CC BY
116
ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФЕДРИНА В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ
© Кормишин В.А.*, Воронин А.В., Шаталаев И.Ф.
Самарский государственный медицинский университет, г. Самара Ульяновское областное бюро судебно-медицинской экспертизы, г. Ульяновск
В данной статье приведена методика денситометрического анализа и оптимизация предварительного исследования в химико-токсикологическом анализе эфедрина. Установлен предел обнаружения эфедрина методом тонкослойной хроматографии с применением денситометрии - 1 мкг в пробе.
Широкое применение тонкослойной хроматографии (ТСХ) в судебно-химической экспертизе связано с высокой производительностью, простотой, достаточной специфичностью. Денситометрия обеспечивает ТСХ возможность количественного определения анализируемых веществ и документирования результатов. Высокая стоимость специализированного аналитического оборудования, в частности сканирующих денситометров и программного обеспечения, большинству лабораторий экспертных учреждений не позволяет использовать в полном объеме возможности ТСХ [2, с. 97].
Цель настоящей работы - определение аналитических характеристик и возможностей количественного определения методики судебно-химиче-ского исследования биологического материала на эфедрин методом ТСХ с применением программы «ТСХ-менеджер».
Материалы и методы. В данной работе были использованы методы: жидкость-жидкостной экстракции, тонкослойной хроматографии, денсито-метрии (с использованием компьютерной программы для обработки изображений «ТСХ-менеджер»), регрессионный и дисперсионный статистический анализы. Были использованы следующие материалы: стандартный раствор эфедрина, модельные пробы мочи, содержащие определенные концентрации препарата, образцы мочи не содержащие психотропных веществ, экспертные образцы мочи, пластины для ТСХ «Сорбфил ПТСХ-П-А», системы растворителей для ТСХ.
Результаты и их обсуждение. Для исследования была выбрана методика анализа эфедрина методом ТСХ, используемая в практике судебно-химического отделения Ульяновского областного бюро судебно-медицинской экспертизы. Условия хроматографического анализа: пластинки «Сорб-фил ПТСХ-П-А», хроматографическая система - а) этилацетат - метанол -
* Аспирант кафедры Химии Самарского государственного медицинского университета; врач -судебно-медицинский эксперт Судебно-химического отделения Ульяновского областного бюро судебно-медицинской экспертизы.
25 % раствор аммиака (17 : 2 : 1) [1, с. 25], б) метанол - 25% раствор аммиака (100 : 1,5) [3, с. 67]; объем наносимой пробы - 100 мкл; проявление -обработка реактивом драгендорфа [5, с. 654] для верапамила и 0.5 % раствором нингидрина в ацетоне с последующим нагревом в токе воздуха при 80 0С в течении 15 минут для эфедрина [4, с. 340].
Основной проблемой ТСХ-анализа эфедрина с визуальной регистрацией является невозможность сохранения результатов - «пятна» (зоны на хро-матограмме, соответствующей эфедрину) после проявления теряют интенсивность окраски в течение 15-20 мин; и как следствие невозможность выполнения повторных измерений величины Rf и оценки количественного параметра - площади «пятна». Кроме того, фоновая составляющая хромато-граммы выступает в роли значимого фактора, способствующего повышению величины предела обнаружения эфедрина, т.е. снижению чувствительности анализа.
Пластинки после хроматографирования, проявления и высушивания сканировали на планшетном сканере или фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата, полученные файлы формата jpeg обрабатывали с помощью компьютерной программы для обработки изображений «ТСХ-ме-неджер», версия 3.12 (разработчик Плахотний Игорь Николаевич). Таким образом, сама хроматографическая пластинки утрачивала значение носителя аналитической информации, ее замещал электронный образ.
Для приготовления растворов стандартных образцов использовали ме-танольный раствор эфедрина концентрации 1,0 мг/мл (фирма «ABBOTT»). Модельные растворы мочи готовили путем добавления расчетного количества вышеуказанного раствора в образцы мочи, не содержащие наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ.
При исследовании растворов стандартных образцов эфедрина в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл проводили по 10 параллельных определений. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Аналитические характеристики методики определения эфедрина методом тонкослойной хроматографии
Хроматографическая система Эффективность растровых манипуляций Предел обнаружения, мкг Величина Rf
этилацетат-метанол-25 % раствор аммиака (17 : 2 : 1) + 1,0 0,21 ± 0,05
метанол-25 % раствор аммиака (100 : 1,5) ++ 1,0 0,36 ± 0,03
Уменьшение величины предела обнаружения вносят растровые манипуляции с электронным образом хроматограммы - изменение резкости, интенсивности изображения, изменение параметров яркости и контрастности, возможность просмотра хроматограммы в негативе. Указанные манипуля-
Фармацевтические науки
209
ции позволяют сделать почти незаметное для человеческого глаза «пятно» анализируемого вещества четко детектируемым. На основании полученных результатов окно поиска Rf для эфедрина было задано на уровне 0,1.
Градуировочная зависимость «площадь пятна (У) - количество эфедрина, мкг (X)», построенная в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл, описывается уравнением полиномиальной регрессии (второй степени). Однако для установления данной зависимости необходимо использовать более трех растворов стандартного образца вещества различных концентраций (калибраторов), что в условиях повседневной аналитической практики приведет к снижению производительности анализа. Для упрощения задачи нами было предложено применение линейной регрессии, при этом количество калибраторов было уменьшено до двух. Вышеуказанные зависимости были определены для вариантов анализа с применением в качестве источника электронного образа хроматограммы планшетного сканера и цифрового фотоаппарата (табл. 2).
Таблица 2
Градировочные характеристики количественного денситометрического определения эфедрина
Источник электронного образа Полиномиальная регрессия Линейная регрессия
Сканер Г = 0,0078X2 + 73,92-Х + 274,37 Г = 76,90-Х - 46,28
Фотоаппарат Г = 0,025X2 + 66,46-Х - 569,67 Г = 61,41-Х + 477,24
Результаты контроля правильности методики определения фенилалки-ламинов с применением контрольных растворов данных веществ (приготовленных независимо от калибраторов) представлены в табл. 3.
Таблица 3
Результаты контроля правильности количественного денситометрического определения эфедрина
Калибраторы, мкг/мл Контрольный раствор, мкг/мл Относительная ошибка определения среднего,%
фотоаппарат сканер
250,0; 100,0 10,0* 35 7,8
100,0; 10,0* 250,0 13 3,1
250,0; 10,0* 100,0 14 3,03
Примечание: * - концентрация 10,0 мкг/мл при объеме, наносимой на пластинку пробы 100 мкл соответствует пределу обнаружения.
Относительная ошибка определения среднего значения содержания эфедрина в пробе в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл не превышает соответственно 35 % при использовании для получения электронного образа хроматограммы цифрового фотоаппарата и 7,8 % - в случае сканирования хроматографических пластинок, последний вариант является наиболее предпочтительным. Наименьшая величина ошибки достигается при концентрации препаратов 100 мкг/мл.
Параллельно проводили измерения с модельными образцами мочи. К моче не содержащей наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ добавляли рассчитанное количество стандартного раствора препарата. К моче добавляли 25 % раствор аммиака до рН 10-11, затем добавляли равный объём смеси хлороформ - н-бутанол (9 : 1) [3, с. 88] встряхивали втечении 15 минут, органическую фазу сливали, к водной части добавляли равный объём органической фазы процедуру повторяли. Водный раствор отбрасывали, органическую фазу упаривали в токе воздуха при комнатной температуре. Сухой остаток растворяли в 100мкл хлороформа и наносили на ТСХ пластину хроматографировали с последующей денсито-метрией. Параллельно ставили контрольный опыт с «холостой пробой».
Процент выхода эфедрина по данной методике составил 80 %.
* * *
Таким образом, денситометрия электронных образов хроматограмм является современным, экспрессным и объективным вариантом анализа в тонкослойной хроматографии, значительно расширяющим возможности этого классического метода.
Список литературы:
1. Еремин С.К. Анализ наркотических средств / С.К. Еремин, Б.Н. Изотов, Н.В. Веселовская; под ред. Б.Н. Изотова. - М.: Мысль, 1993. - 270 с.
2. Симонов Е.А. Наркотики: методы анализа на коже, в ее придатках и выделениях / Е.А. Симонов, Б.Н. Изотов, А.В. Фесенко. - М.: Анахарсис, 2000. - 130 с.
3. Бабаханян Р.В., Бушуев Е.С., Варданян Ш.А., Афанасьев В.В. Наркотические средства, психотропные и сильнодействующие вещества - СПб.: Реноме, 2008. - 276 с.
4. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие / Под. ред. проф. Н.И. Калетиной. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 1016 с.: ил.
5. CLARKE'S Isolation and identification of drugs in pharmaceutical body fluids, and post-mortem material. - London: The pharmaceutical press, 1986.
