CC BY
41
УДК 340.67:615.214.2.099.074:543.544
ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭФЕДРИНА И ВЕРАПАМИЛА В СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОЙ
ЭКСПЕРТИЗЕ
© 2013 В.А. Кормишин,1 А.В. Воронин, И.Ф. Шаталаев2
Определены аналитические характеристики методики анализа эфедрина и верапамила методом тонкослойной хроматографии с применением денситометрии. Пределы обнаружения эфедрина и верапамила составили 10,0 мкг/мл. Показана возможность количественного определения эфедрина и верапамила в модельных растворах в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл.
Ключевые слова: эфедрин, верапамил, денситометрия, тонкослойная хроматография.
Введение
Широкое применение тонкослойной хроматографии (ТСХ) в судебно-химиче-ской экспертизе связано с высокой производительностью, простотой, достаточной специфичностью. Денситометрия обеспечивает ТСХ возможность количественного определения анализируемых веществ и документирования результатов. Высокая стоимость специализированного аналитического оборудования, в частности сканирующих денситометров и программного обеспечения, большинству лабораторий экспертных учреждений не позволяет использовать в полном объеме возможности ТСХ [1]. В данной работе использовалось более доступное оборудование: планшетный сканер и цифровая фотокамера для получения изображения в цифровом формате и компьютерная программа для денситометрии "ТСХ-менеджер" (версия 3,12, разработчик И.Н. Плахотний, г. Днепропетровск). Принцип обработки графических файлов данной программой аналогичен работе двухлучевого денситометра [2].
Цель настоящей работы — определение аналитических характеристик и возможностей количественного определения эфедрина и верапамила в биологических жидкостях методом ТСХ с применением компьютерной денситометрии при су-дебно-химических исследованиях.
1 Кормишин Василий Алексеевич (kormishinva@inbox.ru), кафедра химии фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета, 443099, Российская Федерация, г. Самара, ул. Чапаевская, 89; врач-судмедэксперт судебно-химического отделения Ульяновского областного бюро судебно-медицинской экспертизы, 432064, Российская Федерация, г. Ульяновск, пр. Врача Сурова, 4.
2 Воронин Александр Васильевич (dimmu2000amail.ru), Шаталаев Иван Федорович (cyric@proezd.net), кафедра химии фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета, 443099, Российская Федерация, г. Самара, ул. Чапаевская, 89.
Материалы и методы исследования
Материалы исследования: стандартные образцы эфедрина и верапамила (раствор эфедрина в метаноле концентрации 1,0 мг/мл (производитель фирма "ABBOTT"), раствор верапамила в метаноле концентрации 1,0 мг/мл (производитель "Киевмедпрепарат")), модельные растворы мочи, содержащие определенные концентрации эфедрина и верапамила.
Модельные растворы эфедрина и верапамила в метаноле готовили путем разведения вышеуказанных стандартных образцов метанолом квалификации "ХЧ" с погрешностью 3 %. Модельные растворы мочи готовили путем добавления расчетного количества стандартных образцов к образцам мочи, не содержащим эфедрин, верапамил и другие наркотические средства, психотропные вещества с погрешностью 3 %.
В работе были использованы методы тонкослойной хроматографии, денсито-метрии (с использованием компьютерной программы для обработки изображений "ТСХ-менеджер"), регрессионный статистический анализ.
Условия хроматографического анализа: пластины для ТСХ "Сорбфил ПТСХ-П-А", системы растворителей для ТСХ — этилацетат-метанол — 25 % раствор аммиака (17 : 2 : 1) [3]; метанол — 25 % раствор аммиака (100 : 1,5) [4]; элюирование в двух системах растворителей с различным Rf значительно снижает вероятность получения ложноположительного результата. Пробу объемом 100 мкл наносили многократно микрошприцем в точку диаметром 5 мм, подсушивая пластинку феном. Погрешность дозирования микрошприцем составляет 1 %. Проявление — обработка реактивом Драгендорфа для верапамила [3], обработка 0,5 % раствором нингидрина в ацетоне с последующим нагреванием в токе воздуха при 80 °C в течение 15 мин для эфедрина [5].
Пробоподготовку модельных проб мочи осуществляли методом жидкость-жидкостной экстракции: к 2 мл мочи добавляли 25 % раствор аммиака до рН 10-11, затем проводили экстракцию 5 мл смеси хлороформ — н-бутанол (9 : 1) в течение 5 мин, операцию повторяли дважды [3; 6]. Водный раствор отбрасывали, органическую фазу упаривали в токе воздуха при комнатной температуре. Сухой остаток растворяли в 0,5 мл хлороформа. 100 мкл полученного раствора наносили на линию старта хроматографической пластины, хроматографировали и денсито-метрировали.
Результаты и их обсуждение
Для исследования была выбрана методика анализа эфедрина и верапамила методом ТСХ, используемая в практике судебно-химического отделения Ульяновского областного бюро судебно-медицинской экспертизы [7].
Основной проблемой ТСХ-анализа эфедрина и верапамила с визуальной регистрацией является невозможность сохранения результатов — "пятна" (зоны на хроматограмме, соответствующие веществам) после проявления теряют интенсивность окраски в течение 15-20 мин, и, как следствие, наблюдается невозможность выполнения повторных измерений величины Rf и оценки количественного параметра — площади "пятна". Кроме того, фоновая составляющая хроматограммы выступает в роли значимого фактора, способствующего повышению величины предела обнаружения эфедрина и верапамила, т. е. снижению чувствительности анализа.
Пластинки после хроматографирования, проявления и высушивания сканировали на планшетном сканере или фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата, полученные файлы формата jpeg обрабатывали с помощью программы "ТСХ-менеджер". Таким образом, сама хроматографическая пластинка утрачивала значение носителя аналитической информации, ее замещал электронный образ.
При исследовании модельных растворов аналитов в метаноле в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл проводили по 10 параллельных определений. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Аналитические характеристики методики определения эфедрина и верапамила методом тонкослойной хроматографии
Аналит Эффективность растровых манипуляций Предел обнаружения, мкг / мл Величина М
этилацетат-метанол-25 % раствор аммиака (17 : 2 : 1) метанол-25 % раствор аммиака (100 : 1,5)
Эфедрин + 10,0 0,21 ±0,05 0,36 ±0,03
Верапамил ++ 10,0 0,73 ±0,02 0,75 ±0,03
Примечание. "+" — просмотр изображения в негативе; "Н—Ь" — просмотр изображения в негативе с увеличением резкости изображения
На основании вышеуказанных результатов интервал поиска для эфедрина и верапамила в компьютерной программе был задан на уровне 0,1 и 0,06 соответственно, т. е. в диапазоне ± 0,05 и ± 0,03 от среднего значения
Значения пределов обнаружения для эфедрина и верапамила при исследовании модельных растворов аналитов в метаноле составили 10,0 мкг/мл (что соответствует 1 мкг в пробе). Повышение пределов обнаружения в модельных растворах мочи обусловлено потерями при пробоподготовке, а также присутствием соэкстрактивных веществ в пробе, что создает дополнительный фон на пластинке.
При исследовании модельных растворов мочи удалось достигнуть пределов обнаружения около 30,0 мкг/мл эфедрина и около 50,0 мкг/мл верапамила в пробе за счет применения растровых манипуляций с электронным образом хромато-граммы — изменения резкости, интенсивности изображения, параметров яркости и контрастности, возможности просмотра хроматограммы в негативе. Данные манипуляции позволяют сделать почти незаметное для человеческого глаза "пятно" анализируемого вещества четко детектируемым. На рисунке приведены хромато-граммы модельных растворов мочи с концентрациями эфедрина 10,0; 50,0; 200,0; 250,0 мкг/мл.
Градуировочные зависимости "площадь пятна (У) — количество эфедрина и верапамила, мкг (X) ", построенные в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл, описываются уравнениями полиномиальной (квадратичной) регрессии. Однако для установления данной зависимости необходимо использовать более трех модельных растворов аналита в метаноле различных концентраций, что в условиях повседневной аналитической практики приведет к снижению производительности анализа.
Для упрощения аналитической задачи нами было предложено применение линейной регрессии, при этом количество модельных растворов аналита в метаноле, используемых для градуировки, было уменьшено до двух, при этом относительная
в
Рис. Хроматограммы модельных растворов мочи с концентрацией эфедрина 10,0; 50,0; 200,0; 250,0 мкг/мл:
а — после обработки 0,5 % раствором нингидрина в ацетоне без растровых манипуляций; б — просмотр в негативе; в — просмотр в негативе с увеличением резкости изображения
ошибка определения не превышала 35 %, что приемлемо для предварительного этапа анализа. Вышеуказанные зависимости были определены для вариантов анализа с применением в качестве источника электронного образа хроматограммы планшетного сканера и цифрового фотоаппарата (табл. 2).
Таблица 2
Градуировочные характеристики количественного денситометрического определения эфедрина и верапамила
Вещество Источник электронного образа Полиноминальная регрессия Линейная регрессия
Эфедрин Сканер У=0,0078-ХЧ73,92-Х+274,37 0,0078 ±0,0002; 73,92 ±4,43; 274,37 ±16,46 У=76,90-Х-46,28 76,90 ±3,04; 46,28 ±2,26
Фотоаппарат У=0,025-ХЧб6,46-Х-569,67 0,025 ±0,0015; 66,46 ±3,52; 569,67 ±27,34 У=61,41-Х+477,24 61,41 ± 3,61; 477,24 ±24,33
Верапамил Сканер У=0,081-ХЧ72,80-Х+380,47 0,081 ±0,0025; 72,80 ±2,48; 380,47 ±14,83 У=96,22-Х-589,75 96,22 ±2,89; 589,75 ±21,52
Фотоаппарат У=0,0069-ХЧ11,54-Х-73,44 0,0069 ±0,0004; 11,54 ±0,69; 73,44 ±3,76 У=9,42-Х+32,29 9,42 ±0,55; 32,29 ±1,61
Результаты контроля правильности методики определения эфедрина и верапамила при использовании различных комбинаций пар модельных растворов анали-тов в метаноле с определенными концентрациями представлены в табл. 3. При производстве контроля правильности методики проводили по 10 параллельных определений.
Таблица 3
Результаты контроля правильности количественного денситометрического определения эфедрина и верапамила
Аналит Источник электронного образа Сет, мкг / мл Сет*, мкг / мл 8, у. е. Со, мкг / мл П1, мкг %
Эфедрин Сканер 250,0; 100,0 10,0х 115 10,78 1,078 7,8
100,0; 10,01 250,0 2831 266 26,6 6,4
250,0; 10,01 100,0 1110 104,3 10,43 4,3
Фотокамера 250,0; 100,0 10,0х 1101 13,5 1,35 35
100,0; 10,01 250,0 23040 282,5 28,25 13
250,0; 10,01 100,0 9297 114 11,4 14
Окончание табл. 3
Аналит Источник электронного образа Сст, мкг / мл Сст*, мкг / мл 8, у. е. Со, мкг / мл П1, мкг %
Верапамил Сканер 250,0; 100,0 10,0х 124 11,65 1,165 16,5
100,0; 10,01 250,0 2882 270,75 27,075 8,3
250,0; 10,01 100,0 1141 107,2 10,72 7,2
Фотокамера 250,0; 100,0 10,0х 1019 12,50 1,25 25
100,0; 10,01 250,0 22020 270 27 8
250,0; 10,01 100,0 8784 107,7 10,77 7,7
Примечания. Сст — концентрации модельных растворов аналитов в метаноле, используемые для градуировки, мкг/мл; Сст* — концентрации модельных растворов, приготовленных отдельно от растворов, используемых для градуировки, и служащих в качестве контроля правильности количественного определения аналитов, мкг/мл; S — площадь пятна в условных единицах, соответствующих пикселям экрана монитора; Со — рассчитанная концентрация аналита в пробе, мкг/мл; т — рассчитанная масса аналита в пробе, мкг; % — относительная ошибка определения среднего значения концентрации аналита в пробе, %; 1 — концентрация 10,0 мкг/мл при объеме, наносимой на пластинку пробы 100 кЬ мкл соответствует пределу обнаружения.
Различие в уравнениях регрессии, полученных при оцифровке сканером и фотоаппаратом, объясняется наличием дополнительного фона при фотографировании пластин — "паразитное освещение", блики, чего удается избежать при сканировании пластин.
Относительная ошибка определения среднего значения содержания эфедрина и верапамила в пробе в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл не превышает соответственно 35 и 25 % при использовании для получения электронного образа хроматограммы цифрового фотоаппарата и 7,8 и 16,5 % соответственно — в случае сканирования хроматографических пластинок, последний вариант является наиболее предпочтительным. Наименьшая величина ошибки достигается при концентрациях эфедрина и верапамила в пробе 100 мкг/мл.
Заключение
Вышеописанный методический подход в настоящее время внедряется в практику судебно-химического отделения Ульяновского областного бюро судебно-медицинской экспертизы, поскольку является экспрессным, технически доступным и экономически приемлемым вариантом предварительного исследования на эфедрин и верапамил в биологических жидкостях. Анализ биологических жидкостей на эфедрин и верапамил проводится сериями с использованием модельных раство-
ров эфедрина и верапамила в метаноле с концентрацией 10,0 и 250,0 мкг/мл.
Данная методика может быть применена в клинико-токсикологическом анализе.
Литература
[1] Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств / под ред. Б.Н. Изотова. М.: Мысль, 1993. 270 с.
[2] WEB-страница И.Н. Плахотного [Электронный ресурс]. URL: http://www.garryc2008.narod.ru. (дата обращения: 09. 09 2011).
[3] Симонов Е.А., Изотов Б.Н., Фесенко А.В. Наркотики: методы анализа на коже, в ее придатках и выделениях. М.: Анахарсис, 2000. 130 с.
[4] Наркотические средства, психотропные и сильнодействующие вещества / Р.В. Бабаханян [и др.]. СПБ.: Реноме, 2008. 276 с.
[5] Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие / под. ред. проф. Н.И. Калетиной. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. 1016 с.
[6] Clarke's Analysis of Drugs and Poisons. London: The pharmaceutical press, 2011. 2473 p.
[7] Химико-токсикологический анализ веществ, вызывающих одурманивание: метод. указания / под ред. Б.Н. Изотова. М., 1987. 122 с.
Поступила в редакцию 8/IV/2013;
в окончательном варианте — 8/IV/2013.
EPHEDRINE AND VERAPAMYLE DENSITOMETRIC ANALYSIS IN JUDICIAL-CHEMICAL EXAMINATION
© 2013 V.A. Kormishin? А.V. Voronin, I.F. Shatalaev4
In this article the analytical characteristics of method of analysis of ephedrine and verapamyle with application of thin-layer chromatography and densitometry is considered. Detection limit of ephedrine and verapamyle is 10,0 ^g/ml in a sample. The possibility of ephedrine and verapamyle quantitative determination in model samples in the range of 10,0-250,0 ^g/ml concentration is indicated.
Key words: ephedrine, verapamyle, densitometry, thin-layer chromatography.
Paper received 8/IV/2013. Paper accepted 8/IV/2013.
3Kormishin Vasiliy Alekseevich (kormishinvaainbox.ru), the Dept. of Chemistry of Pharmaceutical Faculty, Samara State Medical University, Samara, 443099, Russian Federation. Judicial-medical expert of judicial-chemical branch of the bureau of a forensic medical examination of the Ulyanovsk region, Ulyanovsk, 432064, Russian Federation.
4Voronin Alexander Vasilievich (dimmu2000amail.ru), Shatalaev Ivan Fedorovich (cyricaproezd.net), the Dept. of Chemistry of Pharmaceutical Faculty, Samara State Medical University, Samara, 443099, Russian Federation.
