мл; та штам D. quercina Dq-08 - 6,5 г, 1,0 г, 105 мл, вЦповЦно. Це дозволяе шдвищити ефектившсть деструкцп модельноi сполуки культуральним фьльтратом штаму F. velutipes F-1105 у 9,3; штаму D. quercina Dq-08 - у 9,6; штаму P. eryngii P-er - у 13,3 та штаму T. hirsuta Th-11 - у 19,2 рази. За результатами роботи розроблеш модифшацп ГПС, яю шдвишують ефектившсть окислювальноi деструкцп модельноi сполуки Methyl Orange, що е шдставою подальшоi оптимiзацii умов культивування обраних штамiв ксилотрофiв з метою шдукцп бюдеградацп ксенобютиюв.

Ключое1 слова: ксилотрофш базидюмщети, глибинне культивування, бюдеградац1я,

O.V. Fedotov

DESTRUCTION OF XENOBIOTICS BY CULTURE FILTRATE FROM XYLOTROPHIC BASIDIOMYCETES Donetsk National University, Vinnitsa, Ukraine e-mail: [email protected]

The article deals with the efficiency of pollutants biodegradation by xylotrophic basidiomycetes submerged cultures grown on standard glucose-peptone medium (GPM). The efficiency of pollutants biodegradation was determined by the model compound - dye Methyl Orange. The purpose of the work is screening of 19 species 81 strains xylotrophic basidiomycetes cultures on the indicator of the dye oxidative degradation efficiency and exploring the possibility of induction of this indicator by modifying the culture medium. The biodegradation efficiency was determined by following method. Assigned amount of culture filtrate (experiment) or medium (control) was added to the 0.001% solution of Methyl Orange in sodium acetate buffer. pH of the reaction mixture was 4.4 units. Samples were incubated at +40°C for 48 hours. Then pH of the reaction mixture was set up at 3.1 units using sodium acetate buffer and the optical density of solutions at a wavelength of 506 nm was measured. The efficiency of biodegradation was calculated by the difference of the optical density of control and experiment as a percentage. The most promising strains - F. velutipes F-1105, P. eryngii P-er, T. hirsuta Th-11 and D. quercina Dq-08 were selected. The composition of the glucose-peptone medium was modified for these strains by the introduction in the medium lignosulfonate, Tween 80, Kirk's minerals solution and selecting the concentration of these components. According to the study for the purpose of pollutants degradation it is advisable to cultivate F. velutipes F-1105 strain on modified GPM, which further comprises at 1 l: lignosulfonate - 3.5 g; Tween 80 - 1.0 g, Kirk's minerals solution - 70 ml; P. eryngii P-er strain - 5.0 g, 1.0 g, 70 ml; T. hirsuta Th-11 strain - 5.0 g, 1.0 g, 105 ml; and D. quercina Dq-08 strain -6.5 g, 1.0 g, 105 ml, respectively. This allowed to increase the model compound degradation efficiency by the culture filtrate of strain F. velutipes F-1105 in 9,3; D. quercina Dq-08 - in 9,6; P. eryngii P-er - in 13,3 and T. hirsuta Th-11 - 19,2 times. Thus, GPS modifications were designed that enhance the model compound oxidative degradation efficiency and are the basis for further optimization of the selected xylotrophic basidiomycetes strains submerged cultivation conditions to increase biodegradation of xenobiotics.

Keywords: xylotrophic basidiomycetes, submerged cultivation, biodegradation, Methyl Orange.

Федотов О.В.

ДЕСТРУКЦИЯ КСЕНОБИОТИКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА КСИЛОТРОФОВ

Донецкий национальный университет, г. Винница, Украина e-mail: [email protected]

Исследована эффективность биодеградации загрязнителей на модельном составе -красителе Methyl Orange культуральным фильтратом (КФ) штаммов ксилотрофов, при их культивировании глубинным методом на стандартной глюкозо-пептонной среде (ГПС). Цель работы - скрининг 81 штамма 19 видов ксилотрофов по показателю эффективности биодеградации красителя, и изучение возможности индукции данного показателя путем модификации питательной среды. Эффективность биодеградации определяли следующим методом. Установленное количество КФ (опыт) или питательной среды (контроль) добавляли к 0,001% раствора Methyl Orange в натрий-ацетатном буфере. Водородный показатель реакционной смеси составлял 4,4 ед. Пробы инкубировали при 40°С в течение 48 часов. После этого устанавливали рН реакционной смеси на уровне 3,1 ед. с помощью натрий-ацетатного буфера и измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 506 нм. Эффективность биодеградации рассчитывали по разнице оптической плотности контроля и опыта в процентах. Отобраны наиболее перспективные для биодеградации штаммы -F. velutipes F-1105, P. eryngii P-er, T. hirsuta Th-11 и D. quercina Dq-08. Для них модифицировано состав глюкозо-пептонной среды путем введения в нее лигносульфоната, твин-80, раствора минеральных элементов по Кирку и подбора концентрации этих компонентов. Установлено, что с целью деградации поллютантов целесообразно культивировать штамм F. velutipes F-1105 на модифицированной ГПС, которая дополнительно содержит, на 1 л: лигносульфонат - 3,5 г, Твин-80 - 1,0 г, раствор минеральных элементов Кирка - 70 мл; штамм P. eryngii P-er - 5,0 г, 1,0 г, 70 мл; штамм T. hirsuta Th-11 - 5,0 г, 1,0 г, 105 мл; и штамм D. quercina Dq-08 - 6,5 г, 1,0 г, 105 мл, соответственно. Это позволяет повысить эффективность деструкции модельного состава культуральным фильтратом штамма F. velutipes F-1105 в 9,3; штамма D. quercina Dq-08 - в 9,6; штамма P. eryngii P-er - в 13,3 и штамма T. hirsuta Th-11 - в 19,2 раза. По результатам работы разработаны модификации ГПС, которые повышают эффективность окислительной деструкции модельного состава Methyl Orange, что является основанием дальнейшей оптимизации условий культивирования избранных штаммов ксилотрофов с целью индукции биодеградации ксенобиотиков.

Ключевые слова: ксилотрофные базидиомицеты, глубинное культивирование, биодеградация, Methyl Orange.

Останшм часом, через висок темпи росту промислового виробництва, утворюеться велика юльюсть високо- та низькотоксичних вiдхoдiв/ що мають слабку бшдоступшсть. Це ксенобютики - чужорЦш для живих оргашз]шв хiмiчнi речовини, що природно не входять до бютичного кругооб^. Серед таких речовин значна юльюсть представлена фенольними сполуками. Наприклад, метилоранж Methyl Orange (CAS 547-58-0) - поширений оргашчний ISSN 2225-5486 (Print), ISSN 2226-9010 (Online). Бiологiчний вкник МДПУ. 2015. №3

барвник, шиpoкo викopиcтoвyваний в пpoмиcлoвocтi (Федoтoв та ш., 2012).

Отже, oдна з найбыьш актyальних пpoблем cьoгoдення - рацюнальне пpиpoдoкopиcтyвання, зoкpема, yтилiзацiя пpoмиcлoвих вiдхoдiв. Так, cеpед фiзикo-хiмiчних метoдiв oчищення cтiчних вoд, ефективним метoдoм вважаeтьcя адcopбцiя. Однак, при такoмy oчищеннi не виpiшyeтьcя питання деградацп цих pечoвин. Рoзpoбка cпocoбiв дегpадацiï кcенoбioтикiв базyeтьcя на пoшyкy нoвих технoлoгiй абo opганiзмiв - деcтpyктopiв хiмiчних cпoлyк. Miкpoopганiзми, якi знайшли шиpoке заcтocyвання в oчиcних cпopyдах, не завжди здатш дo знешкoдження пpoмиcлoвих викидiв. Це пoв'язанo з тим, rn;o вoни не вoлoдiють тов^^нним ферментативним кoмплекcoм, здатним дo пoвнoгo poзкладання пoлютантiв. Як наcлiдoк, щ pечoвини накoпичyютьcя в навкoлишньoмy cеpедoвищi.

Базидiальнi кcилoтpoфи - евoлюцiйнo найбыьш мoлoде yгpyпyвання гpибiв з надзвичайто пoтyжним ферментним кoмплекcoм, здатним дo pyйнyвання cкладнoгo та хiмiчнo cifrara лiгнiнoцеллюлoзнoгo кoмплекcy деревини. Рoбoта цих ферменив тicнo взаeмoпoв'язана з фyнкцioнyванням пpooкcидантнo-антиoкcидантнoï cиcтеми кcилoтpoфiв. Остання reœpye активoванi фopми киcню, зoкpема лiпoпеpекиcнi радикали, як1 e мoдyлятopами пpoцеciв бioдегpадацiï (Дyдка и др., 1982; Hammel et al., 2002). Отже, e перотективним залyчення кcилoтpoфних базидюмщетав дo пpoцеciв бiopемедiацiï забpyднених cеpедoвищ i poзкладання нoвих пpoмиcлoвo-yтвopених pечoвин (Kапич, 2011; Рабинoвич та ш., 2004).

Метою poбoти бyлo пpoведення cкpинiнгy та шдукцп ефективнocтi бюдеградацп Methyl Orange глибинними кyльтypами кcилoтpoфiв.

МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ

Об^ктами дocлiдження 6ули 81 штам 19 видiв кcилoтpoфiв з шлекци культур базидюмщетав кафедри фiзioлoгiï pocлин Дoнецькoгo нацioнальнoгo yнiвеpcитетy (Федoтов та ш., 2012). Серед дocлiджених штамiв, 62 належать дo пopядкy Agaricales: Agrocybe cylindracea (DC.) Maire - 167, 218, 960, Lentinula edodes (Berk.) Pegler - Le-2, Le-340, Le-4, Le-6, Le-7, Flammulina velutipes (Curtis) Singer - F-03, F-06, F-073, F-1, F-102, F-104, F-107, F-112, F-2, F-202, F-204, F-610, F-vv, F-10, F-11, F-1105, Fistulina hepatica (Schaeff.) With. - Fh-08, Fh-09, Fh-18, Schizophyllum commune Fr. - Sc-10 Sc-1102 Sc-1104, Pleurotus citrinopileatus Singer - P-citr, Pleurotus eryngii (DC.) Quél. - P-er, Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. - D-140, Hk-35, P-004, P-01, P-035, P-039, P-081, P-082, P-083, P-087, P-088, Р-089, P-91, P-94, Р-105, Р-107, Р-191, Р-203, Р-206, P-208, Р-209, Р-210, P-998, P-6v, Р-4к, Р-12к, Р-кл, НУ-35, Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quél. - АХ, MS-3; а 19 - дo пopядкy Polyporales: Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. - Gl-1, Gl-2, Gl-3, Gl-B-99, Gl-11, Irpex lacteus (Fr.) Fr. - IL-4K, IL-1, IL-1201, Fomes fomentarius (L.) Fr. - Ff-09, T-10, Ff-1201, Trametes hirsuta (Wulfen) Lloyd - Th-11, Trametes ochracea (Pers.) Gilb. & Ryvarden - To, Trametes trogii Berk. -Tt-11, Trichaptum biforme (Fr.) Ryvarden - Tb-11, Daedalea quercina (L.) Pers. - Dq-08,

S)

Grifola frondosa (Dicks.) Gray - Gf-01, Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill - Ls-08, Ls-09. Бiльшу частину штамiв (85%) було вид1лено в чисту культуру методом вилучення тканинних iзолятiв (Федотов та iH., 2012) з дикоростучих базидiом/ зiбраних в рiзних мiсцевостях м. Донецька й обласл. Також, у дослiдженнях використовували 5 штамiв з Колекцп культур шапинкових грибiв 1нституту ботанiки iM. М.Г. Холодного НАН Укра1ни (1ВК): A. cylindracea 167, 218, 960, L. edodes Le-340, F. velutipes F-610 та 7 штамiв - з комерцiйних органiзацiй ТОВ «УкрМщелш» та ТОВ «Бютехнолопя», м. Донецьк: L. edodes Le-2, Le-4, Le-6, Le-7, P. citrinopileatus Р-сitr/ P. eryngii P-er, P. ostreatus Hk-35.

З метою проведення дослiдженнЯ/ штами культивували глибинним методом на стандартному глюкозо-пептонному середовищi (ГПС) наступного складу (г/ л) (Дудка, 1982): пептон (Biofac, Датя) - 3,0; глюкоза - 10,0; КН2РО4 -0/6; К2НРО4 - 0,4; MgSÜ4 -7№Ü - 0,5; CaCl2 - 0,05; ZnSÜ4 -7№Ü - 0,001 (ва компоненти - квалiфiкацil чда та хч). Спiввiдношення C:N у ГПС дорiвнювало 13:1. Початковий рН ГПС складав 6,62±0,06. Культивування проводили при 25±1°С - температурному оптимумi росту быьшоста штамiв (Дудка и др., 1982). Процес глибинного культивування штамiв ксилотрофних базидюмщетав проводили в колбах емшстю 250 мл з 50 мл ГПС на лабораторнш качалщ АВУ -6С (Росiя) зi зворотно-поступальним рухом з режимом 45 хв. роботи з частотою 120 коливань за хв. та 15 хв. - штервал. 1нокулюмом слугував гомогешзований глибинний мiцелiй/ що вирощувався в аналогiчних умовах в колбах з шипоподiбними вiдбiйниками протягом 7 дiб. 1нокулюм вносили в кыькоси 10% за об'емом. Перед шокулящею асептично вiдбирали проби та визначали абсолютно суху бiомасу i вЦсутшсть контамшацп iнокулюму за допомогою свгглового мiкроскопу XS-5520 MICROmed (Китай). Термш культивування штамiв на основнiй стадй' становив 6 дiб/ але для трьох штамiв (G. frondosa Gf-01, L. sulphureus Ls-08 та Ls-09) його було подвоено через повыьну швидкiсть росту мiцелiю.

Наприкiнцi термiну культивування мiцелiй вiддiляли вiд культурально! рiдини за допомогою шдльно! капроново! тканини, отримуючи таким чином культуральний фiльтрат (КФ). Визначали абсолютно суху бшмасу (АСБ) мiцелiю ваговим методом. З метою визначення ефективносл окислювально! деструкцп речовин (ЕД) було обрано модельну сполуку - широко використовуваний барвник Methyl Orange, що взноситься до класу азобарвникiв. Визначену юльюсть КФ (дослЦ) чи живильного середовища (контроль) додавали до 0,001% розчину Methyl Orange в натрiй-ацетатному буферь Водневий показник реакцiйноí сумiшi становив 4,4 од. Проби шкубували при +40°С протягом 48 годин. Шсля цього встановлювали рН реакцiйноí сумiшi на рiвнi 3,1 од. за допомогою натрш-ацетатного буферу. Вимiрювали оптичну густину розчину при довжинi хвилi 506 нм.

60 Бюлопчний eicHHK ФЦр -fe

Ефективнiсть деструкцп розраховували за формулою:

E - E

ЕД = E-д-100%

Д EK

де Ek, Eg - оптична густина контрольно!" i дослГдно1 проби вiдповiдно.

Дослiди проводили у трикратнш повторностi. Отриманi експериментальнi даш обробляли з використанням загальноприйнятих методiв статистично! обробки результатiв бiологiчних експериментГв. РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

ДослГдження зi скринiнгу та iндукцii ефективностГ бiодеградацГi Methyl Orange глибинними культурами ксилотроФГв проводили за схемою (рис. 1).

Оптимiзацiя ГПС (1) за додатковими компонентами

Ж"

Л^но- Твiн-80 Мiнеральнi Сума

сульфонат (2) (3) елементи (4) додаткiв (5)

-т- n^Gip концентраци додаткових компонентiв

Л^носульфонат

Твш-80

Мшеральш елементи за Кiрком

Рис. 1. Схема проведення дослГдження зГ скритнгу та шдукцп ефективностi бюдеградацй' Methyl Orange глибинними культурами ксилотрофГв.

Першим етапом дослЦжень з бiодеградацГi ксенобштиюв була розробка легкого у виконанш i недорогого способу визначення ефективност окислювально1 деструкщ1 речовин. Цим вимогам вЦповЦають спектрофотометричнi методи. У зв'язку з цим, проводили вiдбiр модельно'1 сполуки - барвника, утилiзацiю яко1 можна було б встановити за знебарвленням розчишв через трансформацiю хромофорно'1 групи базидiомiцетами. Як результат, обрано найбьльш пiдходящий барвник Methyl Orange.

Наступним етапом проводили скринiнг штамiв - активних деструкторiв модельно1 сполуки. Ефектившсть окислювально1 деструкщ1 барвника Methyl Orange та накопичення АСБ 81 штаму 19 видiв базидiомiцетiв при глибинному ISSN 2225-5486 (Print), ISSN 2226-9010 (Online). Бiологiчний всникМДПУ. 2015. №3

культивуваннi на стандартному ГПС термiном 6-ть дiб представлено в табл. 1. Таблиця 1. Ефектившсть окислювально! деструкцп Methyl Orange та накопичення АСБ штамами базидiомiцетiв при глибинному культивуванш на стандартному ГПС

Вид Штам ЕД, % АСБ, г/ л Вид Штам ЕД, % АСБ, г/ л

167 0,24±0/11 3,12±0,08 P-087 0,11±0,09 2/45±0/15

A. aegerita 218 1,22±0/57 3/50±0/17 P-088 0/41±0/24 1/61±0/09

960 0,19±0/10 4/38±0/25 P-208 1/19±0/92 2/65±0/12

L.e.-2 2,36±1/20 0,67±0/04 P-6v 0/70±0/47 2/49±0/04

L.e.-340 0,31±0/11 1/01±0/05 P-91 0/23±0/13 1/31±0/10

L. edodes L.e.-4 1,26±0/86 0/81±0/08 P-94 0/69±0/40 2/19±0/04

L.e.-6 0,12±0,10 0/73±0/03 P-998 0/52±0/42 1/78±0/04

L.e.-7 0/98±0/52 0/91±0/08 НУ-35 0/26±0/15 1/39±0/10

F-03 0,47±0/34 1/52±0/20 Р-089 1/54±1/03 3,51±0/24

F-06 0,21±0/14 1/50±0/12 P. ostreatus Р-105 0,34±0/10 2/65±0/13

F-073 0/52±0/27 2,08±0/11 Р-107 0/33±0/21 3,21±0/15

F-1 0/40±0/33 2/43±0/21 Р-12к 0/69±0/41 1/63±0/10

F-102 1/10±0/62 3/52±0/12 Р-191 1/13±0/86 3,79±0/11

F-104 0/90±0/88 3/26±0/26 Р-203 0,17±0/07 2/53±0/16

F-107 0/28±0/15 3,04±0/11 Р-206 0/09±0/03 2/80±0/19

F. velutipes F-112 0/79±0/31 3/62±0/09 Р-209 0/33±0/12 1/41±0/06

F-2 1/11±0,73 1,74±0/12 Р-210 1,17±0/77 1/35±0/10

F-202 0/56±0/43 2/74±0/24 Р-4к 0/32±0/21 1/82±0/08

F-204 0/41±0/34 3/96±0/19 Р-кл 0/85±0/41 1/70±0/08

F-610 0/12±0/08 3/39±0/30 P. АХ 0,07±0/04 9/60±1/10

F-vv 1/31±0/86 1/05±0/08 pulmonarius MS-3 0/06±0/03 5/33±0/47

F-10 2/70±2/31 0/97±0/05 G.l.-1 0,18±0/10 1/29±0/07

F-11 0/64±0/41 3,13±0/14 G.l.-2 0/77±0/38 1,37±0,05

F-1105 2/35±1/35 2/58±0/16 G. lucidum G.l.-3 0/55±0/41 1/32±0/10

Fh-08 0,19±0/17 4/13±0/03 Gl-B- 99 G.l.-11 0,12±0/10 1/26±0/02

F. hepatica Fh-09 0/09±0/05 3,79±0/13 1,27±0,94 1,77±0/07

Fh-18 0/12±0/09 3/89±0/13 IL-4K 1/17±1,03 1/16±0/05

Sc-10 0/25±0/24 4/43±0/08 I. lacteus IL.-1 0/67±0/50 1,20±0/11

S. commune Sc-1102 0/47±0/42 3,94±0/11 IL-1201 1/26±1/13 1/81±0/08

Sc-1104 0/91±0/86 4,57±0/13 Ff-09 0/59±0/55 2/06±0/08

P.citrinopilea tus P-citr 2/07±1/63 1/36±0/12 F. fomentarius T-10 1/55±1/26 1/98±0/07

P. eryngii P-er 2,72±1/91 3/65±0/22 Ff-1201 0/88±0/51 1/95±0/09

62 Бюлопчний bíchhk фцр

Щ

Вид Штам ЕД, % АСБ, г/ л Вид Штам ЕД, % АСБ, г/ л

P. ostreatus

D-140 2,48±1,42 5,85±0,10 T. hirsuta Th-11 3,83±1,49 3,87±0,09

Hk-35 То- 3,07±2,30 2,94±0,07

1,74±1,13 5,45±0,34 T. ochracea

1201

P-004 0,83±0,48 1,93±0,13 T. trogii Tt-11 2,52±2,45 3,57±0,22

P-01 0,75±0,65 3,00±0,08 T. biforme Tb-11 0,64±0,55 2,01±0,15

P-035 0,98±0,62 4,36±0,36 D. quercina Dq-08 1,05±0,95 3,38±0,19

P-039 0,42±0,24 3,62±0,11 G. frondosa Gf-01 0,15±0,05 0,23±0,04

P-081 0,51±0,42 2,30±0,02 L.s.-08 0,08±0,04 0,02±0,00

P-082 0,62±0,37 2,12±0,14 L. sulphureus L.s.-09 0,08±0,05 0,11±0,01

P-083 0,36±0,26 2,46±0,03

Приркт АСБ досл1джених штам1в коливався в широких межах - в1д 0,08 до 9,60 г/л. Серед вид1в порядку Agaricales лидерами е види P. pulmonarius, S. commune, F. hepatica, P. eryngii, та A. cylindracea; а серед вид1в порядку Polyporales - T. trogii, D. quercina та T. hirsuta. Найменшу кыьюсть АСБ накопичили види L. edodes i P. citrinopileatus (Agaricales) та L. sulphureus i G. frondosa (Polyporales), що узгоджуеться з лггературними джерелами (Соломко и др., 2000).

З таблиц (табл. 1.) видно, що р1вень штенсивносл деструкцй' барвника Methyl Orange глибинними культурами базидюмщетав на вихЦному ГПС е досить низьким, а отже потребуе пошуку тдход1в до ii шдукцп.

Зпдно з результатами дослЦжень (Капич, 2011), выьнорадикальне окиснення лпшну та 1нших х1м1чно ст1йких сполук залежить в1д активацй процес1в перекисного окиснення лш1д1в (ПОЛ).

Внасл1док цього полшенасичеш жирн1 кислоти можуть окислюватись з утворенням перекисних радикал1в, що приймають участь в атац1 на таю сполуки. Тому для вЦбору штам1в для подальшо! розробки методу деструкцй' забруднювач1в використовували результати дослЦжень деструкцй' барвника Methyl Orange, а також дат попередшх досл1джень штенсивноста процеав ПОЛ в КФ (Федотов та ш, 2012).

Так, за цими результатами для подальших дослЦжень були обран1 штами ксилотроф1в: F. velutipes F-1105, P. eryngii P-er, T. hirsuta Th-11 та D. quercina Dq-08.

Наступним етапом дослГдження було встановлення додаткових компонент1в ГПС для щдукцй' ЕД в1д1браних штам1в. Модифшацп ГПС, кр1м зазначених компоненив м1стили л1гносульфонат, тв1н-80 та розчин мшеральних елемент1в за К1рком.

Виб1р додаткових компонент1в ГПС пояснюеться наступним. Для щдукцй" л1гнол1тичних фермент1в, наприклад, лаккази, можуть застосовуватися р1зноман1тн1 сполуки (Eggert et al., 1996). Серед них найбыьш доступними i дешевими е лпносульфонати - в1дходи деревопереробних тдприемств, ISSN 2225-5486 (Print), ISSN 2226-9010 (Online). Бiологiчний всникМДПУ. 2015. №3

продукти переробки б^льфггного лугу в процеа виробництва целюлози. Сульфованний лiгнiновий комплекс мае фенольну природу i е токсичним продуктом, що забруднюе оточуюче середовище. В дослiдженнi (Eggert et al., 1996) вказуеться, що додавання у поживне середовище лкносульфонату у юлькосл 1% може значно п1двисити актившсть лаккази.

Також вiдомо (Venkatadri, Irvine, 1990), що культури базидiомiцетiв при глибинному культивуванш мають низьку лкншазну активнiсть глибинних культур i багато дослЦниюв вказували на необхiднiсть додавання до живильного середовища детергентiв (Jager et al., 1985; Venkatadri, Irvine, 1990) та мшроелеменпв. Був показаний потужний i часто критичний вплив мшроелеменпв на вторинний метаболiзм рiзних прокарiот та еукарiот (Weinberg, 1977), причому баланс цих мшроелеменпв мае виршальне значення. Тому в базове середовище додавали розчин мшеральних елеменпв за Кiрком в кiлькостi 70 мл/ л (Kirk et al., 1986).

Поверхнево-активш речовини (ПАР) змшюють поверхневий натяг редких поживних середовищ i, таким чином, впливають на процеси живлення i розвитку культури, зокрема, через збыьшення водно'1 розчинносл i бiодоступностi органiчних сполук (Rosenberg et al., 1998; Tugrul, Cansunar, 2005).

В якост тако'1 ПАР використовували Твш-80

(полiоксiетиленсорбiтанмоноолеат) у юлькосл 0,1%.

Ефективнiсть окислювально'1 деструкцп Methyl Orange вщбраних штамiв, якi культивували глибинним методом на стандартному ГПС (1) та його модифшащях - iз додаванням 10 г/ л лкносульфонату (2); 1 г/ л Твш-80 (3); 70 мл/ л розчину мiкроелементiв Юрка (4); та цих компоненпв разом (5), представлена на рис. 2.

80 70 60 50 40 30 20 10 0

□ F-1105 DP-er IHTh-11 DDq-08

■L

п

fti

fSr

ri-

-i-l -i-l

1

2

3

4

5

Середовище

Рис. 2. Ефективнiсть деструкцп модельно'1 сполуки КФ деяких штамiв ксилотрофiв на модифiкованих середовищах.

За його даними, найвищi показники ЕД ycix штамiв зафiксовано на середовищi 5, що мктило Bei додатковi компоненти. Так, значення ЕД КФ штаму F. velutipes F-1105 на цьому середовишд у порiвняннi 3i стандартним ГПС быьше в 6,6; штаму D. quercina Dq-08 - в 7,4; штаму P. eryngii P-er - в 8,6; та найбыьше - штаму T. hirsuta Th-11 - майже в 18 разiв. Серед однокомпонентних модифшацш, найбыьшу iндyкцiю деградацп модельно'1 сполуки спричиняе лiгносyльфонат. Так, у штаму P. eryngii P-er значення ЕД збыьшилося в 3,6; штамiв F. velutipes F-1105 та D. quercina Dq-08 - в 5; та найбыьше - штаму T. hirsuta Th-11 - в 14,6 разiв.

Треба зазначити, що тд час вирощування культур на середовишд з лпносульфонатом, КФ поступово набував коричневого забарвлення. Найб1льше це було виражено у штаму P. eryngii P-er, значно менше - у штаму T. hirsuta Th-11 i ще менше - у штаму F. velutipes F-1105. Майже не змшювався колiр культурально'1 рйдини штаму D. quercina Dq-08.

Така кольорова реакщя мае назву реакцп Бавендамма (Bavendamm, 1928) i вказуе на синтез фенолоксидаз, як окислюють компоненти лпносульфонату. Це е основою розподйлення ксилотрофiв за типом гнилi деревини, що вони викликають. Отже, використання лпносульфонату в якостi шдуктора ферментiв ксилотрофiв, задiяниx у процесах бюдеградацп ксенобiотикiв е ефективним i дозволяе виршити додатковi задачi - yтилiзацiю цiеï речовини.

На другому мющ за величиною впливу на ЕД КФ дослЦжуваних штамiв знаходяться мiкроелементи iз найбiльшим ефектом на штам T. hirsuta Th-11 -майже у 10, та P. eryngii P-er - 4,2 рази. Найменшу шдукщю ЕД чинить окреме додавання до середовища Твш-80 - майже в 2 рази для штамiв P. eryngii P-er та T. hirsuta Th-11. Результати впливу модифшацш ГПС на накопичення АСБ в^браними штамами показують наступне.

Додавання лкносульфонату в наведенш концентраций не впливае на накопичення АСБ штамами i лише у штаму T. hirsuta Th-11 спостерпаеться незначне збыьшення приросту бюмаси. Додавання Твiн-80 вЦчутно впливае лише на рiст штаму F. velutipes F-1105, його АСБ на цьому середовищд порiвняно з контролем быьше в 1,5 рази.

Показники росту дослЦжуваних штамiв майже Центичш на середовищах з Твш-80 та з yсiма компонентами (середовище 5). На цьому середовишi зафшсоване значне зменшення АСБ штаму P. eryngii P-er порiвняно з середовищем з мiкроелементами (4), що може бути пов'язано з негативним впливом високо'1 концентраций лiгносyльфонатy, Твiн-80 чи ïx поеднанням в цьому середовищь Таким чином, для подальших дослЦжень було обране модифiковане ГПС з лкносульфонатом, Твiн-80 та розчином мшроелеменпв Кiрка.

Наступним етапом дослiджень був пiдбiр концентраций цих речовин в модифшованому середовишi. Показники ефективностi окислювально'1 ISSN 2225-5486 (Print), ISSN 2226-9010 (Online). Бiологiчний вкникМДПУ. 2015. №3

деструкцй модельно'1 сполуки КФ штамiв F. velutipes F-1105, P. eryngii P-er, T. hirsuta Th-11 та D. quercina Dq-08 на модифiкованому середовишд з концентрацieю лiгносульфонату вiд 0 до 14 г/ л наведено на рис. 3.

80 70 60 о 50 « 40

W

30 20 10 0

-, DF-1105 DP-er □ Th-11 □ Dq-08

tí

El

□

0,0 0,5 1,0 2,0 3,5 5,0 6,5 8,0 10,0 12,0 14,0

Л^носульфонат, г/ л

Рис. 3. Ефектившсть деструкцй' модельно'' сполуки КФ дослЦжуваних штамiв залежно вiд концентрацй лкносульфонату.

Дослiджуванi штами мають iндивiдуальнi реакцп змiни ЕД Methyl Orange в залежност вiд концентрацй' лiгносульфонату. Так, штам P. eryngii P-er мае чггкий максимум ЕД при концентрацй' лкносульфонату 5,0 г/л. Вiдхилення в1д цього значення в обох напрямках ведуть до зниження ЕД: без лкносульфонату та з його максимальним вмктом - в 2,7 та в 1,7 разiв вЦповЦно. Штами F. velutipes F-1105 та D. quercina Dq-08 мають схожу, але не таку виражену в обласи високих концентрацш лiгносульфонату залежнiсть. Оптимальний вмкт цiе'i речовини за рiвнем ЕД для штаму F-1105 становить близько 3,5 г/ л. На середовишд без лкносульфонату ЕД нижче майже в 4 рази, а з максимальним вмятом ще! речовини - в 1,5 рази. Оптимальний вмкт лкносульфонату за ЕД для штаму D. quercina Dq-08 - 6,5 г/ л, де реестрований повказник в 2,2 рази вищш за такий на середовишд без ще'1 речовини. ЕД КФ штаму T. hirsuta Th-11 тдвищуеться майже в 2 рази при концентрацй' лкносульфонату 5,0 г/ л i надалi залишаеться на цьому рiвнi.

Встановлено негативний вплив пЦвищення концентрацй' лкносульфонату в модифшованому ГПС на накопичення бшмаси (рис. 4). Бюмаса штамiв F-1105, P-er та Th-11, що викликають бiлу гниль деревини, значно знижуеться iз пiдвишенням вмкту лiгносульфонату. Низькi концентрацй' лiгносульфонату, навпаки, стимулюють рiст культур грибiв быо'1 гнилi. АСБ глибинно'' культури гриба буро'1 гнилi D. quercina Dq-08 знаходиться майже на одному рiвнi.

5,5 5,0 4,5 4,0

¿ 3,5

U

< 3,0 2,5 2,0 1,5

Рис. 4. Прирют АСБ дослЦжуваними штамами залежно вЦ концентрацй

лкносульфонату.

Виходячи з отриманих результатiв/ для подальших дослiджень були o6paHÍ наступш концентрацй' лiгносульфонату в модифiкованих ГПС: для штаму F. velutipes F-1105 - 3,5 г/ л, штаму P. eryngii P-er - 5,0 г/ л, штаму T. hirsuta Th-11 -5/0 г/ л i штаму D. quercina Dq-08 - 6,5 г/ л. Це дозволило збыьшити ЕД штамiв, порiвняно Í3 середовищем 5 без лкносульфонату, у 4,0; 2,7; 1,8 та 2,2 рази вЦповЦно; а порiвняно з середовищем 5 (з лкносульфонатом 10 г/ л) - у 1,4; 1,6; 0,0 та 1,2 рази вЦповЦно.

Наступним етапом дослЦжень був пiдбiр концентрацй' Твiн-80. Для цього дослЦжуваш штами культивували на модифшованому середовищi з оптимальною для кожного штаму концентращею лiгносульфонату та розчином мшеральних елементiв за Юрком у незмшнш кiлькостi в 70 мл/ л (рис. 5).

Як показали результати дослЦу, збыьшення вмiсту дано' ПАР в середовишд до концентрацй' 1,0 г/ л веде до вiрогiдного тдвищення ЕД усiх культур грибiв бiлоi' гнилi. Подальший рiст концентрацй' Твш-80 або не впливае на швидюсть деструкцп модельно'' сполуки (штами F-1105, Th-11), або веде до ii зниження (штам P. eryngii P-er). Штам Dq-08 гриба буро' гнилi вiрогiдно не змшюе рiвень ЕД в залежностi вЦ концентрацй' Твiн-80. Прирiст АСБ на середовищах з рiзною концентрацiею Твш-80 для усiх штамiв/ окрiм F. velutipes F-1105 залишаеться незмшним. У останнього штаму iз пiдвишенням вмкту Твiн-80 з 0 до 4 г/ л значення приросту АСБ збыьшуеться в 1,4 рази. Така вЦмшшсть може бути пояснена рiзними вимогами культур до поверхневого натягу рЦини, в якш розвиваеться культура; а Твш-80, являючи собою нейоногенну ПАР, безпосередньо впливае на поверхневий натяг культурально' рiдини. До того ж, рiзнi штами можуть мати рiзну здатнiсть до використання ISSN 2225-5486 (Print), ISSN 2226-9010 (Online). Бiологiчний всникМДПУ. 2015. №3

■fe

Ix |Т d ñ i □ F-1105 DP-er □ Th-11 □ Dq-08

1 ni 1 1 ii ñ

1 Е1 ií п ñ Я

f Б - Б Б Б Б Е \ t E fÍ E í i: ,3 p f á

0,0 0,5 1,0 2,0 3,5 5,0 6,5 8,0 10,0 12,0 14,0

Лпносульфонат, г/ л

Ц161 речовини в якост! джерела вуглецю.

80

70

60

о 50

^ 40 W

30 20 10 0

□ F-1105 DP-er □ Th-11 □ Dq-08

I

0,0

0,5 1,0 2,0

Твш-80, г/ л

4,0

Рис. 5. Ефектившсть деструкщ! модельно! сполуки КФ досл1джуваних штам1в

залежно в1д концентращ! Тв1н-80.

Отже, вм1ст 1 г/ л Твш-80 е найсприятлив1шим для бюдеградащ! Methyl Orange досл1джуваними культурами i використовувався в подальших дослЦженнях.

Результати дослiдження впливу мiнеральних речовин на окислювальну деструкцiю барвника Methyl Orange представлено на рис. 6. Для вах штамiв межi оптимально!" концентращ!' розчину мiнеральних елементiв Юрка для бюдеградащ! модельно! сполуки можна встановити в1д 70 до 350 мл/ л, з найвищими значеннями на 70 мл/ л - штами F-1105 та Р-ег i на 105 мл/ л -штами Th-11 та Dq-08. При його нижчому вмюта чи вЦсутносл, ЕД КФ штамiв знижуеться. При тдвищенш концентращ!' мiнеральних речовин вище наведеного iнтервалу/ спостерiгаеться поступове зниження реестрованого показника. Це може бути пов'язано з негативним впливом високо! концентращ'! деяких компонентiв розчину Юрка, зокрема, важких металiв на ферментативну активнiсть культур. Це припущення тдтверджують данi з накопичення АСБ культурами базидюмщепв при глибинному культивуваннi: для штамiв F-1105, Р-ег та Th-11 найвишд такi значення припадають на концентращю розчину К1рка в середовишд 70 мл/ л, а для штаму Dq-08 - вiд 105 до 140 мл/ л. Тобто для дослЦжуваних штамiв грибiв оптимальш концентращ!' розчину Кiрка для росту та бюдеградащ! модельно! сполуки майже ствпадають.

=5»

90

80

70

60

^ 50

tf 40 W

30 20 10 0

□ F-1105 DP-er □ Th-11 □ Dq-08

tL

tl

0 35 70 105 140 210

Мiнеральнi елементи Юрка, мл/ л

280

350

Рис. 6. Ефектившсть деструкцй модельно'1 сполуки КФ дослЦжуваних штамiв залежно вiд концентрацп мшеральних елементiв KipKa в середовищi.

Загалом, результати дослiдження дозволили розробити модифшацп ГПС, якi пiдвищують ефективнiсть окислювально'1 деструкцй модельно'1 сполуки в 9,3 (F. velutipes F-1105); 9,6 (D. quercina Dq-08); 13,3 (P. eryngii P-er) та 19,2 разiв (T. hirsuta Th-11). При цьому розроблеш середовища дозволяють пiдвищити накопичення АСБ дослЦними штамами в 1,2 (Dq-08); 1,3 (Th-11) та 1,5 разiв (F-1105 i P-er).

Таким чином, модифшовано метод визначення ефективноси окислювально'1 деструкцй' модельно'1 сполуки - барвника Methyl Orange. За цим показником проведено скриншг глибинних культур 81 штаму 19 видiв ксилотрофiв. Вiдiбрано найбiльш перспективнi штами - F. velutipes F-1105, P. eryngii P-er, T. hirsuta Th-11 i D. quercina Dq-08. Модифшовано склад стандартного ГПС для цих штамiв. З метою деградацп полютанпв дощльно культивувати штам F. velutipes F-1105 на модифшованому ГПС, яке додатково мютить, на 1 л: лкносульфонат - 3,5 г, Твiн-80 - 1,0 г, розчин мшеральних елеменпв Юрка - 70 мл; штам P. eryngii P-er - 5,0 г, 1,0 г, 70 мл; штам T. hirsuta Th-11 - 5,0 г, 1,0 г, 105 мл; та штам D. quercina Dq-08 - 6,5 г, 1,0 г, 105 мл, вЦповЦно. Це дозволить значно збыьшити ефектившсть окислювально'1 деструкцй' хiмiчно стшких сполук культуральним фыьтратом вщбраних штамiв базидюмщетав.

ПЕРЕЛ1К ВИКОРИСТАНО1 Л1ТЕРАТУРИ Bavendamm W. Uber das Vorkommen und den Nachweis von Oxydasen bei holzzerstorenden Pilzen / W. Bavendamm // Ztschr. Pflanzenkh. und Planzenschutz Bd. - 1928. - 38. - P. 257 - 276.

Eggert C. The Ligninolytic System of the White Rot Fungus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and Characterization of the Laccase / C. Eggert, U. Temp, K.L Eriksson.// Applied and Environmental Microbiology. - 1996. - 62 (4). - P. 1151 - 1158.

Hammel K.E. Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi / K.E. Hammel, A.N. Kapich, K.A.Jr. Jensen, Z.C. Ryan // Enzyme and Microbial Technology. - 2002. - 30. - Р. 445 - 453.

Jager A. Production of ligninases and degradation of lignin in agitated submerged cultures of Phanerochaete chrysosporium / A. Jager, S. Croan, K. Kirk // Applied and Environmental Microbiology. - 1985. - 50 (5). - P. 1274 - 1278.

Kirk K.T. Production of multiple ligninases by Phanerochaete chrysosporium, effect of selected growth conditions and the use of a mutant strain / K.T. Kirk, S. Croan, M. Tien, K.E. Murtagh, R.L. Farrell // Enzyme Microbiol Technol. - 1986. - 8. - P. 27 - 32. Rosenberg E. Rate-limiting steps in the microbial degradation of petroleum hydrocarbons / E. Rosenberg, S. Navon-Venezia, I. Zilber-Rosenberg, E.Z. Ron. - In: Soil and Aquifer Pollution. / Edited by Rubin, H. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 1998. - Р. 159 - 172.

Tugrul T. Detecting surfactant-producing microorganisms by the drop-collapse test / T. Tugrul, E. Cansunar // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2005. - 21. - Р. 851 - 853. Venkatadri R. Effect of agitation on ligninase activity and ligninase production by Phanerochaete chrysosporium / R. Venkatadri, R.L. Irvine // Applied and Environmental Microbiology. - 1990. - 56 (9). - P. 2684 - 2691.

Weinberg E.D. Mineral element control of microbial secondary metabolism / E.D. Weinberg / in Microorganisms and minerals. - New York: Marcel Dekker, Inc., 1977. - P. 289-316.

Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии / И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А. Элланская - К.: Наук. думка, 1982. - 550 с.

Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих базидиомицетов / А.Н. Капич // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты : сб. науч. тр. - 2011. -Т. 3. - С. 316-335.

Рабинович МЛ. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор) / М.Л. Рабинович, A.B. Болобова, Л.Г. Васильченко // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - 40, № 1. -С. 5-23.

Соломко Е.Ф. Pier окремих видiв лшарських макромщепв на поживних середовищах рiзного складу. / Е.Ф. Соломко, М.Л. Ломберг, Н.Ю. Митропольська, О.В. Чоловська // Укр. ботан. журн. - 2000. - 57, (2). - С. 119-126.

Федотов О.В. Вплив бензотрену на штенсившсть процеав перекисного окиснення лшщв штаму Pleurotus ostreatus Р-107 / О.В. Федотов, О.В. Чайка, О.Г. Метрусенко // Проблеми екологп та охорони природи техногенного регюну. -Донецьк, ДонНУ, 2012. - № 1 (12). - С. 252-257.

Федотов О.В. Колекщя культур шапинкових грибiв - основа мшолопчних дослЦжень та стратеги збереження бiорiзноманiття базидюмщепв /

70 Бюлопчний eicHHK

О.В. Федотов, О.В. Чайка, Т.Е. Волошко, А.К. Велигодська // Вкник Донецького

нацiонального ушверситету. - Донецьк: ДонНУ, 2012. - № 1. - С. 209 - 213.

REFERENCES

Bavendamm, W. (1928). Uber das Vorkommen und den Nachweis von Oxydasen bei holzzerstorenden Pilzen. Ztschr. Pflanzenkh. und Planzenschutz Bd. 38, 257276.

Dudka, I.A., Wasser, S.P., Elanskaya, I.A. (1982) Methods of experimental mycology. Naukova Dumka. 182-218

Eggert, C., Temp, U., Eriksson, K.L. (1996). The Ligninolytic System of the White Rot Fungus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and Characterization of the Laccase. Applied and Environmental Microbiology. 62 (4), 1151-1158.

Fedotov, O.V., Chaika, O.V., Metrusenko, O.G. (2012) The influence of benzopyrene intensity of lipid peroxidation Pleurotus ostreatus strains R-107. Problems of Ecology and Environment anthropogenic region, Donetsk. 1 (12), 252-257

Fedotov, O.V., Chaika, O.V., Voloshko, T.E., Veligodska, A.K. (2012). Culture Collection of mushrooms - the basis of mycological research and strategy for biodiversity conservation basidiomycetes. Bulletin of Donetsk National University. Series A, 1, 209-213.

Hammel, K.E., Kapich, A.N., Jensen, K.A.Jr., Ryan, Z.C. (2002). Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi. Enzyme and Microbial Technology. 30, 445-453.

Л

fa Biological Bolletin 71

S)

Jager, A., Croan, S., Kirk, K. (1985). Production of ligninases and degradation of lignin in agitated submerged cultures of Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology. 50 (5), 1274-1278.

Kapich, A.N. (2011). Pairing lipid peroxidation degradation of lignin from wood Basidiomycetes. Microbial biotechnology: fundamental and applied aspects. 3, 316335

Kirk, K.T., Croan, S., Tien, M., Murtagh, K.E., Farell, R.L. (1986). Production of multiple ligninases by Phanerochaete chrysosporium, effect of selected growth conditions and the use of a mutant strain. Enzyme Microbiol Technol. 8, 27-32.

Rabinovich, M.L., Bolobova, A.B., Vasil'chenko, L.G. (2004). The decomposition of natural aromatic structures and xenobiotics by mushrooms (review). Applied Biochemistry and Microbiology, 40(1), 5-23.

Rosenberg, E., Navon-Venezia, S., Zilber-Rosenberg, I., Ron, E.Z. (1998). Rate-limiting steps in the microbial degradation of petroleum hydrocarbons. In: Soil and Aquifer Pollution. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag.

Solomko, E.F., Lomberg, M.L. (2000) The growth of some medications macromycetes on nutrient media of different composition. Ukrainian Botanical Journal, 57 (2), 119-126

Tugrul, T., Cansunar, E. (2005). Detecting surfactant-producing microorganisms by the drop-collapse test. World J. Microbiol. Biotechnol. 21, 851-853.

72 Бюлопчний eicHHK ФЦр

-fi»

Venkatadri, R., Irvine, R.L. (1990). Effect of agitation on ligninase activity and

ligninase production by Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology. 56 (9), 2684-2691. Weinberg, E.D. (1977). Mineral element control of microbial secondary metabolism in microorganisms and minerals. New York: Marcel Dekker, Inc.

Поступила в редакцию 25.10.2015

Как цитировать:

Федотов, О.В. (2015). Десгрукщя ксенобштиюв з використанням культуральнош фыьтрату ксилотрофiв. Биологический вестник Мелитопольского государственного педагогического университета имени Богдана Хмельницкого, 5 (3), 55-72. http://dx.doi.org/10.7905/bbmspu.v5i3.986

© Федотов, 2015

Users are permitted to copy, use, distribute, transmit, and display the work publicly and to make and distribute derivative works, in any digital medium for any responsible purpose, subject to proper attribution of authorship.

MH^H

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 3.0 License