CC BY
3УДК 577
DE NOVO МУТАЦИЯ SEMA4D ВЫЗЫВАЕТ ТОНИКО-КЛОНИЧЕСКУЮ ЭПИЛЕПСИЮ У ЧЕЛОВЕКА
DOI
Кондакова Е. В.1, Тарабыкин В. С.1,2, Newman A. G.2
1 Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия, 2 Институт клеточной биологии и нейробиологии клиники Шарите, Берлин, Германия e-mail: elen_kondakova@list.ru
Аннотация. Мы обнаружили новую de novo мутацию Sema4D-Q497P у пациента с тонико-клоническими припадками. При сверхэкспрессии в развивающемся мозге мыши hSema4D-497P мутантного белка происходит ингибирование миграции нейронов и проекции аксонов нейронов коры головного мозга.
Ключевые слова: эпилепсия, семафорины, Sema4D, гликозилирование
Семейство семафориновых молекул участвует в контроле развития нервной системы, а также в функционировании иммунных клеток [1]. Белки Семафорины у мыши делятся на восемь классов, состоящих из секретируемых и мембраносвязанных белков [2].
Мы идентифицировали пациента с генерализованными тони-ко-клоническими судорогами, в геноме которого писутствует мутация de novo в гене Семафорин-4Э (Sema4D). Секвенирование эк-зома выявило несинонимичную мутацию в гене Sema4D аденозина в цитозин, приводящую к замене в белке глутамина (Q) на пролин (P) в кодоне 497. Учитывая, что остаток Q497 участвует в формировании бета-листа в домене Sema, ожидается, что включение проли-нового кольца изменит вторичную структуру.
Чтобы предсказать, как эта мутация может влиять на фол-динг белка, мы использовали последний выпуск программы alphafold2 для сравнения предсказанной структуры с известной кристаллической структурой hSema4D (PDB: 1OLZ). Предсказанная структура hSema4D и hSema4D-497P дикого типа чрезвычайно близка к кристаллической структуре 1OLZ. В обоих предсказаниях
WT и 497P верхние сегменты домена Sema не могут быть предсказаны с достаточной степенью достоверности правильно и образуют петли с низкой достоверностью, которые говорят о текущем ограничении alphafold2 и не могут быть интерпретированы. Однако бета-лист, содержащий кодон 497, согласуется между 1OLZ и прогнозом для hSema4D, поэтому оказалось возможным сравнить структуру мутации 497 со структурой дикого типа на этом уровне. В то время как бета-лист, содержащий P497, согласно теоретическим предсказаниям, формируется правильно, бета-лист под ним не должен образовываться, что является особенностью структуры белка, которая находится в непосредственной близости от сайта гликозилирования N77. Учитывая его расположение, также возможно, что стерические затруднения из-за мутации P497 влияют на нормальное гликозилирование в N49 и N419 или убиквитиниро-вание в K505 или K81.
Мы решили проверить, может ли этот мутант Sema4D все еще образовывать гомо- и гетеродимеры с другим белком семейства Sema — Sema7a после иммунопреципитации белков, сверхэкспрес-сированных в клетках HEK293T. Интересно, что, хотя мутация Q497P не мешала гомодимеризации Sema4D или гетеродимериза-ции с Sema7A, мы наблюдали изменение миграции полос Sema4D в геле SDS-PAGE. В то время как Sema4D дикого типа обычно мигрирует в двух размерах (~ 150 кДа и ~ 120 кДа), мы наблюдали, что с Sema4D-497P более тяжелая форма белка (~ 150 кДа) практически отсутствует.
В соответствии с нашими структурными предсказаниями мы предположили, что две формы Sema4D могут соответствовать разным состояниям созревания или состояниям гликозилирования белка. После инкубации лизатов с ферментами дегликозилирова-ния мы наблюдали, что форма hSema4D массой 150 кДа содержит O-связанное гликозилирование. В то время как hSema4D-497P продолжает оставаться гликозилированной, обработка Endo H, который не может расщеплять сложные гликаны, приводит к размеру, не наблюдаемому на hSema4D-497P. Однако обработка PNGase F, которая должна расщеплять все сайты гликозилирования, по-прежнему приводит к появлению двух заметных полос WT, уменьшенных до ~ 120 кДа и ~ 110 кДа, что позволяет предположить, что разница в размерах обусловлена не гликозилированием, а чем-то другим.
Учитывая, что присутствие рецептора Sema7A на плазматической мембране необходимо для его биологической функции, мы
использовали поверхностное биотинилирование с последующим осаждением антителами с авидином, чтобы выяснить роль Sema7A и мутации Q497P в регуляции субклеточной локализации сема-форина 4D. Интересно, что биотинилированной оказалась только 150 кДа форма Sema4D, что указывает на то, что это мембранно локализованная форма белка. Было показано, что коэкспрессия Sema7A увеличивает долю Sema4D, локализованного на поверхности, в три раза, в то время как мутация Sema4D по остатку 497 устраняет его локализацию на клеточной поверхности.
Чтобы дополнительно охарактеризовать этот эффект, мы нукле-официровали первичные нейроны с помощью HA-mSema7A и sp-myc hSema4D или sp-myc-hSema4D-Q497P и провели анализ колока-лизации с помощью PLA (proximity ligation assay), чтобы наблюдать расположение семафоринового комплекса in situ. Мы увидели, что в то время как комплексы hSema4D-mSema7A в норме находятся вблизи клеточной мембраны и в конусе роста аксона, комплексы hSema4D-497P-Sema7A обнаруживаются преимущественно в соме и отсутствуют в конусе роста. При сверхэкспрессии доминантной мутации hSema4D-497P в развивающемся неокортексе методом внутриутробной электропорации, мы наблюдали ингибирующий эффект на миграцию нейронов и навигацию аксонов по сравнению с экспрессией нормального hSema4D. Учитывая, что hSema4D-497P по-прежнему гомо- и гетеродимеризуется, но не локализуется на мембране, можно предположить, что мутация hSema4D-497P блокирует клеточные функции как Sema4D, так и Sema7A.
Наши результаты демонстрируют важную роль посттрансляционных модификаций Sema4D в инициации миграции нейронов и спецификации аксонов. Это способствует нашему пониманию сложной этиологии патологий развития нервной системы.
Работа проведена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (проект №FSWR-2023—0029).
Список литературы
1. Yazdani, U., and Terman, J. R. (2006). The semaphorins. Genome biology 7, 211.
2. Pasterkamp, R. J., and Giger, R. J. (2009). Semaphorin function in neural plasticity and disease. Current Opinion in Neurobiology 19, 263—274. 10.1016/j.conb.2009.06.001.
DE NOVO MUTATION OF SEMA4D CAUSES TONIC—CLONIC SEIZURES IN A HUMAN PATIENT
Kondakova E. V.1, Tarabykin V. S.Newman A. G.2
1 National Research Nizhny Novgorod State University N. I. Lobachevsky, Nizhny Novgorod, Russia,2 Institute of Cell Biology and Neurobiology, Berlin, Germany e-mail: elen_kondakova@list.ru
Annotation. We discovered a de novo mutation of human Sema4D in a patient with epilepsy. When overexpressed in the developing mouse brain, hSema4D-497P inhibits migration and axon projections of cortical neurons.
Key words: epilepsy, Semaphorins, Sema4D, glycosylation
The Semaphorin family of axon guidance molecules are implicated in the development of the nervous system as well as in immune cell function [1]. Murine Semaphorins are divided into eight classes consisting of secreted and membrane-bound proteins [2].
We identified a patient presenting with generalized tonic-clonic seizures that has a de novo mutation in Sema4D. Exome sequencing revealed a nonsynonymous mutation of adenosine to cytosine resulting in a glutamine (Q) to proline (P) substitution at codon 497. Given that the Q497 residue is involved in the formation of a beta sheet on a propeller of the Sema domain, the sudden inclusion of a proline ring is expected to alter secondary structure.
To predict how this mutation may affect protein folding, we used the most recent release of alphafold2 to compare predicted structure with the known crystal structure of hSema4D (PDB: 1OLZ). The predicted structure of wildtype hSema4D and hSema4D-497P are extremely close to the 1OLZ crystal structure. In both WT and 497P predictions, upper segments of the Sema domain are not predicted correctly and form low confidence loops which speak to a current limitation of alphafold2 and should not be interpreted. However, the beta sheet that contains codon 497 is consistent between 1OLZ and the prediction for hSema4D, so it is useful to compare the 497 mutation structure to wildtype at this level. While the beta sheet containing P497 is predicted to form correctly, the beta sheet below it is not predicted to form, a feature that resides in close proximity to glycosylation site N77. Given its location, it is also possible that steric hindrance from the P497 mutation affects normal glycosylation at N49 and N419 or ubiquitination at K505 or K81.
WeaskedifthismutantofSema4Dcanstillformhomoandheterodimers with another Sema protein, Sema7a, after immunoprecipitation of proteins overexpressed in HEK293T cells. Interestingly, while the Q497P mutation did not interfere with Sema4D homodimerization or heterodimerization with Sema7A, we observed a change in the migration of the Sema4D bands in an SDS-PAGE gel. While wildtype Sema4D normally migrates as two sizes (~150kDa and ~120kDa), we observed that with Sema4D-497P, the heavier form of the protein (~150kDA) was largely absent.
In line with our structural predictions, we surmised that the two forms of Sema4D could correspond to different maturation states or glycosylation states of the protein. After incubating lysates with de-glycosylation enzymes, we could observe thatthe150 kDa form ofhSema4D contains O-linked glycosylation. while hSema4D-497P continues to be glycosylated, treatment with Endo H, which cannot cleave complex glycans, results in a size not observed on hSema4D-497P. However, treatment with PNGase F, which should cleave all glycosylation, still results in two prominent WT bands, reduced to ~120kDa and ~110kDa, suggesting that something other than glycosylation contributes to the difference in size.
Given that presence of the Sema7A receptor at the plasma membrane is essential for its biological function, we used surface biotinylation followed by avidin pull down to address the role of Sema7A and of the Q497P mutation in regulating the subcellular localization of Semaphorin 4D. Interestingly, only the 150KDa form of Sema4D became biotinylated, indicating that this is the membrane localized form of the protein. We observed that co-expression of Sema7A increased the proportion of surface-localized Sema4D three-fold, while mutation of Sema4D at residue 497 abolished its localization to the cell surface.
To further characterize this effect, we nucleofected primary neurons with HA-mSema7A and sp-myc-hSema4D or sp-myc-hSema4D-Q497P and performed a proximity ligation assay to observe the location of the semaphorin complex in situ. We could obin serve that while hSema4D-mSema7A complexes are normally found near the cell membrane and in the growth cone, hSema4D-497P-Sema7A complexes are found predominantly in the soma and absent from the growth cone. When this dominant hSema4D-497P mutation is overexpressed in the developing neocortex by in utero electroporation, we can observe an inhibitory effect on neuronal migration and axon projection compared to expression of normal hSema4D. Given hSema4D-497P still homo and heterodimerizes
but is not localized to the membrane, it is likely hSema4D-497P strongly inhibits cell autonomous functions ofboth Sema4D and Sema7A.
Overall, our results show a crucial role ofthe Sema4D posttranslational modifications in initiating neuronal migration and axon specification. This further contributes to our understanding of the complex etiology of neurodevelopmental pathologies.
Scientific research carried out with the support ofthe Ministry of Science and Higher Education ofthe Russian Federation (project №FSWR-2023—0029).
Reference list
1. Yazdani, U., and Terman, J. R. (2006). The semaphorins. Genome biology 7, 211.
2. Pasterkamp, R. J., and Giger, R. J. (2009). Semaphorin function in neural plasticity and disease. Current Opinion in Neurobiology 19, 263—274. 10.1016/j.conb.2009.06.001.
