CC BY
34MIRJournal
MicrobioLogy Independent Research JournaL
DOI: 10.18527/2500-2236-2023-10-1-1-12 ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ СТАТЬЯ
Деконтаминация поверхностей от нуклеиновых кислот аэрозолями дезинфицирующих средств
В. В. Кузин* , Н. В. Колупаева , О. А. Щербакова , И. А. Дятлов
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, территория «Квартал А», д. 24, п. Оболенск, г. о. Серпухов, 142279 Российская Федерация
# Автор, ответственный за переписку: Кузин Виктор Владимирович, научный сотрудник отдела подготовки и усовершенствования специалистов ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, территория «Квартал А», д. 24, п. Оболенск, г. о. Серпухов, 142279 Российская Федерация, e-mail: [email protected]
АННОТАЦИЯ
Важной проблемой при работе в ПЦР-лаборатории является возникновение перекрестного загрязнения, которое приводит к появлению ложноположительных результатов. Существует множество способов решения данной проблемы, однако ни один из них не является универсальным. Для деконтаминации сложных поверхностей большой площади предпочтительнее использовать аэрозольный метод обработки. Цель данного исследования заключалась в определении эффективных режимов применения дезинфицирующих средств для деконтаминации от нуклеиновых кислот аэрозольным методом. Анализ деконтаминирующей активности хлорактивных и кислородактивных соединений проводили, моделируя контаминацию поверхностей нуклеиновыми кислотами и бактериями. В процессе работы установлены эффективные режимы проведения аэрозольной деконтаминации. Показаны различия при удалении нуклеиновых кислот и бактериального загрязнения с лабораторных поверхностей.
Ключевые слова: ПЦР, ДНК, ампликоны, деконтаминация, дезинфицирующие средства, аэрозоль. Получена: 3 октября 2022 Принята к печати: 29 ноября 2022 Опубликована: 9 января 2023
Цитирование: Кузин ВВ, Колупаева НВ, Щербакова ОА, Дятлов ИА. Деконтаминация поверхностей от нуклеиновых кислот аэрозолями дезинфицирующих средств. MIR J 2023; 10(1), 1-12. doi: 10.18527/2500-2236-2023-10-1-1-12. Авторские права: © 2023 Кузин и др. Эта статья публикуется в свободном доступе в соответствии с лицензией Creative Commons AttributionNonCommercial-ShareAlike 4.0 International Public License (CC BY-NC-SA), которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любых носителях при условии, что указываются автор и источник публикации, а материал не используется в коммерческих целях. Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование: Исследование выполнено в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.
ое©
Using aerosols to decontaminate surfaces of nucleic acids
Viktor V. Kuzin# , Nadezhda V. Kolupaeva , Olga A. Shcherbakova , Ivan A. Dyatlov
State Research Center for Applied Microbiology & Biotechnology, Obolensk, 142279 Russia
# For correspondence: Viktor V. Kuzin, Department of specialists training and improvement, State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Rospotrebnadzor, Territory "Kvartal A", 24, Obolensk, Serpukhov, Moscow region, e-mail: [email protected]
ABSTRACT
Cross-contamination that leads to false positive results is a serious problem for laboratories using the PCR method. There are many ways to solve this problem, but none of them could be considered universal. Treatment with aerosols is the preferable method for decontamination of large areas of complex surfaces. The goal of this study was to determine effective aerosol compositions and
Keywords: PCR, DNA, amplicons, decontamination, disinfectants, aerosol Received: October 3, 2022 Accepted: November 29, 2022 Published: January 9, 2023
Citation: Kuzin VV, Kolupaeva NV, Shcherbakova OA, Dyatlov IA. Using aerosols to decontaminate surfaces of nucleic acids. MIR J 2023; 10(1), 1-12. doi: 10.18527/2500-2236-2023-10-1-1-12.
Copyright: © 2023 Kuzin et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative i __ _ _ Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International Public License (CC BYNC-SA), which IWl|lSlgi[ permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, as long as the material is not used for commercial purposes, provided that the original author and source are cited. Conflict of interests: The authors declare no conflicts of interest.
Funding: This research was funded by the Industrial Branch Program of Rospotrebnadzor 2021-2022.
regimens for the decontamination of nucleic acids on laboratory surfaces. The decontaminating activity of compounds that release active chlorine and active oxygen was studied using model surfaces contaminated with nucleic acids and bacteria. Effective modes of decontamination with aerosols were established by analysis of obtained experimental data. Differences between decontamination of nucleic acids and bacterial disinfection of the laboratory surfaces are shown.
ВВЕДЕНИЕ
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из самых популярных методов амплификации нуклеиновых кислот (НК), применяемых в лабораторной диагностике. Данный метод регулярно используется в клинических лабораториях для выявления микроорганизмов, культивирование которых вызывает определенные сложности.
В связи с высокой чувствительностью ПЦР основной проблемой ее применения является перекрестное загрязнение рабочей зоны, приборов и реактивов ампликонами, которые могут повлиять на результат ПЦР-анализа и привести к ложноположительным результатам [1].
Контаминация рабочих поверхностей и оборудования ампликонами в процессе ПЦР приводит к их реамплификации и контаминированию исследуемого материала, осложняя исследовательские и диагностические работы [1]. Загрязнение ампликонами актуально для всех лабораторий, в которых применяются методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Источниками распространения ампликонов являются воздух рабочих помещений, оборудование и одежда сотрудников. Наиболее актуальна эта проблема для клинических и криминалистических лабораторий. Причиной бактериальных загрязнений рабочих поверхностей могут служить также аварийные ситуации. Контаминация проб может привести к ложноположительным результатам анализа [2]. Выявление источника контаминации связано с временными и материальными затратами [3].
В настоящее время для деконтаминации помещений, использующих МАНК, от НК применяются ультрафиолетовое облучение [4], обработка ферментами, расщепляющими молекулы НК [5], или дезинфицирующими средствами (ДС) [3]. В качестве ферментов, способных разрушить ДНК, используются экзону-клеаза III, ДНКаза I и ферменты рестрикциии [6, 7]. Наиболее распространенными ДС, обеспечивающими деконтаминацию ДНК, являются ДС на основе хло-рактивных и кислородактивных соединений [3].
Ни один из существующих методов деконтами-нации НК не является универсальным [1, 8]. Оборудование может быть крупногабаритным и сложным по конструкции, а также содержать металлические и пластиковые детали, которые чувствительны к воздействию кислот и окислителей. УФ излучение эффективно только для открытых поверхностей и не подходит для приборов сложной конструкции из-за неполного удаления фрагментов ДНК, а также обладает разрушающей способностью в отношении пластмассовых материалов при многократном использовании [9, 10]. Кроме того, большинство распространенных методов деконтаминации недостаточно эффективно для удаления коротких фрагментов ДНК с низкой молекулярной массой (менее 200 п. н.) [11].
Таким образом, существует потребность в поиске надежных и стандартизированных методов декон-таминации поверхностей в лабораториях, использующих МАНК [5]. Обработка ДС остается наиболее дешевым, эффективным и простым для применения
методом деконтаминации от НК в лабораторной практике. Однако в отношении деконтаминации поверхностей от НК существует необходимость актуализации перечня средств и методов их применения.
Классические методы, включающие протирание поверхностей помещений и оборудования или погружение в ДС (расходные инструменты), целесообразно применять для частичной (местной) деконтаминации, а при необходимости полной обработки сложных поверхностей большой площади предпочтительнее использовать аэрозольный метод с применением генераторов аэрозоля [12]. Цель данного исследования заключалась в определении эффективных режимов применения ДС при проведении дезинфекции и деконтаминации НК аэрозольным методом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Дизайн эксперимента
Деконтаминацию поверхностей от НК проводили аэрозольным методом ДС на основе перекиси водорода (ПВ), диоксида хлора (ДХ), надуксусной кислоты (НУК), дихлоризоциануровой кислоты (ДХЦК), гипохлорита натрия (ГН). Перечень веществ, активных в отношении НК, был определен ранее [13]. В качестве объекта исследования использовали боксы микробиологической безопасности II класса типа А (Lamsystems, Миасс, Россия). Перед работой проводили обработку согласно СП 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней». Рабочие поверхности ПЦР-боксов контаминировали геномной ДНК или бактериальной культурой Escherichia coli 1257, обрабатывали аэрозолями исследуемых ДС и анализировали степень деградации ДНК.
Штаммы и условия культивирования
В экспериментах использовали штамм E. coli 1257, полученный из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ Оболенск» (B-8556). Культивирование E. coli 1257 проводили в жидкой питательной среде «ГРМ-бульон» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) при 37°С в течение 18 ч в условиях аэрации при 150 об/мин и на плотной питательной среде «ГРМ-агар» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) при температуре 37° в течение 24 ч.
Выделение геномной ДНК
Выделение геномной ДНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции из бактериальной
культуры E. coli 1257 [14]. Лизис клеток проводили при добавлении 30 мкл 10% SDS-буфера и протеиназы К. Затем к клеточному лизату добавляли 0.5 мл смеси фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1. Образцы перемешивали на Вортекс-шейкере (Biosan, Рига, Латвия) и центрифугировали в течение 10 мин при 12000 g и температуре 4°. Далее отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую НК. К супернатанту добавляли изопропанол в количестве 80% от объема образца и насыщенный раствор NaCl в количестве 1/9 от объема. Пробы инкубировали 20 мин при температуре 20° с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g. К полученному осадку добавляли 400 мкл 70% этанола и центрифугировали 10 мин при 12000 g. Удаляли супернататант и подсушивали образцы до полного испарения спирта. К осадку добавляли 20 мкл однократного ТЕ-буфера pH 8.0 (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА). Концентрацию ДНК в пробах определяли спектро-фотометрически (NanoDrop, Thermo Scientific, США). Полученные образцы использовали для определения ДНК методом ПЦР. Оставшийся материал хранили при температуре -20°.
Оценка деконтаминирующей активности дезинфектантов в отношении НК
Культуру E. coli 1257 выращивали в жидкой питательной среде «ГРМ-бульон» и осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин при комнатной температуре, затем проводили трехкратную отмывку клеток в фосфатно-солевом буфере и выделение НК. В качестве образца ДНК использовали амплификат, полученный в реакции со специфичными праймера-ми 16S рРНК. Ампликоны в концентрации 1*105 ко-пий/мкл наносили на рабочую поверхность бокса в десяти независимых точках и высушивали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Для контроля уровня исходной контаминации отбирали пробы ДНК с пяти точек рабочей поверхности бокса. Далее проводили аэрозольную обработку внутреннего пространства бокса исследуемыми дезинфектантами при различных режимах деконтаминации. В качестве отрицательного контроля использовали воду в том же объеме. После экспозиции с оставшихся пяти точек брали смывы, переносили их в раствор нейтрализатора (1.0% раствор тиосульфата натрия) на 10 мин и помещали в отдельные микропробирки с ТЕ-буфером (pH 8.0) (Евроген, Москва, Россия). Из полученных образцов, как описано выше, проводили выделение НК, которую использовали в качестве матрицы при проведении количественной ПЦР в режиме реального
времени (РТ-ПЦР) с использованием праймеров гена рибосомальной РНК (рРНК) 16S рРНК.
Отсутствие ингибирования ПЦР исследуемыми средствами подтверждали с помощью внутреннего контроля, как описано у Fischer et al. [11].
Обеззараживание бактериальных культур и НК
Дезинфекцию рабочих поверхностей бокса, загрязненных суточной культурой E. coli 1257, проводили совместно с деконтаминацией внутриклеточной ДНК. Суточную культуру, выращенную на плотной питательной среде «ГРМ-агар», суспендировали в физиологическом растворе до мутности, эквивалентной 3.0 по стандарту МакФарланда (1.0*109-2.0*109 KOE/мл). Полученную бактериальную суспензию наносили на рабочую поверхность бокса в десяти независимых точках и высушивали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Для контроля уровня исходной обсемененности брали смывы с пяти точек рабочей поверхности бокса. Аэрозольную обработку проводили, как описано ранее, затем из отобранных проб высевали по 0.1 мл на плотную питательную среду «ГРМ-агар», а также выделяли НК и проводили количественную РТ-ПЦР.
Аэрозольная обработка рабочих поверхностей боксов
Внутреннее пространство бокса (0.5 м3) заполняли аэрозолем исследуемых ДС с помощью установки «Мобильный гигиенический центр» (ООО «АСКМ», Санкт-Петербург, Россия). Дисперсность аэрозоля составляла 20-50 мкм (влажный туман) при расходе рабочего раствора 60-200 мл/м3. Время экспозиции после обработки составляло 15 и 30 мин. Распределение аэрозоля по поверхностям бокса определяли экспериментально. Для этого на горизонтальных и вертикальных поверхностях размещали предварительно взвешенные тест-объекты из фильтровальной бумаги размером 10*10 см2 и распыляли 3% раствор ПВ. Объем осажденного раствора рассчитывали по изменению массы тест-объектов после седиментации аэрозоля на поверхности (плотность растворов исследуемых веществ была близка к единице).
Постановка количественной РТ-ПЦР
Количество остаточной ДНК определяли методом РТ-ПЦР на приборе CFX96-touch (BioRad, США) с использованием реактивов qPCRmixHS SYBR («Евроген», Москва, Россия) и специфичных праймеров 16S рРНК. В исследовании использовали
праймеры 16S F (5'-CGGAAACGGGCGCTAAT-3') и 16S R (5'-CCCCACTTTCTCCCTCAGG-3') [14]. Синтез оли-гонуклеотидов для исследования осуществляли в ООО «Синтол» (Москва, Россия).
Реакцию повторяли три раза в соответствии с программой: 95°С - 5 мин (95°С - 20 сек, 61°С - 20 сек, 72°С - 30 сек) * 40 циклов.
Статистический анализ данных
Полученные результаты нормировали по методу Pfaffl [16]. Относительный коэффициент экспрессии
E ДCq;GOI
(R) вычисляли по формуле R=—GO^f, где Acq.GOI - из-
E REF
менение порогового цикла гена интереса; Acq;REF -изменение порогового цикла референсного гена; E - эффективность реакции. Эффективность реакции рассчитывали путем усреднения эффективности генов во всех лунках при проведении ПЦР в режиме реального времени для каждого гена (E=1.8). Значения изменения порогового цикла референсного гена принимали за ноль. Эффективность деконтаминации поверхностей от микроорганизмов и НК представляли в виде процентных долей. Степень деградации ДНК рассчитывали по формуле Ев^тттЕда согласно
Champlot et al. [8]. Эффективность обеззараживания
рассчитывали по формуле Edec=1 , где Nd - КОЕ на
—c
чашке Петри после обработки ДС; Nc - КОЕ на чашке Петри в контроле (обработка водой).
Обработку и интерпретацию данных осуществляли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism версии 8.0.1 для Windows (GraphPad Software, США, www.graphpad.com). Статистический анализ проводился с использованием непарного t-теста Стьюдента при уровне значимости p<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Определение расхода рабочего раствора
Важным параметром при аэрозольной обработке поверхностей является расход рабочего раствора, поскольку объем распыленной жидкости влияет на количество осажденных частиц. Количество осажденного раствора после седиментации аэрозоля определяли по изменению массы тест-объектов, размещенных на горизонтальных и вертикальных поверхностях. Массу тест-oбъектов сравнивали до и после обработки аэрозолем.
При расходе рабочего раствора 40 мл/м3 не наблюдалось изменения веса исследуемых тест-объектов. Увеличение объема распыляемой жидкости до
80 мл/м3 выявило наличие небольшого количества осажденного раствора (2-4 мл/м2) на тестируемых объектах. При расходе средства 100 мл/м3 объем осажденного раствора на горизонтальной поверхности составил 20 мл/м2, на вертикальных - 10-13 мл/м2.
При расходе средства 200 мл/м3 наблюдалось двукратное увеличение объема осажденного раствора как на горизонтально, так и на вертикально расположенных поверхностях (Рис. 1). На основании проведенных экспериментов для дальнейших исследований был выбран расход раствора средства в диапазоне от 60 до 200 мл/м3.
Деконтаминация поверхностей от НК
Исследование деконтаминирущей активности дезинфицирующих веществ в отношении коротких фрагментов ДНК размером 94 п. н. проводили аэрозольным методом в условиях, имитирующих загрязнение внутренних поверхностей бокса продуктом ПЦР. Эффективность деконтаминации оценивали по уровню представленности НК в смывах с рабочих поверхностей микробиологических боксов до и после обработки аэрозолями исследуемых соединений. В качестве объектов исследования были выбраны хлорактивные и кислородактивные соединения, перечень и режимы применения которых были определены в ранее проведенных исследованиях [13].
Хлорактивные соединения
Аэрозольная обработка боксов соединениями на основе ДХ, ДХЦК и ГН при расходе рабочего раствора 60 мл/м3 не приводила к деградации нанесенной ДНК. Не было выявлено достоверных различий между
опытными и контрольными образцами у всех соединений во всех режимах обработки. При увеличении расхода рабочих растворов до 80 мл/м3 только ГН обеспечивал достоверное снижение уровня представленности ампликонов в пробах на порядок относительно контроля при экспозиции 30 мин (Рис. 2).
Целевые ДНК фрагменты не были обнаружены при обработке бокса 0.03% раствором ДХ при расходе рабочего раствора 100 мл/м3 и экспозиции 30 мин. Увеличение расхода до 200 мл/м3 позволяло снизить концентрацию ДХ до 0.02% при том же времени экспозиции, а увеличение концентрации до 0.03% - сократить время экспозиции до 15 мин (рис. 2А).
Минимальная концентрация ДХЦК, приводящая к разрушению ДНК в течение 30 мин, составила 0.02% при расходе рабочего раствора 100 мл/м3. При увеличении расхода средства до 200 мл/м3 время обработки снизилось до 15 мин (Рис. 2Б).
ГН обладал деконтаминирующей активностью в отношении НК в концентрации 0.1% при расходе раствора 100 мл/м3 и времени экспозиции 15 мин (Рис. 2В).
Кислородактивные соединения
В качестве кислородактивных соединений в исследовании использовали ПВ и НУК. При расходах рабочих растворов от 60 до 80 мл/м3 наблюдали лишь незначительное снижение уровня представленности ампли-конов в пробах относительно контрольных образцов. Аэрозольная обработка внутреннего пространства бокса растворами ПВ и НУК в концентрациях 2.0% и 0.24% соответственно вызывала деструкцию НК при расходе средства 100 мл/м3 и времени экспозиции 15 мин (Рис. 3).
60
Объем распыленного раствора, мл/м3 горизонтальные поверхности вертикальные поверхности
Рис. 1. Осаждение аэрозоля на поверхностях бокса микробиологической безопасности.
ё к к о и (и О.
и
ю-5-
10"6'
и Ю-7-
о к Я"
4 Ю-8'
-е-
о о
И 15
3
X
|ю-10'
10
1-9.
§ю-п
н
о
пв П , , 1 ,
. е 9? фй 1 1 1 0
- ! У ! 0 * □
- -
контроль 0.01% 0.02% 0,01% 0.02% 0.01% 0.02% 0.01% 0.02%
60 мл/м
80 мл/м
100 мл/м3
200 мл/м
Концентрация и расход рабочего раствора дихлоризоциануровой кислоты
Рис. 2. Деконтаминирующая активность хлорактивных ДС; А - диоксид хлора (ДХ), Б - дихлоризоциануровая кислота (ДХЦК), В - гипохлорит натрия (ГН), ш - отсутствие достоверных различий, (*) означает р<0.05 согласно ^критерию Стьюдента.
Деконтаминация поверхностей от бактерий и внутриклеточной ДНК
Для определения режимов деконтаминации поверхностей от бактерий с одновременным разрушением внутриклеточной ДНК проводили аэрозольную обработку боксов при расходе рабочего раствора 100 мл/м3 в различных концентрациях. Эффективность деконтаминации исследуемыми растворами определяли по снижению уровня обсемененности поверхностей бактериальными клетками и степени деградации их ДНК.
Хлорактивные соединения
Аэрозольная обработка боксов 0.05% раствором ДХ при времени экспозиции 30 мин приводила
к разрушению внутриклеточной ДНК, при этом минимальная бактерицидная концентрация (МБК) составила 0.02% при тех же показателях расхода раствора и времени экспозиции (Рис. 4А). Распыление ДХЦК в концентрации 0.0075% при экспозиции 30 мин обеспечивало полную элиминацию бактерий на внутренних поверхностях бокса. Увеличение концентрации ДХЦК до 0.03% приводило к деградации ДНК (Рис. 4Б). В отличие от других хлорактивных соединений, ГН обеспечивал деконтаминацию поверхностей от бактерий и НК при одинаковых концентрациях. Эффективный режим применения ГН: 0.1% раствор при расходе 100 мл/м3 и времени экспозиции 15 мин (Рис. 4В).
Рис. 3. Деконтаминирующая активность кислородактивных ДС; А - перекись водорода (ПВ), Б - надуксусная кислота (НУК), ш -отсутствие достоверных различий, (*) означает р<0.05.
Рис. 4. Деконтаминирующая активность хлорактивных средств в отношении бактерий и нуклеиновых кислот; А - диоксид хлора (ДХ), Б - дихлоризоциануровая кислота (ДХЦК), В - гипохлорит натрия (ГН).
Кислородактивные соединения
Отсутствие внутриклеточной ДНК в пробах наблюдали при обработке бокса 3.0% раствором ПВ и времени экспозиции 15 мин. Минимальная бактерицидная концентрация ПВ в тех же режимах применения составила 2.0% (рис. 5А). Использование 0.06% раствора НУК вызывало разрушение бактериальных клеток, однако не приводило к деконтаминации поверхностей от НК. При увеличении концентрации раствора до 0.24% наблюдали полное отсутствие бактерий и ДНК на тестируемых поверхностях (Рис. 5Б).
Сравнение режимов аэрозольной деконтаминации
Сравнение режимов аэрозольной обработки при расходе рабочих растворов 100 мл/м3 выявило различия в эффективных концентрациях исследованных
соединений, применяемых для деконтаминации лабораторных поверхностей от бактериального загрязнения и НК.
Выявлена корреляция между эффективной концентрацией ДХ и типом контаминации поверхностей (бактерии или ампликоны ДНК), при этом для разрушения внутриклеточной ДНК требовалось увеличение концентрации рабочего раствора. Аналогичные результаты наблюдали при обработке поверхностей растворами ПВ. Показано, что бактерицидная концентрация НУК в четыре раза меньше, чем концентрация, необходимая для удаления НК. В экспериментах с использованием ДХЦК наблюдали зависимость эффективной концентрации рабочего раствора от типа контаминации. Однако при использовании ГН в качестве активного компонента рабочего раствора такая зависимость не наблюдалась (Табл. 1).
Рис. 5. Деконтаминирующая активность кислородактивных средств в отношении бактерий и нуклеиновых кислот; А - перекись водорода (ПВ), Б - надуксусная кислота (НУК).
Volume 10 Number 1 2023 9 mir-journal.org
Таблица 1. Концентрации рабочих растворов ДС, эффективные для аэрозольной дезинфекции и деконтаминации поверхностей от НК
Активное вещество Концентрация активного вещества (%) в рабочем растворе Время экспозиции, мин
Бактерии Ампликоны Внутриклеточная ДНК
Диоксид хлора (ДХ) 0.03 0.03 0.05 30
Дихлоризоциануровая кислота (ДХЦК) 0.0075 0.02 0.03 30
Гипохлорит натрия (ГН) 0.1 0.1 0.1 15
Пероксид водорода (ПВ) 2.0 2.0 3.0 15
Надуксусная кислота (НУК) 0.06 0.24 0.24 30
ОБСУЖДЕНИЕ
Классические методы деконтаминации, такие как протирание или орошение, не обеспечивают полного удаления НК с труднодоступных поверхностей. При обработке сложных поверхностей большой площади предпочтительнее использовать аэрозольный метод деконтаминации. В настоящем исследовании мы описали метод обеззараживания поверхностей в лабораториях, использующих МАНК, от бактерий и НК аэрозолями ДС на основе хлорактивных и кислоро-дактивных соединений.
Эксперименты по оценке распределения аэрозоля на тест-поверхностях выявили наличие зависимости объема осажденного аэрозоля от расхода рабочего раствора. При распылении раствора ДС в количестве 60 мл/м3 объем осажденного раствора составил 1-2 мл/м2. Повышение расхода до 100 мл/м3 способствовало увеличению объема осажденного раствора в 10 раз. Предположительно, при данном расходе происходило перенасыщение воздушного пространства боксов частицами аэрозоля, что приводило к их коагуляции и последующему осаждению на поверхность [17].
В ранее проведенных исследованиях [13] для де-контаминации от НК методом протирания применялся 0.01% раствор ДХ при расходе 150 мл/м2. Результаты наших экспериментов показали, что при аэрозольной деконтаминации поверхностей от ам-пликонов эффективная концентрация ДХ составляет 0.03% при расходе 100 мл/м3, при этом на 1м2 поверхности осаждается 10-20 мл рабочего раствора. Выявлено, что разрушение внутриклеточной ДНК происходит при более высокой концентрации ДХ (0.05%), чем инактивация бактериальных клеток (0.02%). Полученные результаты согласуются с данными исследования, представленными учеными из Китая [18].
При использовании ДХЦК наблюдались аналогичные результаты. В случае деконтаминации ам-пликонов концентрации растворов при протирании
и применении аэрозолей отличались в два раза, а при обеззараживании бактерий и деконтамина-ции от внутриклеточной ДНК - в четыре раза. Разница в концентрациях при протирании и применении аэрозолей, предположительно, обусловлена тем, что при распылении часть активного вещества теряется в виде газообразного хлора [19]. В соответствии с МУ 1.3.2569-09 деконтаминацию поверхностей от НК необходимо проводить протиранием 0.2% раствором средства ДП-2Т. Проведенные исследования показали, что минимальная эффективная концентрация ДХЦК при применении аэрозолей в 10 раз меньше и составляет 0.02%.
ГН является сильным окислителем, который эффективен против широкого спектра бактерий и вирусов [20-24]. В исследовании ВаПаПупе et а1. [25] показано, что распыление 1% раствора ГН на поверхность приводит к разрушению нанесенной на нее ДНК в течение 5 мин. В экспериментах №^оп et а1. [3] показана эффективность применения ГН в концентрации 0.4% для удаления НК с поверхностей методом протирания. Проведенные нами исследования выявили, что эффективная концентрация ГН при аэрозольной деконтаминации поверхностей от ампликонов, бактерий и их ДНК составляет 0.1%.
ПВ широко применяется как в виде жидкости, так и аэрозоля при обеззараживании различных объектов [26-28]. Свободные перекисные радикалы вызывают окислительное повреждение НК [29]. Результаты исследований показали, что воздействие 2% раствора ПВ приводит к полному разрушению ампликонов и частичной деградации внутриклеточной ДНК. При необходимости удаления бактериальных загрязнений совместно с разрушением внутриклеточной ДНК следует увеличить концентрацию раствора ПВ до 3%. Полученные результаты согласуются с данными исследования Афонюшкина с соавт. [30], показавшими, что применение 2% раствора ПВ обеспечивает инактивацию плазмид и снижает концентрацию хромосомной ДНК а. perfringens в 28-49 раз.
НУК обладает дезинфицирующей активностью в отношении бактерий, грибков, вирусов и спор [31, 32]. Она разрушает сульфгидрильные (-SH) и дисуль-фидные (S-S) связи в белках и важные компоненты в мембранах клетки. Гидроксильные радикалы, образующиеся при ее разложении, разрушают клеточные стенки бактерий и приводят к денатурации ДНК [32]. Несмотря на это, в исследовании Zhang et al. [33] показано, что применение растворов НУК способствует лишь частичной деградации бактериальных плазмид и других мобильных генетических элементов. Эти данные согласуются с результатами проведенных нами экспериментов, в которых показано, что для разрушения НК концентрация рабочих растворов НУК должна быть в четыре раза выше, чем при проведении антибактериальной обработки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выявлены эффективные режимы применения хло-рактивных и кислородактивных ДС для аэрозольной
деконтаминации лабораторных поверхностей от НК. Оптимальный расход рабочих растворов при обработке ПЦР-боксов составил 100 мл/м3, что эквивалентно осаждению ДС раствора на поверхность боксов на уровне 10-20 мл/м2. По сравнению с протиранием при применении ДХ и ДХЦК в виде аэрозолей требовалось увеличение концентрации рабочих растворов в 3 и 2 раза соответственно. При этом эффективные рабочие концентрации растворов ГН, ПВ и НУК не различались в зависимости от способа обработки. Показаны различия в рабочих концентрациях исследуемых ДС при проведении аэрозольной дезинфекции и деконта-минации от НК. При обработке с использованием ПВ и ГН требовалось наименьшее время экспозиции, при этом ГН обладает более низкой коррозионной активностью, что является несомненным преимуществом. Подобранные режимы аэрозольного применения ДС позволяют проводить эффективную деконтамина-цию различных поверхностей сложной конфигурации в лабораториях и снизить токсическую нагрузку на человека и коррозионную на оборудование.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Fischer M, Renevey N, Thür B, Hoffmann D, Beer M, Hoffmann B. Efficacy assessment of nucleic acid decontamination reagents used in molecular diagnostic laboratories. PLoS One 2016; 11(7), e0159274. doi: 10.1371/journal.pone.0159274.
2. Абуева АИ, Муратова ЮО, Ткаченко ГА, Спиридонов ВА, Антонов ВА. Дезинфектанты как средства для ДНК-деконтаминации. Дезинфекционное дело 2015; 4(94), 31-36.
3. Nilsson M, De Maeyer H, Allen M. Evaluation of different cleaning strategies for removal of contaminating DNA molecules. Genes (Basel) 2022; 13(1), 162. doi: 10.3390/genes13010162.
4. Gefrides LA, Powell MC, Donley MA, Kahn R. UV irradiation and autoclave treatment for elimination of contaminating DNA from laboratory consumables. Forensic Sci Int Genet 2010; 4(2), 89-94. doi: 10.1016/j.fsigen.2009.06.008.
5. Wu Y, Wu J, Zhang Z, Cheng C. DNA decontamination methods for internal quality management in clinical PCR laboratories. J Clin Lab Anal 2018; 32(3), e22290. doi: 10.1002/jcla.22290.
6. Silkie SS, Tolcher MP, Nelson KL. Reagent decontamination to eliminate false-positives in Escherichia coli qPCR. J Microbiol Methods 2008; 72(3), 275-82. doi: 10.1016/j.mimet.2007.12.011.
7. Philipp S, Huemer HP, Irschick EU, Gassner C. Obstacles of multiplex real-time PCR for bacterial 16S
rDNA: primer specifity and DNA decontamination of Taq polymerase. Transfus Med Hemother 2010; 37(1), 21-8. doi: 10.1159/000265571.
8. Champlot S, Berthelot C, Pruvost M, Bennett EA, Grange T, Geigl EM. An efficient multistrategy DNA decontamination procedure of PCR reagents for hypersensitive PCR applications. PLoS One 2010; 5(9), e13042. doi: 10.1371/journal.pone.0013042.
9. Lin J, Yan D, Fu J, Chen Y, Ou H. Ultraviolet-C and vacuum ultraviolet inducing surface degradation of microplastics. Water Res 2020; 186, 116360. doi: 10.1016/j.watres.2020.116360.
10. Beja-Pereira A, Oliveira R, Alves PC, Schwartz MK, Luikart G. Advancing ecological understandings through technological transformations in noninvasive genetics. Mol Ecol Resour 2009; 9(5), 1279-301. doi: 10.1111/j.1755-0998.2009.02699.x.
11. Espy MJ, Smith TF, Persing DH. Dependence of polymerase chain reaction product inactivation protocols on amplicon length and sequence composition. J Clin Microbiol 1993; 31(9), 2361-5. doi: 10.1128/jcm.31.9.2361-2365.1993.
12. Кузин ВВ, Колупаева НВ, Грищенко НС, Рудницкая ТИ, Тюрин ЕА, Ганина ЕА и др. Бесконтактные технологии в системе противоэпидемических мероприятий как метод борьбы с возбудителями социально-значимых инфекций. Дезинфекционное дело. 2021; 1(115), 5-16.
13. Кузин ВВ, Колупаева НВ, Кузина ЕС, Потапов ВД. Исследование деконтаминирующей активности дезинфицирующих средств различных классов в отношении нуклеиновых кислот. Дезинфекционное дело 2022; 1(119), 14-20.
14. Kochl S, Niederstatter H, Parson W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods Mol Biol 2005; 297, 13-30. doi: 10.1385/ 1-59259-867-6:013.
15. Lane DJ. 16S/23S rRNA Sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. E. Stackebrandt and M. Goodfellow, eds. New York, NY, John Wiley and Sons, 1991, 115-175.
16. Ganger MT, Dietz GD, Ewing SJ. A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments. BMC Bioinformatics 2017; 18(1), 534. doi: 10.1186/s12859-017-1949-5.
17. Yu H, Gu H, Sun Z, Zhou Y, Chen J, Li Y. Experimental and numerical study on the gravitational deposition and coagulation of aerosols. Frontiers in Energy Research 2022, 10, 840503. doi: 10.3389/ fenrg.2022.840503.
18. Xue B, Jin M, Yang D, Guo X, Chen Z, Shen Z et al. Effects of chlorine and chlorine dioxide on human rotavirus infectivity and genome stability. Water Res 2013; 47(10), 3329-38. doi: 10.1016/j. watres.2013.03.025.
19. Palcso B, Moldovan Z, Suvegh K, Herczegh A, Zelko R. Chlorine dioxide-loaded poly (acrylic acid) gels for prolonged antimicrobial effect. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2019; 98, 782-8. doi: 10.1016/j. msec.2019.01.043.
20. Dancer SJ. Controlling hospital-acquired infection: focus on the role of the environment and new technologies for decontamination. Clin Microbiol Rev 2014; 27(4), 665-90. doi: 10.1128/CMR.00020-14.
21. Gabbert L, Neilan J, Rasmussen M. Recovery and chemical disinfection of foot-and-mouth disease and African swine fever viruses from porous concrete surfaces. J Appl Microbiol 2020; 129, 1092-101. doi: 10.1111/jam.14694.
22. Viscusi DJ, Bergman MS, Eimer BC, Shaffer RE. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Ann Occup Hyg 2009; 53(8), 815-27. doi: 10.1093/annhyg/mep070.
23. Vo E, Rengasamy S, Shaffer R. Development of a test system to evaluate procedures for decontamination of respirators containing viral droplets. Appl Environ Microbiol 2009; 75(23), 7303-9. doi: 10.1128/ AEM.00799-09.
24. Wang J, Feng H, Zhang S, Ni Z, Ni L, Chen Y et al. SARS-CoV-2 RNA detection of hospital isolation wards hygiene monitoring during the Coronavirus Disease 2019 outbreak in a Chinese hospital. Int J Infect Dis 2020; 94, 103-6. doi: 10.1016/j.ijid.2020.04.024.
25. Ballantyne KN, Salemi R, Guarino F, Pearson JR, Garlepp D et al. DNA contamination minimisation - finding an effective cleaning method. Aust J Forensic Sci 2015; 47(4), 1-12. doi: 10.1080/00450618.2015.1004195.
26. Andersen BM, Rasch M, Hochlin K, Jensen FH, Wismar P, Fredriksen JE. Decontamination of rooms, medical equipment and ambulances using an aerosol of hydrogen peroxide disinfectant. J Hosp Infect 2006; 62(2), 149-55. doi: 10.1016/j.jhin.2005.07.020.
27. Andersen BM, Syversen G, Thoresen H, Rasch M, Hochlin K, Seljordslia B et al. Failure of dry mist of hydrogen peroxide 5% to kill Mycobacterium tuberculosis. J Hosp Infect 2010; 76(1), 80-3. doi: 10.1016/j.jhin.2010.03.013.
28. Cadnum JL, Mana TS, Jencson A, Thota P, Kundrapu S, Donskey CJ. Effectiveness of a hydrogen peroxide spray for decontamination of soft surfaces in hospitals. Am J Infect Control 2015; 43(12), 1357-9. doi: 10.1016/j.ajic.2015.07.016.
29. Urban MV, Rath T, Radtke C. Hydrogen peroxide (H2O2): a review of its use in surgery. Wien Med Wochenschr 2019; 169(9-10), 222-5. doi: 10.1007/s10354-017-0610-2.
30. Афонюшкин ВН, Табанюхов КА, Черепушкина ВС, Хоменко ЮС, Татарчук ОП. Влияние дезинфицирующих средств на основе персульфата калия, перекиси водорода, глутаральдегида и четвертичных аммонийных соединений на генетический материал бактериальных патогенов, специфичных для мясоперерабатывающей промышленности. Теория и практика переработки мяса 2016; 1(1), 54-61. doi: 10.21323/2114-441X-2016-1-54-61.
31. Aranke M, Moheimani R, Phuphanich M, Kaye AD, Ngo AL, Viswanath O, Herman J. Disinfectants in interventional practices. Curr Pain Headache Rep 2021; 25(4), 21. doi: 10.1007/s11916-021-00938-3.
32. Ao XW, Eloranta J, Huang CH, Santoro D, Sun WJ, Lu ZD, Li C. Peracetic acid-based advanced oxidation processes for decontamination and disinfection of water: a review. Water Res 2021; 188, 116479. doi: 10.1016/j.watres.2020.116479.
33. Zhang C, Brown PJB, Hu Z. Higher functionality of bacterial plasmid DNA in water after peracetic acid disinfection compared with chlorination. Sci Total Environ 2019; 685(1), 419-27. doi: 10.1016/ j.scitotenv.2019.05.074.
