CC BY
40
2006
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА_Сер. 3. Вып. 3
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА УДК 539.19+612.822.3
Б. Ф. Щеголев, И. В. Рогачевский, М. Л. МакКи
ДЕФЕНСИНЫ КРОЛИКА №-1, ОТ-4 И №-5. СТРУКТУРА И ОСОБЕННОСТИ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНОГО СВЯЗЫВАНИЯ
Дефенсины представляют собой небольшие эндогенные пептиды (29-38 аминокислотных остатков, впервые выделены из нейтрофилов человека, кролика и крысы), обладающие широким спектром антимикробного действия. В настоящее время охарактеризовано значительное число молекул дефенсинов и дефенсиноподобных белков различного происхождения [1, 2, 11, 12, 19], разработаны общие концепции разнообразных механизмов их биологического действия на клеточные мембраны бактерий, вирусов и эритроцитов [5, 10, 14, 16, 17]. Однако немногое известно о пространственном строении подобных пептидов, поскольку весьма ограниченное число работ посвящено определению их трехмерной структуры методами спектроскопии ЯМР и рентгеноструктурного анализа [4, 7, 11, 19]. В то же время, основываясь на представлениях о пространственном строении дефенсинов, можно в значительной мере прояснить детальный механизм их действия на молекулярном уровне и объяснить разницу в степени их активности, обусловленную структурными различиями.
В этой связи представляется перспективным применение для исследования дефенсинов квантово-химических расчетных методов, с помощью которых можно не только оптимизировать геометрические параметры молекул пептидов разной степени сложности, но и проводить поиск количественных параметров, коррелирующих с биологической активностью рассматриваемых молекул.
Целью настоящей работы является сравнительный анализ пространственного строения молекул дефенсинов кролика КР-1, ЫР-4 и ЫР-5 и предложение на основании полученных расчетных данных возможного механизма экспериментально обнаруженной способности указанных пептидов снижать потенциалочувствительность медленных (тетродотоксиннечувствительных) натриевых каналов.
Методы исследования. На первом этапе проведения расчетов были созданы линейные конформации молекул дефенсинов ЫР-1, ЫР-4 и ЫР-5 с использованием программного пакета НУРЕКСНЕМ [8] на основании данных об их первичной аминокислотной последовательности: Val-Val-Cys-Ala-Cys-Aгg-Arg-Ala-Leu-Cys-Leu-Pгo-Arg-Glu-Arg-Aгg-Ala-Gly-Phe-Cys-Arg-Ile-Aгg-Gly-Aгg-Ile-His-Pro-Leu-Cys-Cys-Aгg-Arg(NP-l), Val-Seг-Cys-Thг-Cys-Aгg-Aгg-Phe-Ser-Cys-Gly-Phe-Gly-Glu-Arg-Ala-Seг-Gly-Ser-Cys-Thr-Val-Asn-Gly-Vai-Arg-His-Thr-Leu-Cys-Cys-Arg-Aгg(NP-4),Val-Phe-Cys-Thr-Cys-Arg-Gly-Phe-Leu-Cys-Gly-Ser-Gly-Glu-Aгg-Ala-Ser-Gly-Ser-Су5-ТЬг-11е-А5п-С1у-Уа1-А^-Ш5-ТЬг-Ьеи-Су5-Су8-А^-А^ (№-5) [1], причем три внутримоле-
© Б. Ф. Щеголев, И. В. Рогачевский, М. Л. МакКи, 2006
кулярные дисульфидные связи Cys3-Cys3\ Cys^-Cys20, Cysul-Cys30 (нумерация производится от Val1 к Arg33), присутствующие в указанных молекулах, были построены вручную. Затем также с применением HYPERCHEM была осуществлена полная оптимизация геометрических характеристик молекул дефенсинов методом молекулярной механики с использованием силового поля AMBER [18]. Наборы геометрических параметров, полученных в рамках оптимизации методом молекулярной механики, использовались в качестве стартовых для последующей полной оптимизации геометрических параметров молекул дефенсинов NP-1, NP-4 и NP-5 полуэмпирическим методом AMI по программе GAUSSIAN 98 [6], реализованной на суперкомпьютере Сгау-J90-Unicos (США). Расчеты осуществлялись в приближении газовой фазы, эффекты сольватации не учитывались. Молекулы дефенсинов рассматривались в заряженной форме. Протонирован-ными полагались гуанидиновые группировки боковых цепей Arg и N-концевые аминогруппы, тогда как боковые цепи Glu14 и С-концевые карбоксильные группы считались отрицательно заряженными. Таким образом, общий заряд молекул NP-1, NP-4 и NP-5 составляет +9, +5 и +4 (в единицах заряда электрона) соответственно.
Результаты и их обсуждение. Структуры рассматриваемых молекул достаточно схожи: для молекул NP-4 и NP-5 по отношению к NP-1 степень гомологии составляет 51%, молекулы NP-4 и NP-5 еще ближе друг к другу по аминокислотному составу - степень гомологии составляет 85%. Этот факт определяет одинаковую топологию скелетов молекул NP-1, NP-4 и NP-5. На рисунке представлено пространственное расположение гидрофобных и гидрофильных остатков в молекулах дефенсинов, при этом гидрофобные группировки (Val, Ala, Leu, Ile, Phe) образуют «внутреннюю поверхность» молекулы, в то время как гидрофильные (Arg, Glu, Ser, Thr, His, Asn) группировки, ориентированные наружу, достаточно равномерно расположены на ее внешней поверхности. Разделенность в пространстве гидрофильных и гидрофобных функциональных групп объясняет амфипатические свойства рассматриваемых молекул. Можно ожидать, что амфипатические свойства молекулы NP-1 будут более выражены по сравнению с молекулами NP-4 и NP-5, поскольку в молекуле NP-1 присутствует практически равное количество гидрофильных и гидрофобных аминокислотных остатков (12 и 11), тогда как в состав молекул NP-4 и NP-5 входит большее количество гидрофильных аминокислот (в NP-4 17 гидрофильных и 7 гидрофобных; в NP-5 14 гидрофильных и 7 гидрофобных).
В работах [2, 3, 13] с помощью метода локальной фиксации потенциала было показано, что приложение дефенсинов NP-1 и NP-4 с внешней стороны мембраны нейронов спинальных ганглиев крыс приводит к снижению эффективного заряда активаци-онной воротной системы медленных натриевых каналов; процесс монотонным образом зависел от концентрации исследованных агентов. Применение уравнения Хилла позволило установить для молекул NP-1 и NP-4 величины константы диссоциации KD, составляющие 2 пмоль/л и 80 нмоль/л при значениях коэффициентов Хилла - 0,9 и 1,0 соответственно. Крайне низкие значения KD указывают на существование специфического рецептора связывания дефенсина, при этом связывание одной молекулы агониста приводит к изменению функционирования одного медленного натриевого канала.
Лиганд-рецепторное взаимодействие дефенсинов с рецептором нейрональной мембраны может осуществляться за счет образования одной или нескольких межмолекулярных водородных или солевых (солевой мостик) связей. Кроме протонов в образовании водородных связей участвуют, с одной стороны, атомы кислорода или азота в составе распознающего участка рецептора и, с другой - атомы кислорода или азота в составе гидрофильных функциональных групп боковых цепей молекулы дефенсина. По всей видимости, гидрофобные взаимодействия не могут вносить определяющий вклад в
NP-1
NP-4
Nt
NP-1
NP-4
NP-5
NP-1
NP-4
NP-5
Пространственная структура заряженных форм молекул дефенсинов NP-1, NP-4 и NP-5 по данным квантово-химических расчетов методом AMI.
Верхний ряд: строение пептидных скелетов молекул дефенсинов. Все атомы водорода, амидные атомы кислорода и атомы боковых цепей молекулы опущены. Черными кружками выделены атомы серы ди-сульфидных мостиков. Средний ряд: распределение гидрофобных групп в молекулах дефенсинов. Все атомы водорода и амидные атомы кислорода опущены (то же для нижнего ряда). Черными кружками выделены тяжелые атомы боковых цепей гидрофобных остатков: Val, Ala, Leu, Ile, Phe. Нижний ряд: распределение гидрофильных групп в молекулах дефенсинов. Черными кружками выделены тяжелые атомы боковых цепей гидрофильных остатков: Arg, Glu, Ser, Thr, His, Asn, а также N- и С-конце-вые группы.
энергетику лиганд-рецепторного связывания, поскольку, согласно результатам оптимизации, боковые цепи гидрофобных аминокислот ориентированы «внутрь» молекул дефенсинов. Участие гидрофобных аминокислотных остатков в межмолекулярных взаимодействиях требовало бы существенных энергетических затрат, связанных с изменением конформаций как боковых цепей аминокислот, так и молекул дефенсинов в целом.
Структурными элементами молекул дефенсинов, на которые следует обратить особое внимание, являются ß-повороты (тетрапептидная последовательность считается ß-поворотом, если расстояние С.(1) - С.(4) < 7 Â), поскольку из 4 составляющих их аминокислотных остатков второй и третий стерически доступны и ориентированы во внешнюю сторону молекулы, что облегчает их возможное вовлечение в межмолекулярные взаимодействия. В табл. 1 приведены тетрапептидные фрагменты в составе молекул NP-1, NP-4 и NP-5, расстояния Cá(l) - Cá(4) в которых удовлетворяют вышеуказанному критерию. Данные таблицы свидетельствуют о том, что в молекулах NP-1 и NP-4 наиболее стерически доступными гидрофильными аминокислотами, входящими в состав ß-поворотов, являются Arg и Glu, а в молекуле NP-5 еще и Ser и Thr.
Таблица 1. В-повороты в структуре молекул дефенсинов КР-1, NP-4 и NP-5: тетрапептидные фрагменты, образующие В-поворот, и расстояния СД1) - СД4) (Я, А) в них
NP-1 NP-4 NP-5
Фрагмент R, A Фрагмент R, А Фрагмент R,A
Ala4-Cys5-Arg6-Arg7 6,97 Arg6-Arg7-Phe-Ser9 5,84 Arg-Gly7-Phe8-Leu9 4,08
Cys-Arg6-Arg7-Ala6 5,40 Ser9-Cys10-GIy11-Phe'2 6,49 Leu9-Cys'"-GIy"- Ser'2 6,30
Arg^-Glu^-Arg^-Arg16 6,42 Phe'2-Gly13-Glu14-Arg15 6,59 Gly"-Ser,2-Gly,3-Gluu 5,84
Leu29-Cys30-Cys"-Arg32 6,25 Glu'4-Argi5-Ala16-Ser'7 5,20 Ser' 2-Gly'3-Glu14-Arg15 5,45
Gly^-Vaf-AiTf-His27 5,97 Gly18-Ser,9-CysM-Thr21 5,49
Val25-Arg^-Hls^-Thr28 6,77 Ser'^Cys^-Thr^'-Ile22 6,35
Arg26-His27-Thr?B-Leu29 6,55 Gl у24-Уа!25 - Arg26-His27 5,90
Thr^-Leu^-Cys^-Cys31 6,33 VaP-Arg^-His^-Thr28 6,66
Leu^-Cys^-Cys"-Arg12 5,76
Примечание. Жирным шрифтом выделены стерически доступные остатки в тетрапсптидных фрагментах.
Пространственное строение дефенсинов КР-2, отличающегося лишь одной аминокислотой от (А^13в №-1, Ьеи13в КР-2), и ЫР-5 было исследовано экспериментально методом двухмерной спектроскопии ЯМР в растворе 2НгО [7, 8, 17]. Показано, что изучаемые молекулы обладают схожей вторичной структурой, основными элементами которой являются: 1) антипараллельный В-слой в конформации шпильки (А^,6~ Сув30 в молекуле КР-2 и 5ег19-Ьеи2Э в молекуле №-5) с В-поворотом, состоящим из остатков 22-25, 2) трехскладчатый В-слой, включающий указанную В-шпильку и остатки 2-5, а также 3) петля А^-Суэ14, не обладающая однозначно определенной структурной организацией в растворе (в молекуле №-2 был обнаружен В-поворот Ьеии-С1и14). Геометрические параметры петли А^6-Суз14и ее положение по отношению к остальной части молекулы достаточно сильно варьируются, что было объяснено лабильностью пет-
ли Arg6-Cys14, причем в случае молекулы NP-2 структурная дезорганизация была большей, чем у молекулы NP-5.
Полученные нами результаты для дефенсинов NP-1 и NP-5 качественно согласуются с обсуждаемыми выше экспериментальными данными. В областях, включающих остатки 11 — 16 и 24—31, наблюдаются ß-повороты, топология молекул соответствует приведенным в работе [4, 12, 19] пространственным структурам молекул NP-2 и NP-5. Расхождения между полученными в настоящей работе структурами молекул дефенсинов и структурами, построенными на основании результатов экспериментов методом ЯМР-спектроскопии, в первую очередь, могут быть объяснены отсутствием учета эффектов сольватации в нашем рассмотрении. Хотя дефенсины и не являются абсолютно конформационно жесткими молекулами, их структуры, оптимизированные в рамках приближения газовой фазы, могут в начальном приближении служить удовлетворительными моделями для описания общих структурных характеристик указанных молекул в сольватированной фазе, а также для анализа стерической доступности и конформаци-онной свободы отдельных аминокислотных остатков.
При поиске потенциально ответственных за лиганд-рецепторное связывание функциональных групп необходимо также принимать во внимание их возможную вовлеченность в образование внутримолекулярных водородных и солевых связей. Длины и характер водородных связей в молекулах NP-1, NP-4 hNP-5 приведены в табл. 2. Из данных таблицы видно, что достаточно большое число водородных связей включает в свой состав атомы гидрофильных групп боковых цепей. Некоторая дополнительная стабилизация конформаций рассматриваемых дефенсинов осуществляется: 1) в молекуле NP-1 за счет образования внутримолекулярных солевых связей - между карбоксильной группой Glu1" и гуанидиновой группой Arg16 и между С-концевой карбоксильной группой и боковыми цепями Arg32 и Arg33; 2) в молекуле NP-4 за счет солевых мостиков между N-концевой аминогруппой и С-концевой карбоксильной группой, а также между карбоксильной группой Glu14 и гуанидиновой группой Arg15; 3) в молекуле NP-5 за счет солевых связей между карбоксильной группой Glu14 и гуанидиновой группой Arg" и между С-концевой карбоксильной группой и боковыми цепями Arg32 и Arg33. Таким образом, полностью не вовлеченными во внутримолекулярные взаимодействия остаются следующие гидрофильные функциональные группы боковых цепей: Arg6, Arg7 и Arg25 у молекулы NP-1; Ser2, Arg6, Ser9 и Ser19 у молекулы NP-4 и Thr4, Ser12, Ser17, Asn23 и Arg26 у молекулы NP-5.
Высокая степень гомологии и топологическое сходство рассматриваемых молекул дефенсинов позволяют предполагать общность механизма формирования лиганд-рецепторного комплекса для всех трех пептидов - за счет образования одной или нескольких водородных или солевых связей между атомами функциональных групп боковых цепей молекулы дефенсина и атомами распознающего участка рецептора. Только два аминокислотных остатка, включающие в свой состав атомы, способные образовывать водородные связи, присутствуют во всех трех молекулах - Arg и Glu.
Высказывалось предположение [3], что ответственной за лиганд-рецепторное связывание дефенсинов является карбоксильная группа боковой цепи Glu14, и различие в величинах Ки для молекул NP-1 и NP-4 определяется степенью ее вовлеченности во внутримолекулярные взаимодействия. Согласно приведенным в настоящей работе данным, карбоксильная группа Glu14 образовывает внутримолекулярные солевые связи во всех трех рассматриваемых молекулах, что не исключает полностью вероятность ее участия в формировании лиганд-рецепторного комплекса, но и не объясняет разницу по-
Таблица 2. Характер и длины водородных связей, присутствующих в молекулах дефенсинов „ ИР-4 и КР-5: (А) - расстояние О1 - Н, 112 (А) - расстояние О1 - X2
ЫР-1 №-5
Характер И.,, А И,, А Характер я,, А А Характер Я,, А И,, А
СО(Суз31)-ЫНДАг^') 2,11 2,95 СО(Уа1г')- 2,04 2,97 СО(С1у24)-ЫН(Н1з27) 2,03 2,97
СО(А1а4)-МН(Ьеи') 2,11 3,04 СО(Суз3)->Щ(ТЬг31) 2,08 3,06 СО(С1и'4)-КН(С1уи) 2,03 2,98
СО(Агё,:!)- 2,13 2,94 СО(С1ии)-ОН*(5ег17) 2,10 3,04 СО(ТЬг21)-ОН*(ТЬг21) 2,11 2,74
СО(Аг815)-ЫН(А1а'7) 2,13 2,95 СО(Аг^)-МН2*(Агяв) 2,14 2,87 СООН*(С1и14)-ЫН(Суз10) 2,11 2,96
СО(Суз!)-Ш(Суз5) 2,13 2,98 ОН*(ТЬг28)-КН(Ьеим) 2,15 2,93 СООН*(С1и14)-ЫН(Ьеиа) 2,13 3,01
СО(С1ии)-Ш*(А^15) 2,14 2,90 СО(А5пГ1)- 2,15 3,03 СО(С1и")-ЫН(А1а,с) 2,14 2,95
СО(А1а8)- 2,14 2,93 СО*(А5Пи)-ХН(\аР) 2,16 3,15 СО(ТЬг"8)-ОН*(ТЬгм) 2,15 2,75
СО(Ьеии)-№1(Суз") 2,15 2,97 ОН*(ТЬг4)-ЫНДАг^) 2,19 3,08 СО(С1у24)-ХН(ТЬг28) 2,16 2,98
СО(11е26)- 2,15 3,06 ССКБегУ ОН*(ТЬг") 2,19 3,08 ОН*(5ег19)-^Н(Су521') 2,17 2,86
СООН*(С1и14)-ЫЩЙи14) 2,16 2,93 СО(5ег'7)-Ш(Суз10) 2,19 3,09 СО(Суз5)~ МНДАг^2) 2,17 3,07
СО(Рго12)-ЫН*(Аг^6) 2,16 3,15 СО(Уа122)-КН(Аг§12) 2,20 3,10 ОН*(5ег,и)-ОН*(ТЬг21) 2,18 2,87
СО(Суз5)-ЫН(Аг^) 2,17 2,90 СО(С1у ")-ЫНДАг^5) 2,18 2,92
СО(Су530)- 2,17 2,97 СОСБег12)-ШДАг^) 2,19 2,94
СО(С1у'8)-МЩСуз20) 2,2 3,07 СО(ТЬг21)-№1(5ег19) 2,19 3,13
СО(Суз3)-Ш(Агё33) 2,20 3,07
Примечание. Водородные связи рассматриваются в форме 0'...Н-Х2, где Х=0 или N. Звездочкой отмечены группы, входящие в состав боковых цепей.
чти на пять порядков между величинами KD. Эти соображения указывают на участие в лиганд-рецепторном связывании дефенсинов нескольких гуанидиновых групп боковых цепей Arg.
В этой связи важно обратить внимание на общее число, расположение и стеричес-кую доступность гуанидиновых групп аргинильных остатков в молекулах дефенсинов. Молекула NP-1 содержит 10, молекула NP-4 - 6, а молекула NP-5 - 5 аргинильных остатков. Как показывают данные расчетов, не все они эквивалентны с точки зрения вовлеченности во внутримолекулярные взаимодействия и стерической доступности, что позволяет разбить их на три группы. В первую входят стерически доступные и не участвующие в образовании внутримолекулярных водородных связей гуанидиновые группы: Arg6, Arg7 и Arg25 у молекулы NP-1, Arg6 у молекулы NP-4 и Arg26 у молекулы NP-5. Вторая включает группы, стерически доступные, но вступающие во внутримолекулярные взаимодействия, что не исключает их возможного участия в лиганд-рецепторном связывании: Arg15, Arg16, Arg23, Arg32, Arg33 (NP-1), Arg7, Arg15, Arg26, Arg32 (NP-4) и Arg6, Arg15, Arg25 (NP-5). Третья состоит из стерически труднодоступных групп: Arg13, Arg21 (NP-1), Arg33 (NP-4), Arg32 (NP-5).
Труднодоступность четырех последних аргинильных остатков определяется следующими соображениями. Гуанидиновые группы Arg13 и Arg21 экранированы с внешней стороны молекулы NP-1 боковыми цепями Arg7, Argl5 и Arg23, Arg32соответственно. К тому же они задействованы в образовании внутримолекулярных водородных связей: CO(Arg13) - NH2*(Arg13), СО(А1а8) - NH2*(Arg13) и CO(Cys31) - NH2*(Arg21) (см. табл.2). Конформации боковых цепей Arg33 в молекуле NP-4 и Arg32 в молекуле NP-5 таковы, что гуанидиновые группы этих аргинильных остатков не оказываются ориентированными во внешнюю сторону молекул дефенсинов. Такое пространственное строение боковых цепей указанных аминокислот стабилизируется образованием водородных связей СО( Arg32) - NH2*(Arg33) в молекуле NP-4 и CO(Cys5) - NH2*(Arg32) в молекуле NP-5.
Поскольку предполагается, что молекулы дефенсинов обладают общим механизмом лиганд-рецепторного связывания, логично проводить поиск ответственных за связывание функциональных групп среди аминокислотных остатков, консервативных в рассматриваемом ряду молекул. Таковыми являются Arg6, Glu14, Arg15, Arg32 и Arg33 во всех трех молекулах, а также общий для молекул NP-1 и NP-4 аминокислотный остаток Arg7. Как указано выше, боковые цепи С-концевых Arg32 и Arg33 могут находиться в конформации, неблагоприятной для образования межмолекулярных водородных или солевых связей с их участием. Таким образом, наиболее вероятно, что основной вклад в формирование лиганд-рецепторного комплекса вносят некоторые из следующих остатков: Arg6, Arg7, Glu14, Arg15. Аминокислоты, находящиеся в ближайшем окружении указанных остатков, не являются консервативными. Изменение химической природы аминокислот, расположенных в непосредственной близости к тем остаткам, которые определяют способность молекул дефенсинов связываться с рецептором, может в существенной степени влиять на сродство дефенсинов к рецептору, проявляющееся в величине KD.
Еще одним фактором, способным влиять на селективность связывания и К0, является общий заряд молекулы дефенсина. В работе Р. Швицера [15] было исследовано влияние величины заряда (как положительного, так и отрицательного) 26 пептидных лигандов р- и ô-опиоидных рецепторов на параметры лиганд-рецепторного связывания ' и показано, что кроме классической комплиментарное™ лиганда и распознающего уча-
стка рецептора, процесс связывания существенно зависит от взаимодействия лиганда и клеточной мембраны в области, прилегающей к рецептору. Сродство к р-рецепторам возрастало с ростом величины положительного заряда лигандов, а сродство к 5-рецеп-торам - с ростом абсолютной величины отрицательного заряда. Предложенное объяснение наблюдаемой корреляции заключается в наличии вблизи р-рецептора анионной, а вблизи 5-рецептора катионной области, таким образом, возможность подхода лиганда к рецептору управляется электростатическими взаимодействиями. Похожий механизм может быть реализован и в случае лиганд-рецепторного связывания дефенсинов, если предполагаемый рецептор дефенсина лежит в анионной области нейрональной мембраны. Напомним, что все рассматриваемые в настоящей работе молекулы обладают положительным зарядом, однако заряд дефенсина NP-1 (+9) заметно больше, чем заряд NP-4 (+5).
К сожалению, на основании доступных экспериментальных данных не представляется возможным однозначно определить, с каким из типов мембранных рецепторов осуществляется связывание молекул дефенсинов. С определенностью можно утверждать лишь, что не происходит прямого взаимодействия с опиоидными рецепторами, связанными с медленными натриевыми каналами, поскольку введение неспецифического антагониста подобных рецепторов - налтрексона не блокировало действие дефенсинов [2, 13]. Невозможно также указать точное количество солевых или водородных связей, необходимых для образования лиганд-рецепторного комплекса, но с учетом вероятного вовлечения в их образование аргинильных остатков молекул дефенсинов можно предположить, что дефенсины обладают сродством к тем же классам рецепторов, что и агма-тин (декарбоксилированный аргинин, являющийся эндогенным агонистом I,- и 12-ими-дазолиновых рецепторов [9]).
Заключение. Квантово-химические расчеты могут оказать существенную помощь в объяснении механизма экспериментально установленной способности молекул дефенсинов рецептор-опосредованным образом снижать потенциалочувствительность медленных натриевых каналов сенсорных нейронов. Пока не подобран блокатор действия дефенсинов, невозможно установить, с каким типом мембранных рецепторов осуществляется взаимодействие указанных молекул. Однако на основании данных расчетов можно высказать определенные соображения относительно механизма связывания и строения рецептора, ответственного за связывание дефенсинов. По-видимому, взаимодействие дефенсинов с мембранным рецептором осуществляется за счет формирования одной или нескольких водородных и/или солевых связей с участием гуанидиновых групп аргинильных остатков (Arg6, Arg7, или Arg15) и/или карбоксильной группы боковой цепи Glu14 молекул дефенсинов с комплиментарными им атомами (или группами атомов) распознающего участка рецептора. Вероятно, что рецептор дефенсинов находится в анионной области нейрональной мембраны, а структурное сходство аргинильных остатков с естественным агонистом 1(- и 12-имидазолиновых рецепторов - агматином позволяют предполагать, что дефенсины связываются с рецептором одного из этих типов. Разница на пять порядков величин К0 молекул дефенсинов NP-1 и NP-4 может объясняться двумя факторами: различиями в химической природе аминокислот, находящихся в ближайшем окружении остатка, ответственного за лиганд-рецепторное связывание и электростатическим - большей величиной общего заряда молекулы NP-1. Более детальное объяснение механизма рецепторного связывания дефенсинов -выявление конкретных аминокислотных остатков, ответственных за связывание с рецептором, их числа, геометрических и электронных параметров, будет продолжено на
основании дальнейших экспериментальных и квантово-химических исследований, включающих синтез аналогов природных дефенсинов и их отдельных фрагментов с точечными мутациями, а также построение моделей пространственного строения подобных молекул с учетом эффектов сольватации.
Авторы выражают признательность за обсуждения выводов работы профессору
B. Н. Кокрякову.
Работа поддержана грантом Санкт-Петербургского научного центра 2004-2005 г.
Статья рекомендована проф. В.Н. Кокряковым. Summary
Shchegolev В. F., Rogachevsky I. V., McKee М. L. Structure and analgesic properties of rabbit defensins.
The full AMI semiempirical optimization for charged forms of defensins NP-1, NP-4 and NP-5 was performed. The conformation of the peptide backbone and side chains was investigated. The results obtained from these calculations suggested that the guanidine groups of Arg side chains or the carboxyl group of the Glu side chain could be crucial for the defensin binding to a receptor by forming one or several hydrogen bonds. It was proposed that the factors contributing to the difference in KD values for NP-1 and NP-4 action were the amount of the sterically accessible guanidine groups and the net charge of the molecule.
Key words-, defensin, quantumchemical calculations, analgesic affect, ligand-to-receptor binding, hydrogen bonds.
Литература
1. Кокряков В. H. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999. 2. Пла-хова В. В., Рогачевский И. В., Щеголев Б. Ф., МакКи М. Л., Кокряков В. Н., Алешина Г. М., Подзорова
C. А., Ноздрачев А. Д., Карымова Е. А., Крылов Б. В. Дефенсин NP-4 уменьшает потенциалочув-ствительность медленных натриевых каналов сенсорных нейронов // Сенсорные системы. 2005. Т. 19, № 2. С. 123-131. 3. Рогачевский И. В., Плахова В. Б., Щеголев Б. Ф., Ноздрачев А. Д., Крылов Б. В., Подзорова С. А., Кокряков В. Н. Рецептор дефенсина: возможный механизм снижения возбудимости мембраны сенсорного нейрона // ДАН. 2000. Т. 375. № 6. С. 843-847. 4. Bach А. С., SelstedM. Е., Pardi A. Two-dimensional NMR studies of the antimicrobal peptide NP-5 // Biochemistry. 1987. Vol. 14. N 1. P. 4389-4397. 5. Epand R. M., VogelH.J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1462. N 1. P. 11-28. 6. Frisch M.J., Trucks G. W., SchlegelH. В., Scuseria G. E., Robb M. A., CheesemanJ. R., Zakrzewski V. G., Montgomery J. A., Stratmann R. E., Burant J. C., Dapprich S., Millam J. M., Daniels A. D., Kudin K. N., Strain M. C., Farkas O., TomasiJ., Barone V., Cossi M., Cammi R., Mennucci В., Pomelli C., Adamo C., Clifford S., Ochterski J., Petersson G. A., Ayala P. Y., Cui Q., Morokuma K., Salvador P., DannenbergJ.J., Malick D. K., Rabuck A. D., Raghavachari K., ForesmanJ. В., CioslowskiJ., OrtizJ. V., BaboulA. G., Stefanov В. В., Liu G., Liashenko A., Piskorz P., Komaromi I., Gomperts R., Martin R. L., Fox D. J., Keith Т., Al-Laham M. A., Peng C. Y., Nanayakkara A., ChallacombeM., GillP.M. W.JohnsonB., Chen W., WongM. W.,AndresJ.L., Gonzalez C., Head-Gordon M., Replogle E. S., PopleJ. A. Gaussian 98, Revision A11.1, Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 2001. 7. Hill C. P., Yee J., Selsted M. E., Eisenberg D. Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimer: mechanisms of membrane permeabilization // Science. 1991. Vol. 251. N 5000. P. 1481-1485. 8. HyperChem Professional Release 5.1 (demonstration version). A Molecular Visualizati and Simulation Software Package. Gaainesvill, Florida: Hypercube, 1998. 9. Li G., Regunathan S., Barrow C.J., EshraghiJ., Cooper R., Reis D.J. Agmatine: an endogenous clonidine-displacing in the brain // Science. 1994. Vol. 263. N 5149. P. 966-969.10. Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defence? Magainins and tachyplesins as archetypes //
Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1462. N 1. P. 1-10. 11. McManus A. M„ Dawson N. F., Wade J. D„ Carrington L. E., Winzor D.J., Craik D.J. Three-dimensional structure of RK-1: a novel R-defensin peptide // Biochemistry. 2000. Vol. 39. N 51. P. 15757-15764.12. Pardi A., Zhang X.-L., SelstedM. E., Skalicky J. J., Yip P. F. NMR studies of defensin antimicrobial peptides. 2. Three-dimensional structure of rabbit NP-2 and human HNP-1 // Biochemistry. 1992. Vol. 31. N 46. P. 11357.13. Plakhova V. B., Shchegolev B. F., Rogachevskii I. V., Nozdrachev A. D., Krylov B. V., Podzorova S. A., Kokryakov V. N. A possible molecular mechanism for the interaction of defensin with the sensory neuron membrane // Neuroscience and Behavioral Physiology. 2002. Vol. 32. N 4. P. 409-4155. 14. Rosengren K.J., McManus A. M., Craik D.J. The structural and functional diversity of naturally occurring antimicrobial peptides // Curr. Med. Chem.'Anti-infect. Agents. 2002. Vol. 1. N 4. P. 319-341. 15. Schwyzer R. Molecular mechanism of opioid receptor selection // Biochemistry. 1986. Vol. 25. N 20. P. 6335-6342. 16. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by li-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1462. N 1. P. 55-70.17. Sitaram N., Nagaraj R. Host-defense antimicrobial peptides: importance of structure for activity // Curr. Pharm. Design. 2002. Vol. 8. N 9. P. 727-742. 18. WeinerS.J., Kollman P. A., Nguyen D. T., Case D. A. An all atom force field for simulations of proteins and nucleic acids //]. Comput.Chem. 1986. Vol. 7. N 2. P. 230-252.19. Zhang X.-L., Selsted M. E., Pardi A. NMR studies of defensin antimicrobial peptides. 1. Resonance assignment and secondary structure determination of rabbit NP-2 and human HNP-1 //Biochemistry. 1992. Vol. 31. N 46. P. 11348-11356.
Статья поступила в редакцию 15 мая 2006 г.
