CC BY
19
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2019 БИОЛОГИЯ Вып. 4
УДК 579.87: 579.222.2: 631.46 DOI: 10.17072/1994-9952-2019-4-412-416.
А. В. Назаров
Институт экологии и генетики микроорганизмов - филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН, Пермь, Россия Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия
ДЕСТРУКЦИЯ БЕНЗ( А )ПИРЕНА В ПОЧВЕ ШТАММОМ RHODOCOCCUS WRATISLAVIENSIS KT112-7, ВЫДЕЛЕННЫМ ИЗ ОТХОДОВ СОЛЕДОБЫВАЮЩЕГО ПРЕДПРИЯТИЯ
Оценена способность к деструкции бенз(а)пирена (БП) в почве Rhodococcus wratislaviensis KT112-7, выделеного из техногенно-минеральных образований предприятия БКРУ1 ПАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край). Для эксперимента была использована дерново-подзолистая почва, отобранная с территории биостанции (д. Ключи Добрянского р-на, Пермский край) и технозем с окраины г. Соликамска (Пермский край). Внесение бактерий в почву приводило к снижению концентрации в ней БП. В дерново-подзолистой почве концентрация БП снизилась в течение месяца на 26.1, в техноземе - на 45.4%. Добавление бензойной кислоты в дерново-подзолистую почву в дозе 100 мг/кг усиливало положительный эффект внесения бактерий. Полученные данные указывают на деструкцию БП в почве штаммом R. wratislaviensis KT112-7 в присутствии органических веществ, которые штамм использует в качестве субстрата. Полученные данные и штамм R. wratislaviensis KT112-7 могут быть применены при разработке новых биотехнологий очистки окружающей среды от БП.
Ключевые слова: бенз(а)пирен; Rhodococcus wratislaviensis KT112-7; деструкция; очистка почвы.
A. V. Nazarov
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch RAS, Perm, Russian Federation Perm State University, Perm, Russian Federation
BENZО(А)PYRENE DESTRUCTION IN SOIL BY THE Rhodococcus wratislaviensis KT112-7 STRAIN ISOLATED FROM WASTE PRODUCTS OF A SALT-MINING FACTORY
Estimated the ability to degradation of benzo(a)pyrene in soil bacterial strain Rhodococcus wratislaviensis KT112-7 isolated from man-caused mineral formations BKRU1 enterprises of PJSC "Uralkali" (Berezniki, Perm krai). For the experiment, we used sod-podzolic soil, taken from the territory of the biological station (Klyuchi village Dobriansky district, Perm Krai) and technosol from the outskirts Solikamsk (Perm Krai), to which benz (a) pyrene was added at a dose of 100 mg/kg. The introduction of bacteria into the soil led to a decrease in the concentration of benz(a)pyrene. In sod-podzolic soil concentration of benzo(a)pyrene decreased during the month by 26.1% in technosol by 45.4%. The addition of benzoic acid to sod-podzolic soil at a dose of 100 mg/kg enhanced this positive effect of the introduction of bacteria. These data indicate degradation of benzo(a)pyrene in soil strain of R. wratislaviensis KT112-7 in the presence of organic substances which strain is used as the substrate. The data obtained and the strain of R. wratislaviensis KT112-7 can be used in the development of new biotechnologies for environmental remediation from benzo(a)pyrene.
Key words: benz(a)pyrene; Rhodococcus wratislaviensis KT112-7; destruction; soil remediation.
Введение
Бенз(а)пирен (БП) является одним из наиболее токсичных представителей полициклических ароматических углеводородов. Он относится к веществам первого класса опасности [ГОСТ 17.4.1.02-83], обладает мутагенной и канцерогенной активностью, негативно влияет на иммунную
и репродуктивную системы человека [Busbee et al., 1984; Irwin et al., 1997]. Основное количество БП в биосфере образуется в процессах горения, образующийся БП попадает в атмосферу, из которой с осадками поступает в почву, БП также попадает в почву с загрязнением нефтью и нефтепродуктами [Фелленберг, 1997; Киреева и др., 2009]. Вследствие очень высокой устойчивости БП происходит его накопление в почве [Киреева и др., 2009]. В
© Назаров А. В., 2019
настоящее время существуют достаточно противоречивые сведения о разложении данного соединения в почве, кроме того, данные о бактериях-деструкторах БП очень немногочисленны.
Способность к деструкции БП обнаружена у бактерий Mycobacterium sp. [Schneider et al., 1996], Sphingomonas paucimobilis [Ye et al., 1996], Stenotrophomonas maltophilia [Juhasz, Stanley, Britz, 2000], Rhodanobacter sp. [Kanaly, Harayama, Watanabe, 2002], Rhizobium tropici [Yessicaa et al., 2013], Ochrobactrum sp. [Yirui et al., 2009].
Известно, что представители рода Rhodococcus могут разрушать широкий спектр ароматических соединений [Solyanikova et al., 2008]. Однако деструк-ционная активность родококков по отношению к БП в настоящее время изучена недостаточно.
Цель данной работы - оценка способности штамма Rhodococcus wratislaviensis Ch625 к деструкции БП в почве.
Материал и методы исследования
Штамм КТ112-7 был выделен из техногенно-минеральных образований предприятия БКРУ1 ПАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) и определен как Rhodococcus wratislaviensis [Егорова и др., 2013]. Ранее было установлено, что данный штамм является активным деструктором ароматических соединений (фенантрена, нафталина, бифенила, бензола, толуола, фенола, ортофта-левой и бензойной кислот) [Егорова и др., 2013].
Для эксперимента была использована дерново-подзолистая почва, отобранная с территории биостанции (д. Ключи Добрянского р-на, Пермский край) и технозем с окраины (г. Соликамск, Пермский край). Почву высушивали до воздушно-сухого состояния, просеивали через сито с диаметром отверстий 2 мм, вносили в нее в сухом виде БП в дозе 100 мг/кг и гомогенизировали полученную смесь растиранием в ступке. Приготовленную почву в количестве 100 г помещали в пластиковые контейнеры, закрывающиеся крышками размером 60^85x45 и увлажняли до 60% от ее полной влаго-емкости. Затем к загрязненной почве добавляли клетки штамма Rhodococcus wratislaviensis KT112-7, плотность клеток составляла 108 кл/г почвы. Для эксперимента бактерии выращивали на минеральной среде К1 следующего состава (г/л): K2HPO4 х 3H2O - 4.0; NaH2PO4 х 2H2O - 0.4; (NHO2SO4 -0.5; MgSO4 х 7H2O - 0.15; Ca(NOsb х 4H2O - 0.01; NaMoO4 х 2H2O - 0.18, FeSO4 х 7H2O - 1.98, дополненную 1 мл/л раствора микроэлементов, содержащего (г/л): ЭДТА - 2.50, ZnSO4 х 2H2O -10.95, FeSO4 х 7H2O - 5.0, MnSO4 х 2H2O - 1.54, CuSO4 х 5H2O - 0.39, Co(NOsb х 6H2O - 0.24, Na2B4Ov х 10H2O - 0.17; рН среды 7.3 [Зайцев, Карасевич, 1981], с добавлением 1 г/л бензойной кислоты.
В ходе эксперимента оценивали уменьшение концентрации БП, а также численность внесенных
бактерий.
Концентрацию БП и других углеводородов измеряли в хлороформенных экстрактах на хромато-масс-спектрометре Agilent 6890/5973N (Agilent, США), с кварцевой колонкой RESTEK RTx-5MS (Restek, США). В качестве газа-носителя использовали гелий, скорость потока составляла 1 мл/мин. Температура испарителя 280°С. Программирование подъема температуры осуществляли от 60 до 280°С со скоростью 10°С/мин. Анализ хро-матограмм проводили программой MSD ProductivityChemStation (Agilent, США).
Количественный учет микроорганизмов в почве проводили методом посева почвенной суспензии на агаризованную среду с последующим подсчетом колоний (колонии образующих единиц, КОЕ) [Методы почвенной..., 1991]. Для учета микроорганизмов использовали минеральную среду Раймонда: NH4NO3 - 2, MgSO4 х 7H2O - 0.2, KH2PO4 - 2, Na2HPO4 - 3, Na2COs - 0.1, CaCb х 6H2O - 0.01 [Raymond, 1961] с добавлением 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта. Для получения ага-ризованных сред вносили агар («Sigma», США) 15 г/л.
Результаты и их обсуждение
Внесение бактерий штамма R. wratislaviensis KT112-7 в почву положительно влияло на ее очистку от БП (рис 1, 2). При этом установлено, что в техноземе при инокуляции бактерий деструкция БП протекала быстрее, чем в дерново-подзолистой почве. Так, в техноземе концентрация БП снизилась через 1 месяц на 45.4%. В дерново-подзолистой почве содержание БП через 1 месяц уменьшилась на 26.1%, снижение концентрации БП на 43.7% было отмечено через 4 месяца. Данное отличие было связано с большим содержанием углеводородов в техноземе. Так, количество алканов в техноземе составляло 145 мг/кг, в дерново-подзолистой почве - 37 мг/кг.
120
III
1 месяц 2 месяца 4 месяца
почва с внесением бактерий ■ почва без внесения бактерий
Рис. 1. Влияние внесения штамма R. wratislaviensis KT112-7 в дерново-подзолистую почву на деструкцию БП
Известно, что БП не используется бактериями в качестве единственного источника углерода и энергии, поэтому для его биодеградации в среде
необходимо наличие косубстратов, например, нефти, нефтепродуктов, доступных для бактерий полициклических углеводородов, обеспечивающих рост и жизнедеятельность бактерий-деструкторов, а также соокисление (кометаболизм) БП [Бабошин, Головлева, 2012].
- 7
V 6
2 недели
2 месяца
4 месяца
численность бактерий Я, \\ratislaviensis КТ112-7 ■ общая численность гетеротрофных бактерий
Рис. 3. Численность бактерий в дерново-подзолистой почве после интродукции штамма R. wratislaviensis КТ112-7
Для оценки воздействия наличия косубстратов в почве на деструкцию БП штаммом R. wrati-
slaviensis КТ112-7 был проведен эксперимент с дополнительным добавлением бензойной кислоты в количестве 100 мг/кг. Для эксперимента использована дерново-подзолистая почва, отобранная с территории биостанции д. Ключи Добрянского р-на Пермского края.
Внесение бензойной кислоты приводило к увеличению биодеградации БП бактериями R. wrati-slaviensis КТ112-7, через 1 месяц после начала эксперимента концентрация БП снизилась здесь на 43.9%, через 2 месяца - 62.1% (рис. 4). При этом без внесения бактерий в почву бензойная кислота не оказывала положительного влияния на биодеградацию БП.
2 недели 1 месяц
почва с внесением бактер ни ■ почва без внесения бактерий
Рис. 2. Влияние внесения штамма R. wratislaviensis КТ112-7 в технозем на деструкцию БП
Так, ранее было выявлено снижение концентрации БП в 2 раза в течение 24 ч. в морской воде при добавлении водного экстракта из мазута, в то время как без добавления экстракта деструкция БП не была обнаружена в течение 48 ч. [УегеЛиегеп, 1983].
Обнаружено, что при внесении бактерий в дерново-подзолистую почву через 2 и 4 месяца численность R. wratislaviensis КТ112-7 стабилизируется на уровне 8.0*Ш6 - 9.5*107 кл/г (рис. 3). Однако с течением времени отмечается снижение доли внесенных бактерий рода Rhodococcus в общей численности почвенных бактерий в течение проведения эксперимента. Если через 2 недели опыта доля бактерий рода Rhodococcus в общей численности почвенных гетеротрофных бактерий составляла 100%, через 2 месяца -84%, через 4 месяцев - 29%.
и 9
120
£
i 100
с
и - 80 -
§
-F 60
=
40 -
X
20
1 месяц
2 месяца
почва с внесением бактерии ■ почва без внесения бактерий
Рис. 4. Влияние добавления бензойной кислоты в дерново-подзолистую почву на деструкцию БП
Ранее соокисление БП бактериями было обнаружено в культуральных средах в присутствии дизельного топлива [Kanaly et al., 2000], флюоранте-на, нафталина [Ye et al., 1996], пирена [Ye et al., 1996; Boonchan, Britz, Stanley, 2000], фенантрена [Aitken et al., 1998], дрожжевого экстракта, пептона, глюкозы, крахмала [Ye et al., 1996; Schneider et al., 1996].
Заключение
Таким образом, полученные результаты указывают на способность штамма Rhodococcus wratisla-viensis KT112-7 к деструкции БП в почве в присутствии органических веществ, которые штамм может использовать в качестве субстрата. Данный штамм может быть применен для разработки биотехнологий очистки окружающей среды от БП.
Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: 01201353247.
Библиографический список
Бабошин М.А., Головлева Л.А. Деградация полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) аэробными бактериями и ее кинетические аспекты // Микробиология. 2012. Т. 81, №
6. С. 695-706.
ГОСТ 17.4.1.02-83. Охрана природы (ССОП). Почвы. Классификация химических веществ для контроля загрязнения. М.: Стандартинформ, 2008. 4 с.
Егорова Д. О. и др. Деструкция ароматических углеводородов штаммом Rhodococcus wratislaviensis KT112-7, выделенным из отходов соледобывающего предприятия // Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49, № 3. С. 267-278.
Зайцев Г.М., Карасевич Ю.Н. Подготовительный метаболизм 4-хлорбензойной кислоты у Arthrobacter globiformis // Микробиология. 1981. T. 50. C. 423-428.
Киреева Н.А. и др. Накопление бенз(а)пирена в системе «почва-растение» при загрязнении нефтью и внесении активного ила // Вестник Оренбургского государственного университета. 2009. № 6. С. 579-581.
Методы почвенной микробиологии и биохимии: учеб. пособие / под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. 304 с.
Фелленберг Г. Загрязнения природной среды: Введение в экологическую химию. М.: Мир, 1997. 232 с.
Aitken M.D. et al. Characteristics of phenanthrene-degrading bacteria isolated from soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons // Canadian Journal of Microbiology. 1998. Vol. 44. P. 743-752.
Boonchan S., Britz M.L., Stanley G.A. Degradation and mineralization of high molecular weight pol-ycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal bacterial cocultures // Applied and Environmental Microbiology. 2000. Vol. 66. P. 1007-1019.
Busbee D.L. et al. Benzo[a]pyrene uptake by lymph: a possible transport mode for immunosuppressive chemicals // Journal of Toxicology and Environmental Health. 1984. Vol. 13. P. 43-51.
Irwin R.J. et al. Environmental Contaminants Encyclopedia: Benzo(a)pyrene entry. National Park Service, 1997. 73 p.
Juhasz A.L., Stanley G.A., Britz M.L. Microbial degradation and detoxification of high molecular weight poly-aromatic hydrocarbons by Stenotro-phomonas maltophilia strain VUN 10,003 // Letters in Applied Microbiology. 2000. Vol. 30. P. 396-401.
Kanaly R.A. et al. Rapid mineralization of ben-zo[a]pyrene by a microbial consortium growing on diesel fuel // Applied and Environmental Microbiology. 2000. Vol. 66. P. 4205-4211.
Kanaly R.A., Harayama S., Watanabe K. Rhodano-bacter sp. Strain BPC-1 in a benzo[a]pyrene-mineralizing bacterial consortium // Applied and Environmental Microbiology. 2002. Vol. 68. P. 5826-5833.
Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Develoments in Industrial Microbiology. 1961. Vol. 2, № 1. P. 23-32.
Schneider J. et al. Degradation of pyrene, benz[a]anthracene, and benzo[a]pyrene by Myco-
bacterium sp. Strain RJGII-135, isolated from a former coal gasification site // Applied and Environmental Microbiology. 1996. Vol. 62. P. 13-19.
Solyanikova I.P. et al. Variability of Enzyme System of Nocardioform Bacteria as a Basis of their Metabolic Activity // Journal of Environmental Science and Health, Part B. 2008. Vol. 43, № 3. P. 241-252.
Verschueren K. Handbook of environmental data on organic chemicals. New York: Van Nostrand Reinhold Co., 1983. 364 p.
Ye B. et al. Degradation of polynuclear aromatic hydrocarbons by Sphingomonas paucimobilis // Environmental Science and Technology. 1996. Vol. 30. P. 136-142.
Yessicaa G.P. et al. Tolerance, growth and degradation of phenanthrene and benzo[a]pyrene by Rhi-zobium tropici CIAT 899 in liquid culture medium // Applied Soil Ecology. 2013. Vol. 63. P. 105-111.
Yirui W. et al. Isolation of marine benzo[a] pyrene-degrading Ochrobactrum sp. BAP5 and proteins characterization // Journal of Environmental Sciences. 2009. Vol. 21. P. 1446-1451.
References
Aitken M.D., Stringfellow W.T., Nagel R.D., Ka-zunga C., Chen S.-H. Characteristics of phenan-threne-degrading bacteria isolated from soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons.
Canadian Journal of Microbiology. V. 44 (1998): pp. 743-752.
Baboshin M.A., Golovleva L.A. Aerobic bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and its kinetic aspects. Microbiology. V. 81 (2012): pp. 639-650.
Boonchan S., Britz M.L., Stanley G.A. Degradation and mineralization of high molecular weight pol-ycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal bacterial cocultures. Applied and Environmental Microbiology. V. 66 (2000): pp. 1007-1019.
Busbee D.L., Joe C.O., Rankin P.W., Ziprin R.L., Wilson R.D. Benzo[a]pyrene uptake by lymph: a possible transport mode for immunosuppressive chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health. V. 13 (1984): pp. 43-51.
Egorova D.O., Korsakova E.S., Demakov V.A., Plotnikova E.G. Degradation of aromatic hydrocarbons by the Rhodococcus wratislaviensis KT112-7 isolated from waste products of a salt-mining plant. Applied Biochemistry and Microbiology. V. 49 (2013): pp. 244-255.
Fellenberg G. Zagrjaznenija prirodnoj sredy: Vvede-nie v ekologiceskuju chimiju [Environmental Pollution: An Introduction to Environmental Chemistry]. Moscow, Mir Publ., 1997. 232 p. (In Russ.).
GOST 17.4.1.02-83. Ochranaprirody (SSOP). Pocvy. Klassifikacija chimiceskich vescestv dlja kontrolja zagrjaznenija [Nature protection. Soils. Classification of chemicals for pollution control]. Moscow, Standartinform Publ., 2008. 4 p. (In Russ.).
Irwin R.J., Van Mouwerik M., Stevens L., Seese
M.D., Basham W. Environmental Contaminants Encyclopedia: Benzo(a)pyrene entry. National Park Service, 1997. 73 p.
Juhasz A.L., Stanley G.A., Britz M.L. Microbial degradation and detoxification of high molecular weight poly-aromatic hydrocarbons by Steno-trophomonas maltophilia strain VUN 10,003. Letters in Applied Microbiology. V. 30 (2000): pp. 396-401.
Kanaly R.A., Bartha R., Watanabe K., Harayama S. Rapid mineralization of benzo[a]pyrene by a mi-crobial consortium growing on diesel fuel. Applied and Environmental Microbiology. V. 66 (2000): pp. 4205-4211.
Kanaly R.A., Harayama S., Watanabe K. Rhodano-bacter sp. Strain BPC-1 in a benzo[a]pyrene-mineralizing bacterial consortium. Applied and Environmental Microbiology. V. 68 (2002): pp. 5826-5833.
Kireeva N.A., Novoselova E.I., Erokhina N.I., Grigo-riadi A.S. [The accumulation of benzo(a)pyrene in the soil-plant system during oil pollution and the introduction of activated sludge]. Vestnik Oren-burgskogo gosudarstvennogo universiteta. N 6 (2009): pp. 579-581. (In Russ.).
Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons. Develoments in Industrial Microbiology. V. 2, N 1 (1961): pp. 23-32.
Schneider J., Grosser R., Jayasimhulu K., Xue W., Warshawsky D. Degradation of pyrene, benz[a]anthracene, and benzo[a]pyrene by Mycobacterium sp. Strain RJGII-135, isolated from a former coal gasification site. Applied and Environmental Microbiology. V. 62 (1996): pp. 13-19.
Solyanikova I.P., Travkin V.M., Plotnikova E.G., Rybkina D.O., Golovleva L.A. Variability of En-
zyme System of Nocardioform Bacteria as a Basis of their Metabolic Activity. Journal of Environmental Science and Health, Part B. V. 43, N 3 (2008): pp. 241-252.
Verschueren K. Handbook of environmental data on organic chemicals. New York, Van Nostrand Reinhold Co., 1983. 364 p.
Ye B., Siddiqi M.A., Maccubbin A.E., Kumar S., Sikka H.C. Degradation of polynuclear aromatic hydrocarbons by Sphingomonas paucimobilis. Environmental Science and Technology. V. 30 (1996): pp. 136-142.
Yessicaa G.P., Alejandroa A., Ronalda F.C., Joséa A.J., Esperanzab M.R., Martínez-Romero Esperanza Jesús Samuel C.S., MaRemedios M.L., Ormeno-Orrillo E. Tolerance, growth and degradation of phenanthrene and benzo[a]pyrene by Rhizobium tropici CIAT 899 in liquid culture medium. Applied Soil Ecology. V. 63 (2013): pp. 105-111.
Yirui W., Tengteng H., Zhong M., Zhang Y., Enmin L., Huang T., Zhong H.U. Isolation of marine benzo[a] pyrene- degrading Ochrobactrum sp. BAP5 and proteins characterization. Journal of Environmental Sciences. V. 21 (2009): pp. 14461451.
Zaitsev G.M., Karasevich Yu.N. [Preparatory metabolism of 4-chlorobenzoic acid in Arthrobacter glo-biformis]. Mikrobiologija. V. 50 (1981): pp. 423428. (In Russ.).
Zvyagintsev D.G., ed. Metody pochvennoy mikrobiologii i biokhimii [Methods of soil microbiology and biochemistry]. Moscow, MGU Publ., 1991. 303 p. (In Russ.).
Поступила в редакцию 30.09.2019
Об авторе
Назаров Алексей Владимирович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН - филиал ПФИЦ УрО РАН ORCID: 0000-0003-4753-4061 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; nazarov@iegm.ru; (342)2808431
доцент кафедры ботаники и генетики растений ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
About the author
Nazarov Alexey Vladimirovich, candidate of biology, senior researcher of laboratory of molecular microbiology and biotechnology Institute of Ecology and Genetics of Microorganism UB RAS. ORCID: 0000-0003-4753-4061 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; nazarov@iegm.ru; (342)2808431
associate professor of Department of botany and
plant genetics
Perm State University.
15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
Информация для цитирования:
Назаров А.В. Деструкция бенз(а)пирена в почве штаммом Rhodococcus wratislaviensis KT112-7, выделенным из отходов соледобывающего предприятия // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2019. Вып. 4. С. 412-416. DOI: 10.17072/1994-9952-2019-4-412-416.
Nazarov A.V. [Вешо(а)ругепе destruction in soil by the Rhodococcus wratislaviensis KT112-7 strain isolated from waste products of a salt-mining factory]. Vestnik Permskogo universiteta. Biologija. Iss. 4 (2019): pp. 412-416. (In Russ.). DOI: 10.17072/1994-9952-2019-4-412-416.
