Дельтаран облегчает ишемию головного мозга при стрессорных нагрузках: экспериментальное исследование Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616-005.4:612-062

ДЕЛЬТАРАН ОБЛЕГЧАЕТ ИШЕМИЮ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ СТРЕССОРНЫХ НАГРУЗКАХ: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

© Коплик Е.В., Ганнушкина И.В\ Конорова И.Л., Пирогова Г.В., Судаков К.В. НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, Москва

Н:

НЦ Неврологии РАМН, Москва

E-mail: e .koplik@mail.ru

У низкорезистентных крыс Вистар после перенесенного эмоционального стресса выявлено большее снижение локального мозгового кровотока. Установлено, что препарат "Дельтаран" избирательно повышает у этих животных мозговой кровоток и улучшает эффективность кровоснабжения коры головного мозга. Дельтаран в острейшем периоде ишемии предотвращает прогрессирующее снижение локального мозгового кровотока за счет коллатерального кровообращения и более адекватного кровоснабжения мозговой ткани, на 62% снижает летальность и облегчает течение последующей центральной ишемии.

Ключевые слова: локальный мозговой кровоток, ишемия головного мозга, эмоциональный стресс, дельтаран.

DELTARAN RELIEVES THE BRAIN ISCHEMIA COMPLICATED AFTER EMOTIONAL STRESS:

_______EXPERIMENTAL RESEARCH

Koplik E. V., Gannushkina I.V., Konorova I.L., Pirogova G. V., Sudakov K. V.

It has been detected the greater decrease in the local cerebral blood flow in low-resistant Wistar rats after the emotional stress. The drug "Deltaran" selectively boosts the local cerebral blood flow in these animals and improves the efficiency of blood supply of the brain cortex. Deltaran prevents from progressive lowering the local cerebral blood flow at the expense of a collateral circulation and more adequate blood supply of the cerebral tissue in acute brain ischemia, reduces the mortality-rate by 62% and facilitates the course of the central ischemia.

Keywords: local cerebral blood flow, brain ischemia, emotional stress, Deltaran.

Одной из актуальных проблем современной медицины является предупреждение и восстановление нарушенных физиологических функций у людей, перенесших стрес-сорные нагрузки.

Психоэмоциональный стресс современного человека обусловлен сложными социальными преобразованиями, происходящими в разных странах мира - войнами, техногенными катастрофами, участившимися террористическими актами, направленными против мирного населения; потоком негативной информации, поступающей из средств массовой информации, и др. Причиной ишемических инсультов достаточно часто выступает эмоциональный стресс, перенесенный накануне инсульта.

Проведенные на животных экспериментальные исследования установили, что особенности течения церебральной ишемии определяются исходным (до инсульта) состоянием метаболизма мозга, а также нейроим-мунных механизмов [4].

В наших экспериментах [7] было показано, что среди общей популяции крыс Вистар по поведению в тесте "открытое поле" выявляются две крайние группы животных: активные по поведенческим показателям крысы - устойчивые, а пассивные - предрасположенные к стрессорным нагрузкам. Обнаружено, что стресс-предрасположенные крысы, по сравнению со стресс-устойчивыми, более чувствительны к ишемии головного мозга, вызванной окклюзией общих сонных артерий, [2]. У всех высокочувствительных к ишемии мозга стресс-предрасположенных животных, был исходно более выраженный локальный мозговой кровоток (лМК), который при ишемии более значительно по сравнению со стресс-устойчивыми животными снижался, что влекло за собой и более интенсивное повреждение мозга, чем у стресс-устойчивых особей.

Ранее в наших экспериментах было показано, что перенесенный эмоциональный стресс резко утяжеляет у всей исследуемой

популяции крыс последующую ишемию головного мозга, стирая их различия в индивидуальной прогностической чувствительности к стрессорной нагрузке, и ведет к повышению летальности до 96-98% и развитию тяжелых осложнений [3].

Наши исследования показали, что исходная нейрохимическая организация лимбико-гипоталамо-ретикулярных структур у животных может быть изменена при дополнительном введении дельта-сон-индуцирующего пептида (ДСИП). Одновременно повышается устойчивость животных к эмоциональному стрессу [18]. Введение ДСИП повышает выживаемость стресс-предрасположенных животных в условиях острой конфликтной ситуации за счет снижения возбудимости эмоцио-генных структур головного мозга [1З], уменьшения прессорных сосудистых реакций при раздражении вентромедиального гипоталамуса, нормализации функций сердца (анти-аритмическое действие) [11] изменения уровня нейропептидов в гипоталамической области мозга и крови [12], а также снижения стресс-индуцированной экспрессии гена с-fos в паравентрикулярном гипоталамусе, латеральных и медиальных областях перегородки головного мозга [14].

ДСИП подавляет в ЦНС избыточное производство свободных радикалов и предупреждает гибель нейронов при стрессорных воздействиях [13]. Олигопептид активирует окислительное фосфорилирование и in vitro повышает устойчивость нейронов головного мозга к гипоксии [17], а также снижает чувствительность рецепторов нейронов головного мозга к возбуждающему действию глута-мата [15, 19]. Таким образом, ДСИП способствует предотвращению эксайтотоксичности в нейронах головного мозга при церебральной ишемии.

Наряду с этим в защите мозга от эксайто-токсического повреждения существенную роль играет тормозный аминацидергический медиатор глицин, который связывает токсичные соединения (альдегиды и кетоны), в больших количествах образующиеся при острой ишемии [5]. Отечественной фармацевтической промышленностью для клинических целей налажен выпуск препарата "Дельтаран", который содержит 10 частей глицина и 1 часть ДСИП (фирма "Комкон", Россия).

Таким образом, дельтаран, объединяет в себе стресс-протективные, ноотропные и адаптогенные свойства дельта-сон-индуциру-ющего пептида и глицина.

Настоящее экспериментальное исследование проведено с целью выяснения возможности дельтарана предотвращать или снижать негативное влияние перенесенных стрессор-ных нагрузок у крыс на тяжесть последующего ишемического повреждения головного мозга.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 300 контрольных и перенесших 18-часовой конфликтноэмоциональный стресс низкорезистентных к эмоциональному стрессу крысах-самцах Вистар. Прогностическую оценку индивидуал ь-ной эмоциональной резистентности крыс к эмоциональному стрессу осуществляли путем тестирования животных по их поведению в новой стрессорной обстановке в "открытом поле" с использованием компьютерной программы "Open field" [8].

Эксперименты выполнялись в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10.1983 г., № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" и "Правилами по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных", утвержденных МЗ СССР (1977) и МЗ РСФСР (1977).

Контрольным стресс-предрасположенным животным под нембуталовым наркозом воспроизводили ишемию головного мозга методом двусторонней окклюзии общих сонных артерий. Стрессированную группу составили животные, перенесшие 18-часовую агрессивно-конфликтную ситуацию при мягкой фиксации за хвосты к стенке клетки [16], после которой вводили раствор нембутала (45 мг/кг) и через 40 минут воспроизводили ишемию головного мозга. Наличие стресс-реакции у животных после их сакрификации контролировали по изменению веса тимуса и надпочечников.

Внутрибрюшинное введение раствора дельтарана (концентрация 10 мкг/мл в дозе 30 мкг/кг веса) проводили за 20 мин до

наркоза и за 40 мин до двусторонней окклюзии общих сонных артерий.

До, сразу после окклюзии общих сонных артерий и на 20-й минуте ишемии симметрично в теменно-затылочной коре обоих по-лушариий головного мозга в зоне смежного кровоснабжения игольчатыми световодами измеряли локальный мозговой кровоток в пе-рифлюксах. У животных одновременно с кровотоком регистрировали ЭЭГ. Каждые 5 сек у крыс, находящихся под нембуталовым наркозом, определяли интегральную величину амплитуд (в мкВ) медленных высокоамплитудных волн и рассчитывали отношение локального мозгового кровотока к амплитуде ЭЭГ (ЛМК/ЭЭГ), характеризующее адекватность кровоснабжения коры головного мозга [1]. В конце экспериментов через 2 часа после ишемии мозга животных сакрифициро-вали, извлекали головной мозг и замораживали его в жидком азоте для биохимических исследований, а также брали пробы крови, выделяли и взвешивали органы стресс-маркеры: тимус и надпочечники. В базальных ядрах миндалины головного мозга по методу

Э.Н. Коробейниковой [9] оценивали показатели про- и антиоксидантной активности (малоновый диальдегид - один из конечных продуктов перекисного окисления липидов и каталазу - показатель активности системы антиоксидантной защиты. Использованная нами модификация метода позволяла спектрофотометрически определять связанные малоновым диальдегидом продукты тиобар-битуровой кислоты в гомогенате ткани без дополнительной экстракции бутанолом. Для определения каталазы была использована методика H. Aebi в модификации М.А. Королюк [10]. В отдельной серии опытов на 46 наркотизированных животных определяли % гибели через 24 часа после окклюзии общих сонных артерий.

В независимом опыте на 116 животных изучали влияние дельтарана на асимптотическую вязкость крови и гематокрит во всех исследуемых группах. Для этого из левого желудочка сердца наркотизированных животных осуществляли забор 9 мл крови для исследования её в лабораторном капиллярном вискозиметре и гематокритной микроцентрифуге Clay Adams (Becton, Dickinson & Co, USA).

Для сравнения данных, полученных в разных сериях опытов, и определения достоверности их различий использовали парный и непарный критерии Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что введение дельтарана крысам с низкой эмоциональной резистентностью вызывало у всех животных незначительное повышение локального мозгового кровотока (рис. 1А). У всех крыс на ЭЭГ уже через 5 минут после введения препарата отмечалось уменьшение амплитуды медленных волн в обоих полушариях головного мозга. Такая же ЭЭГ активность мозга сохранялась в течение 120 мин экспериментов. За счет этого у животных, получавших дельтаран, к 30-й мин возрастал средний показатель эффективности кровоснабжения коры (лМК/ЭЭГ) в обоих полушариях мозга на 67±5% относительно такового у животных, не получавших дельтарана (рис. 2А). У всех животных, получавших дельтаран, через 120 мин после его введения при неизменном показателе гематокрита (44,3±0,7%) отмечено снижение асимптотической вязкости крови на 9±0,5% по сравнению с крысами без введения препарата (рис. 3). В миндалевидном теле головного мозга также выявлено снижение на 20% уровня малонового диальдегида (рис. 4А) и повышение на 40±3,6% уровня каталазы (рис. 4Б), что свидетельствует о возрастании активности антиоксидантной защиты в ткани головного мозга у низкорезистентных к эмоциональному стрессу и церебральной ишемии крыс. Данный факт можно рассматривать как адаптационное изменение, повышающее их резистентность к стрессорным воздействиям. У контрольных стресс-низкорезистентных животных, не получавших дельтаран, был выявлен более высокий уровень перекисного окисления липидов в миндалевидном теле головного мозга (рис. 4).

На фоне дельтарана у низкорезистентных крыс сразу после окклюзии общих сонных артерий наблюдали снижение локального мозгового кровотока в коре головного мозга достоверно в меньшей степени по сравнению с контрольными, не получавшими дельтаран,

А Б

Рис. 1. Характер коллатерального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс, предрасположенных к эмоциональному стрессу, после окклюзии двух общих сонных артерий у крыс при ишемии мозга (А) и при постстрессорной ишемии (Б). Контроль (без введения дельтарана) и после введения дельтарана животным.

Условные обозначения: * - р<0,05, ** - р<0,01 по отношению к фоновым показателям; # - р<0,05, ## - р<0,01 по сравнению с показателем без введения дельтарана. Белый столбик - фон без ишемии, черный - изменение кровотока сразу после окклюзии обеих сонных артерий, столбики в полоску - изменение кровотока через 20 мин после окклюзии обеих сонных артерий.

А Б

лМК/ЭЭГ

Ишемия

16 и

Контроль Дельтаран

Рис. 2. Изменение показателя эффективности мозгового кровотока (ЛМК/ЭЭГ) в коре головного мозга стресс-низкорезистентных крыс после ишемии мозга (А) и при постстрессорной ишемии мозга (Б). Контрольные (без введения дельтарана) и после введения дельтарана животным.

Обозначения те же, что и на рис. 1.

Вязкость крови

мПа сек

Рис. 3. Изменение показателя асимптотической вязкости крови у низкорезистентных к эмоциональному стрессу крыс в контроле, после эмоционально-стрессорного воздействия, после ишемии и постстрессорной ишемии без введения и после внутрибрюшинного введения дельтарана.

Условные обозначения: # - р<0,05; ## - р<0,01 по сравнению с интактным контролем (фон); * - р<0,05; ** -р<0,001 по сравнению с показателем без введения дельтарана. Белый столбик - без введения дельтарана, столбики в полоску - на фоне введения дельтарана.

А Б

*

о

ю

о

ц

о

ю

<

С[

Рис. 4. Уровень малонового диальдегида (МДА/белок) (А) и каталазы (каталаза/белок) (Б) в миндалевидном теле головного мозга низкорезистентных крыс в контроле, после выключения общих сонных артерий, после перенесенного 18-часового эмоционально-стрессорного воздействия и последующей ишемии головного мозга без введения и на фоне введения дельтарана.

Условные обозначения: ** - р<0,01 по сравнению с контролем (интактным); ## - р<0,01 по сравнению с показателем без введения дельтарана; остальные - как и на рис. 3.

Таблица 1

Действие дельтарана на весовые коэффициенты органов стресс-маркеров (мг/100 г веса тела) у стресс-низкорезистентных крыс при церебральной ишемии

Орган-мишень Интактные крысы Ишемия 18 ч. стресс Стресс+ишемия

Контроль Тимус 64,6±1,8 52,3±1,4 44,5±3,6** 37,7±1,3**

Надпочечник 6,9±0,4 7,2±0,6 7,6±0,8 8,5±0,6

Дельтаран Тимус 70,3±2,3 68,2±1,6# 63,1±3,4 59,6±2,7##

Надпочечник 5,3±0,6# 6,2±0,4 6,7±0,3 6,9±0,7

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,001 по сравнению с контролем (фон); # - р<0,05; ## - р<0,01 по сравнению с показателем без дельтарана.

животными. Кровоснабжение мозга к 20-й мин ишемии на фоне дельтарана за счет компенсаторного коллатерального кровообращения достоверно улучшилось (на 23%) по сравнению с контролем (рис. 1А). На фоне введения дельтарана в условиях ишемии головного мозга наблюдалось снижение уровня нейрональной активности. При этом на 25±1,6% возрастал показатель эффективности мозгового кровообращения (ЛМК/ЭЭГ) по сравнению с контрольными крысами (рис. 2А). При введении дельтарана показатель вязкости крови в условиях ишемии мозга соответствовал вязкости крови у контрольных животных, не получавших препарата и не подвергавшихся никаким воздействиям (рис. 3). Показатели про- и антиоксидантной активности в миндалевидном теле головного мозга в условиях ишемии мозга на фоне дельтарана практически не отличались от контрольных показателей в тех же условиях (рис. 4А и 4Б).

После введения дельтарана у низкорезистентных к стрессорной нагрузке крыс после эмоционального стрессорного воздействия и церебральной ишемии по сравнению с контрольными животными отмечались менее выраженные изменения весовых коэффициентов органов стресс-маркеров (надпочечники и тимуса) (табл. 1).

Введение дельтарана у стрессированных низкорезистентных крыс вызывало увеличение локального кровотока в коре головного мозга на 20±1,8% по сравнению с контрольными стрессированными крысами без введения препарата. На фоне дельтарана у пост-стрессорных низкорезистентных крыс сразу и через 20 минут после окклюзии общих сонных артерий показатели локального мозгового кровотока в коре головного мозга остава-

лись на более высоких значениях (на 40±3,8%, чем у контрольных животных) (рис. 1Б). При этом резко возрастала амплитуда электрической активности головного мозга, в отличие от контрольных низкорезистентных крыс. К 20-й минуте ишемии электрическая активность в коре головного мозга на фоне дельтарана нормализовалась и сохранялась на более низком уровне, чем у контрольных животных. В результате чего показатель эффективности кровоснабжения коры (лМК/ЭЭГ) у стрессированных животных, получавших дельтаран, после окклюзии общих сонных артерий поддерживался хотя и на ниже 35±5% фоновых (введение дельтарана без ишемии) значений, но на более высоком уровне, в 3 раза выше, чем у контрольных животных (рис. 2Б). При применении дельтарана на фоне постстрессорной ишемии мозга отмечалось достоверное на 12±1% снижение вязкости крови по сравнению с контрольными крысами. У контрольных животных, не получавших препарата, наблюдалось увеличение вязкости крови при развитии как стрессорного состояния, так и ишемии головного мозга (рис. 3). На фоне дельтарана показатели прооксидантной активности в миндалевидном теле головного мозга у крыс в этих условиях практически не изменялись, а показатели антиоксидантной активности резко увеличивались на 220% по сравнению с контролем (рис. 4А и 4Б).

Из полученных результатов следует вывод, что введение дельтарана вызывает у стресс-низкорезистентных крыс в острейшем периоде ишемии увеличение эффективности кровоснабжения коры головного мозга, сохранение показателя вязкости крови и про- и антиоксидантной активности в миндалевидном теле головного мозга без изменений. При

■ Погибли □ Выжили

Рис. 5. Летальность стресс-низкорезистентных крыс в условиях церебральной ишемии и пост-стрессорной ишемии без введения и на фоне введения дельтарана.

Условные обозначения: черным цветом отмечен % летальности, белым - % выживаемости низкорезистентных крыс при ишемии мозга.

этом 100% стресс-низкорезистентных животных, получавших дельтаран, выжили в условиях церебральной ишемии, в то время как 38% контрольных животных, не получавших препарата, погибли в тех же условиях (рис. 5). При постстрессорной ишемии на фоне дельтарана выжили 71%. И только 9% контрольных крыс, не получавших препарата, выжили в тех же условиях (рис. 5). Следовательно, дельтаран предотвращает негативные последствия перенесенного эмоционального стресса, способствует более легкому течению последующей церебральной ишемии и снижению смертности от неё у перенесших эмоциональный стресс низкорезистентных особей.

Проведенные исследования позволяют считать, что дельтаран может быть рекомендован в качестве профилактического средства при наличии факторов риска ишемического инсульта, а также для снижения последствий данного заболевания.

Авторы выражают благодарность ООО Исследовательскому центру "Комкон" (СПб., Россия) и персонально И.И. Михалевой за предоставленный для экспериментальных исследований препарат "Дельтаран ".

Работа выполнена при частичной поддержке Гранта Президента поддержки научных школ (грант НШ-3232.2008.4).

ЛИТЕРАТУРА

1. Ганнушкина И.В., Антелава А.Л., Баранчикова М.В. Соотношение мозгового кровотока с нейрональной активностью у животных с разной чувствительностью к эмоциональному стрессу. - Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1994. - № 10. - С. 360-363.

2. Ганнушкина И.В., Коплик Е.В., Антелава А.Л., Конорова И.Л. Особенности мозгового кровотока у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу. Рук-во по реабилитации лиц, подвергшихся стрессорным нагрузкам / Под ред. В.И. Покровского. - М.: Медицина, 2004. - С. 370-380.

3. Ганнушкина И.В., Коплик Е.В., Конорова И.Л и др. Дизрегуляция коллатерального кровообращения и нарушение перекисного окисления липидов - основа негативного влияния эмоционального стресса на течение церебральной ишемии // Журн. неврол. и псих. им С.С. Корсакова. - 2004. № 12. - С. 46-52.

4. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. - М.: Медицина, 2001. - 147 с.

5. Гусев Е.И., Никифоров А.С., Гехт А.Б. Лекарственные средства в неврологической клинике. - М.: МЕДпресс-информ, 2003. - 164 с.

6. Конорова И.Л., Ганнушкина И.В., Коплик Е.В., Антелава А.Л. Профилактика дельтараном негативных последствий перенесенного эмоционального стресса при последующей церебральной ишемии у низкорезистентных животных // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2006. - Т. 141, №5. - С. 499-502.

7. Коплик Е.В., Ганнушкина И.В., Антелава А.Л. и др. Прогностические поведенческие критерии и особенности мозгового кровотока у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу // Физиол. журн. - 1995. -Т. 81, № 9. - С. 35-39.

8. Коплик Е.В. Метод определения критерия устойчивости крыс к эмоциональному стрессу // Вестн. новых медицинских технологий. -2002. - Т. 9, № 1. - С. 16-18.

9. Коробейникова Э.Н. Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. - 1989. - № 7. - С. 81.

10. КоролюкМ.А. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1988. - № 3. - С. 46.

11. Михалева И.И., Судаков К.В. Пептид дельтасна как модулятор сердечной деятельности. Теоретические рекомендации для применения // Космическая биология. - 1990. - № 3. -С. 23-28.

12. Судаков К.В., Кохлан Дж.П., Котов А.В. и др. Изменение содержания вещества П, бета-эндорфина и кортикостерона у крыс различной устойчивости к эмоциональному стрессу, после введения пептида, вызывающего дель-

та-сон // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1995. - Т. 119, № 1. - С. 6-9.

13. Судаков К.В. Индивидуальная устойчивость к эмоциональному стрессу. - М.: Горизонт, 1998. - 118 с.

14. Судаков К.В., Умрюхин П.Е., Коплик Е.В., Анохин К.В. Экспрессия гена с-fos при эмоциональном стрессе у крыс; блокирующая роль пептида, вызывающего дельта-сон // Росс. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2000. - Т. 86, № 6. - С. 620-625.

15. Умрюхин П.Е. Пептид, вызывающий дельтасон, блокирует возбуждающие эффекты глу-тамата на нейронах мозга у крыс // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. -Т. 134, № 7. - С. 9-11.

16. Юматов Е.А., Певцова Е.И., Мезенцева Л.А. Физиологически адекватная экспериментальная модель агрессии и эмоционального стресса // Журн. ВНД им И.П. Павлова. - 1988. -Т.38.- С. 350-354.

17. Khvatova E.M., Samartzev V.N., Zagoskin P.P. et al. Delta sleep inducing peptide (DSIP): effect on respiration and in rat brain mitochondria and stress protective potency under experimental hypoxia // Peptides. - 2003. - Vol. 24, N 4. -P.307-311.

18. Sudakov K.V., Koplik E.V., Vedjaev D.F. et al. Delta-Sleep Inducing Peptide (DSIP) as a factor facilitationg animals resistance to acute emotional stress // The Pavlov J. Biol. Sci. - 1984. - Vol. 18, N 1. - P. 1-5.

19. Sudakov K.V., Umriukhin P.E., Rayevsky K.S. Delta-sleep inducing peptide and neuronal activity after glutamate microiontophoresis: the role of NMDA-receptors // Pathophysiology. - 2004. -Vol. 11. - P. 81-86.