CC BY
372УДК 615
DANIO RERIO (zEBRAFISH) как Универсальный
модельный объект в доклинических исследованиях
© Дмитрий Александрович Качанов1, Никита Михайлович Лакеенков1, Кирилл Евгеньевич Левикин1, Александра Александровна Блаженко2, Галина Яковлевна Лапкина1, Георгий Отарович Багатурия3, Сергей Николаевич Прошин1
1 Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. мечникова. 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47
2 Институт экспериментальной медицины. 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12
3 Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет. 194100, Санкт-Петербург, Литовская ул., 2
Контактная информация: Кирилл Евгеньевич Левикин — студент 3 курса факультета общей медицины СевероЗападного государственного медицинского университета им. И.И. мечникова. E-mail: k.levikin@inbox.ru
РЕЗЮМЕ. Danio rerio (Zebrafish), как модельный объект в доклинических исследованиях, применяется в последние годы очень широко. Этому способствуют их морфологические, физиологические, биохимические, генетические и эмбриологические особенности, а также экономическая целесообразность и небольшие временные затраты на их разведение. Цель — обобщение имеющихся данных об использовании Danio rerio (Zebrafish) в доклинических исследованиях. Методы. В данной работе проведён мета-анализ отечественных и зарубежных статей о применении Danio rerio в токсикологических, фармакологических, эмбриологических и др. направлениях исследований. Результаты. Danio rerio (Zebrafish) могут использоваться во многих направлениях доклинических исследований лекарственных препаратов. Особенно интересно их применение для моделирования стресса новизны и экспериментальной депрессии. Выводы. Danio rerio представляют собой универсальный модельный объект, позволяющий эффективно и выгодно проводить исследования различных фармакологических препаратов, прежде чем они будут тестироваться на других моделях, в частности моделях других животных.
Ключевые слова: Danio rerio, Zebrafish, модельный объект, доклинические испытания.
danio rerio (zebrafish)—an universal model object in preclinical studies
© Dmitrii a. Kachanov1, nikita m. Lakeenkov1, Kirill E. Levikin1, Alexandra A. Blazhenko2, Galina Ya. Lapkina1, Georgij O. Bagaturiya3, Sergei N. Proshin1
1 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov. 195067, St. Petersburg, Piskarevsky Ave., 47
2 The Institute of Experimental Medicine. 197376, St. Petersburg, st. Academician Pavlov, 12
3 Saint-Petersburg state Pediatric Medical University. 194100, Saint-Petersburg, Litovskya st., 2
Contact Information: Kirill E. Levikin — 3th year student of the Faculty of General Medicine, North-Western State
Medical University named after I.I. Mechnikov. E-mail: k.levikin@inbox.ru.
ABSTRACT. Danio rerio (Zebrafish) as a model object in preclinical studies has been widely used in recent years. This is facilitated by their morphological, physiological, biochemical, genetic and embryological peculiarities, as well as economic benefits and low time costs for their breeding.
The aim — summarize the available data on the use of Danio rerio (Zebrafish) in preclinical studies. Methods In this paper, a retrospective analysis of domestic and foreign works on the use of Danio rerio in toxicological, pharmacological, embryological, and other areas of research has been carried out. Methods in this paper, a meta-analysis of domestic and foreign articles on the use of Danio rerio in toxicological, pharmacological, embryological, and other areas of research has been carried out. Results and discussion. Danio rerio (Zebrafish) can be used in many areas of preclinical drug research. Particularly interesting is their use for modeling novelty stress and experimental depression. Conclusion. Danio rerio is a universal model object, which makes it possible to carry out research of various pharmacological preparations in a cost-effective manner before they are tested on other animal models.
Keywords: Danio rerio, Zebrafish, model object, preclinical studies.
введение
На сегодняшний день достоверно известно, что тропические рыбки Danio гегю (Zebrafish) являются изученным и практичным модельным объектом доклинических исследований. Они имеют ряд преимуществ по сравнению с различными представителями данного класса и даже другими лабораторными животными, в частности грызунами. Благодаря детальной изученности эмбриогенеза, генома, морфологических особенностей и минимальности затрат на содержание Zebгafish может применяться в биологических, генетических, фармакологических исследованиях и скрининге при мутагенезе, оценке тератогенности и другого воздействия химических веществ.
цель данного исследования
обобщение имеющиеся данных об использовании Zebгafish в доклинических исследованиях, установление их преимуществ и недостатков в конкретных лабораторных испытаниях и дальнейших перспективах работы с данным модельным объектом.
Материалы и методы. В работе был проведен ретроспективный анализ данных зарубежных и отечественных работ (за период 2014-2018 гг.), посвященных использованию Danio гегю в различных доклинических исследованиях.
результаты исследования
Danio гегю (Zebrahish) — маленькая пресноводная тропическая рыбка, населяющая преимущественно реки и ручьи Пакистана, Индии, Бангладеша, Непала, Мьянмы и Бутана. Zebrafísh, хорошо известная любителям аквариумных рыб, широко применяется в лабораторных исследованиях. Danio гегю имеет
продолговатую форму тела, основной тон окраски — серебристый с ярко синими и желто-зелеными полосами. Взрослые особи, обитающие на воле, достигают длины 6-7 см, аквариумные обитатели — 5 см. Zebrafísh ведут стайный образ жизни (не менее 7-10 рыбок), большую часть времени держатся в верхних и средних слоях воды. В неволе живут около трех лет.
Главными достоинствами этой рыбки является наличие прозрачного эмбриона, который позволяет в полной мере наблюдать стадии эмбриогенеза. Данная особенность нашла применение в изучении тератогенного, канцерогенного и других влияний различных химических и лекарственных веществ на Danio гегю, что проявляется в нарушении этапов развития зародыша или формировании морфологических аномалий развития. Помимо этого, Zebrafísh обладает высокой плодовитостью и быстрым периодом созревания эмбрионов. Через 3 дня после оплодотворения у него начинает функционировать сердце, кровеносная и нервная системы. На четвертые сутки происходит формирование малька, способного к самостоятельному питанию и движению. Эта особенность позволяет ускорить процесс исследования и минимизировать затраты в виде средств и времени [6].
Также стоит отметить, что на настоящее время проведено детальное изучение генома Danio гегю. Отмечается, что у Zebrafísh имеется 70% гомологии с геномом человека, что позволяет их использовать как прекрасную модель для генетических исследований [6].
Сходные биохимические процессы с млекопитающими вновь подтверждают целесообразность использования Danio гегю как модели доклинических исследований.
Использование Danio гегю в качестве индикаторов загрязнения водоемов
И взрослые особи, и эмбрионы Danio rerio могут служить тест-объектами для оценки эффективности гигиенической очистки водоемов в связи с их нарастающим антропогенным загрязнением.
В исследовании Jequeline Р. Souza и соавт. особый интерес уделялся токсическому действию графена на организмы, в связи с широкой распространённостью его применения в области биомедицины. В результате проведенных экспериментов в морфологии жабер была выявлена гиперплазия жаберных клеток, являющаяся исходом предшествующего некроза, а также присутствие в них активных форм кислорода. В печени также наблюдались неравномерное распределение гепатоци-тов в ткани, нарушение периферического расположения ядер, вакуолеобразование и наличие некротических изменений клеток органа [11].
Исследование Е.О. Аристархова показало, что Zebrafísh являются более чувствительными к комплексному воздействию загрязняющих веществ в исследуемых водоемах. Спустя 12 часов от начала эксперимента, в большей степени чем у других рыб, у Danio гегю наблюдалось усиление векторного движения и снижение активности поедания корма. [1]
модельный объект для постановки стресса и депрессии
В настоящее время Zebrafísh также активно используются в качестве опытной модели для постановки стресса новизны и экспериментальной депрессии с последующим воздействием препаратов разных фармакологических групп [8, 6]. Для постановки стресса новизны используют следующую методику: Danio гегю помещают сначала в мерный стакан с растворенным фармакологическим веществом (или просто с чистой водой), а затем — в просмотровый аквариум на 6 минут, где автоматически регистрируются траектория движения, длина пути, число перемещений в верхнюю часть аквариума, время пребывания в нижней части аквариума, число и время паттерна «фризинг» (обездвиживание) за каждую минуту эксперимента. В ответ на новизну помещения Danio гегю реагируют погружением на дно, увеличением фри-зинга и снижением числа перемещений в верхнюю половину аквариума. Так, например, на фоне введения феназепама число и время паттерна «фризинг», а также время
пребывания в нижней части аквариума снижались более чем в 2 раза по сравнению с контрольной группой и проявлялся дозоза-висимый эффект. Тест стресса новизны является высоко чувствительным для изучения тревожно-фобических реакций у Zebrafish, и поэтому данная модель может использоваться для изучения поведенческой фармакологии [8].
Для создания экспериментальной депрессии может использоваться и другая модель, заключающаяся в разлучении особей Danio гегю по парам в ограниченном пространстве. Данная модель может являться перспективной для изучения уже существующих психоактивных веществ, а также в доклинических исследованиях новых препаратов [6].
оценка токсичности.....
фармакологических препаратов различных групп
В исследовании Silvia Ribeiro и соавт. эмбрионы Danio rerio подвергались воздействию препаратов разных фармакологических групп: диклофенака, пропранолола, симвастатина и сертралина. Оценивалось их токсическое воздействие на эмбрионы Zebrafish. При оценке влияния диклофенака на эмбрионы наблюдались значительные изменения в развитии: рост аномальных клеток, нарушение стадии эпиболии в развитии зародыша, а также отклонения в формировании желточного мешка. Наиболее существенные нарушения развития были отмечены при концентрации препарата 12,5 мг/л. Число успешно пройденных стадий эпиболии в развитии зародыша уменьшилось с 91 до 82,5% при увеличении концентрации диклофенака с 1,25 до 12,5 мг/л.
При воздействии пропранолола в концентрации 12,5 мг/л выявлялось развитие пери-кардиального выпота, аномалий развития плавников, резко увеличивалась смертность эмбрионов с 32 по 80 часы исследования.
Сертралин в концентрации 10 мг/л приводил к смерти всех эмбрионов к 80 часам исследования. Также было показано значительное снижение успешных стадий эпиболии в развитии зародыша по сравнению с контролем (с 90 до 67,5%).
Симвастатин оказался самым токсичным из исследуемых препаратов. Концентрация 5 мг/л оказалась смертельной для всех эмбрионов с 32 по 80 часы исследования.
В концентрации до 500 мкг/л данный препарат вызывал увеличение количества ано-
мальных эмбрионов с нарушениями зрения, развития хвоста и желточного мешка, а также в полости перикарда рыбок развивался выпот.
Исследование показало, что эмбрионы Danio гегю могут использоваться как модель в проведении доклинических исследований по оценке токсичности различных новых фармацевтических препаратов [10].
В работе К.В. Золотарева и соавт. взрослые рыбы Danio гепо в течение 4 суток подвергались действию Cd и Си, концентрации которых были равны ПДК(5 мкг/л для обоих ионов) и сублетальным концентраци-ям(6,4 мг/л для кадмия и 80 мкг/л для меди). Исследование действия ионов тяжелых металлов на протеом проводилось методом ВЭЖХ-масс-спектрометрии.
По итогам эксперимента были найдены маркеры токсического действия Cd и Си на печень и сердечную мышцу (таблица 1) [5].
использование.....
эмбрионов рамо rerio
Эмбрионы Zebrafish являются хорошей моделью для оценки влияния различных веществ на развитие и стимуляцию ооцитов.
В ранее проведенных экспериментах было показано, что для стимуляции овуляции у костистых рыб, как и других позвоночных необходимы эйкозаноиды (nrF2a или ПГЕ2).
В исследовании М.Н. Скоблиной и соавт. впервые было показано, что достигшие дефинитивного размера окруженные фолликулярными оболочками ооциты Danio rerio, созревшие in vitro под влиянием прогестерона, ову-лируют в результате их обработки nrF2a и полостной жидкостью карпа (ПЖК).
В проведенных опытах при обработке фолликулов Zebrafish прогестероном и ПГБ2а (5 мкг/ мл) после оплодотворения дробилось от 57 до
92% овулировавших ооцитов и от 17 до 61% из них достигало стадии вылупившейся личинки.
В результате воздействия на фолликулы 20% ПЖК, содержащей П^2а, было выявлено, что проценты овулировавших ооцитов Danio гегю, стимулированных прогестероном и ПЖК и прогестероном и простагландином у трех из четырех самок не отличаются достоверно [7].
Доклиническое исследование нуклеоспер-мата натрия («Вирутер») на эмбрионах Danio гегю показало, что при добавлении данного препарата в экспериментальные лунки с эмбрионами происходит их более эффективное развитие благодаря активации системы врожденного иммунитета с дальнейшим развитием комплекса регулируемых цитокинами провоспалительных и противовоспалительных сигналов [3].
Можно сделать вывод о том, что ооциты Zebrafish являются перспективной моделью для исследования роли различных соединений на процессы созревания клеток и овуляции.
модель' Для ' СОЗДАНИЯ.....
ТРАНСПОРТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СИСТЕМ
Danio гегю активно используются для разработки новых транспортных лекарственных систем, которые в дальнейшем помогут в лечении различных заболеваний. В частности, весьма актуальным является моделирование опухоли головного мозга Zebrafish с последующей ее терапией с помощью доксорубицина и паклитаксела, встроенных в экзосому [12].
модель оценки влияния наркотических веществ
Danio rerio могут служить прекрасными тест-объектами для моделирования влияния
Таблица 1
Маркеры токсического воздействия Cd и Си на печень и сердечную мышцу, установленные при проведении исследований на Danio гепо
Ткань Маркеры
Cd Си
Печень Сульфотрансфераза 3 семейства 2, фермент защитного и гидрофилизирующего действия Eif2s1, субъединица 1 фактора 2 инициации трансляции генов. Образует комплекс с ГТФ и инициирующей т-РНК
Секреторная фосфолипаза А2, Ca-зависимый фермент гидролиза фосфолипидов Stat3, сигнальный белок-активатор транскрипции генов
Сердце НАДН-ДГ(убихинон) Шаперонин класса 2
Селенопротеин J, белок антиоксидантного действия
FoRcIpE
том 1 № 1 2018
ISSN 2658-4174
оригинальные статьи
53
наркотических препаратов на организм Danio и дальнейших способов его фармакологической корректировки. Именно это сумели доказать в своем исследовании Eric J. Mercero, Shelby L. Poitra, Ana Espinoza и соавторы.
При измерении электрокардиограммы подверженных воздействию кокаина рыбок Danio rerio наблюдалось увеличение ЧСС в колоколообразной зависимости от дозы. Максимальное увеличение проявлялось при дозировке 5 мг/л у большинства рыб в сравнении с базовой частотой. Также стоит отметить, что при воздействии более высоких доз у Zebrafish регистрировалась брадикардия.
На основании проделанной работы была введена закономерность о том, что влияние кокаина на частоту сердечных сокращений обладает дозозависимым эффектом. Это в очередной раз подтверждает использование Danio rerio в качестве модельной системы для изучения влияния наркотических веществ [9].
исследования.....
гормонопрепаратов
Заболевания щитовидной железы относятся к числу наиболее распространенных нарушений в работе эндокринной системы. Нарушения ее функции встречаются часто, как у детей, так и у взрослых. Недостаток синтеза и секреции гормонов в раннем возрасте ведет к задержке роста, соматическим нарушениям и олигофрении (кретинизму), в более старшем возрасте — к замедлению обмена веществ (микседеме). С использованием рыбок Danio гегю можно проводить оценку влияния гипо- и гипертиреоидного состояния на развитие и выживаемость икринок до появления личинок, регистрируя при этом кровообращение, пигментацию зоны глаз, появление или отсутствие различных аномалий в развитии формы тела [4].
использование' ьдмо шёшо.....
для моделирования болезней человека
В ходе большого количества исследований у Danio гегю были идентифицированы гены, связанные с болезнями человека. К таким заболевания относятся болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, мышечная дистрофия, лейкемия, тромбоз, кардио-миопатия, диабет и др. Для моделирования на Danio гегю этих заболеваний используют
различные подходы. Так, например, нейро-токсин — 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетраги-дропиридин, применяется для моделирования паркинсонизма у рыбок, так как механизм действия этого соединения, связанный с разрушением дофаминергических нейронов, у Danio гегю и млекопитающих один и тот же [2].
выводы.....
В настоящее время большое количество лабораторий всего мира используют Zebrafish в своих исследованиях. Эти небольшие рыбки обладают несомненными преимуществами перед грызунами: относительно невысокая стоимость работ, небольшие временные затраты и простота в разведении. Данный модельный объект способствует не только созданию новых лекарственных препаратов, но и позволяет на основе созданных моделей болезней человека более подробно изучать их патогенез, а также влияние на органы и системы. Модель Danio гегю не заменяет классические модели млекопитающих, она может служить первым этапом доклинических исследований, перед тем как они будут проведены, в частности, на грызунах.
литература
1. Аристархова Е.О. Экспресс-оценка токсичности вод поверхностных источников водоснабжения с использованием рыб Danio rerio. Рыбохозяйствен-ная наука Украины. 2017; № 3.
2. Беляева Н.Ф. и соавт. Зебрафиш как модель в биомедицинских исследованиях. Биомедицинская химия. 2010; Т. 56(1): 120-131.
3. Блаженко А.А., Качанов Д.А., Прошин С.Н. Доклиническое исследование нуклеоспермата натрия на модели Danio rerio. Мечниковские чтения-2018: материалы Всероссийской научно-практической студенческой конференции с международным участием. СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова; 2018: 630-631.
4. Блаженко А.А., Качанов Д.А., Прошин С.Н. Исследование гормонопрепаратов на модели Danio rerio (Zebrafish). Мечниковские чтения-2018: материалы Всероссийской научно-практической студенческой конференции с международным участием. СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова; 2018: 633-634.
5. Золотарёв К.В., Беляева Н.Ф., Михайлова М.В. и соавт. Поиск маркёров токсического действия CD2+ и Cu2+ методом протеомного профилирования печени и сердца Danio rerio. Биотехнология и медицина; 2015.
6. Качанов Д.А. Сравнительный анализ влияния селективных ингибиторов обратного захвата серото-нина на поведение Danio rerio в условиях экспериментальной депрессии. Мечниковские чтения-2018: материалы Всероссийской научно-практической студенческой конференции с международным участием. СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова; 2018: 636-637.
7. Скобкина М.Н., Минин А.А. Гормональная индукция созревания и овуляции in vitro овоцитов Данио рерио (Danio rerio) и получение яйцеклеток, способных к оплодотворению и развитию. Онтогенез. 2016; Т. 47(5): 314-319.
8. Шабанов П.Д., Лебедев В.А., Лебедев А.А. и соавт. Влияние стресса новизны на поведенческие ответы Danio rerio и оценка дозозависимых эффектов анк-сиолитиков бензадиазепинового ряда на примере феназепама. обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2017; Т. 15(3): 57-63. dol: 10.17816/RCF15357-63.
9. Eric J. Mercero, Shelby L. Poitra, Ana Espinoza et al. The effect of cocaine on heart rate and electrocardiogram in Danio rerio. Biochem Physiol С Toxicol Pharmacol. 2015: 1-6. DOI: 10.1016 / j. cbpc.2015.03.007.
10. Silvia Ribeiro, Tiago Torres, Rosario Martins et al. Toxicity screening of Diclofenac, Propranolol, Ser-traline and Simvastatin using Danio rerio and Paracen-trotus lividus embryo bioassays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2015: 67-74.
11. Souza J. P. et al. Aquatic Toxicology. 2017; 186: 1118.
12. Yang T., Martin P., Fogarty B. et al. Pharm Res (2015) 32: 2003. https://doi. org/10.1007/s11095-014-1593-y.
REFERENCE.....
1. Aristarhova E.O. EHkspess-ocenka toksichnosti vod poverhnostnyh istochnikov vodosnabzheniya s is-pol'zovaniem ryb Danio rerio. [Rapid assessment of the toxicity of water from surface water sources using fish Danio rerio]. Rybohozyajstvennaya nauka Ukrainy. 2017; № 3 (in Russian).
2. Belyaeva N.F. i soavt. Zebrafish kak model' v bio-medicinskih issledovaniyah. [Zebrafish as a model in biomedical research]. Biomedicinskaya himiya. 2010; T. 56(1): 120-131 (in Russian).
3. Blazhenko A.A., Kachanov D.A., Proshin S.N. Dok-linicheskoe issledovanie nukleospermata natriya na modeli Danio rerio. [Preclinical study of sodium nu-cleospermate on the model of Danio rerio]. Mech-nikovskie chteniya-2018: materialy Vserossijskoj nauchno-prakticheskoj studencheskoj konferencii s mezhdunarodnym uchastiem. SPb.: Izd-vo SZGMU im. I.I. Mechnikova; 2018: 630-631 (in Russian).
4. Blazhenko A.A., Kachanov D.A., Proshin S.N. Issle-dovanie gormonopreparatov na modeli Danio rerio (Zebrafish). [Study of hormones on the model of Da-nio rerio (Zebrafish)]. Mechnikovskie chteniya-2018: materialy Vserossijskoj nauchno-prakticheskoj stu-dencheskoj konferencii s mezhdunarodnym uchasti-em. SPb.: Izd-vo SZGMU im. I.I. Mechnikova; 2018: 633-634 (in Russian).
5. Zolotaryov K.V., Belyaeva N.F., Mihajlova M.V. i soavt. Poisk markyorov toksicheskogo dejstviya CD2+ i Cu2+ metodom proteomnogo profilirovaniya pecheni i serdca Danio rerio. [Search for markers of toxic effect of CD2+ and Cu2+ by proteomic profiling of the liver and heart Danio rerio]. Biotekhnologiya i medicina; 2015 (in Russian).
6. Kachanov D.A. Sravnitel'nyj analiz vliyaniya selek-tivnyh ingibitorov obratnogo zahvata serotonina na povedenie Danio rerio v usloviyah ehksperimental'noj depressii. [Comparative analysis of the effect of selective serotonin reuptake inhibitors on the behavior of Danio rerio in experimental depression]. Mechnikovskie chteniya-2018: materialy Vserossijskoj nauchno-prakticheskoj studencheskoj konferencii s mezhdunarodnym uchastiem. SPb.: Izd-vo SZGMU im. I.I. Mechnikova; 2018: 636-637 (in Russian).
7. Skobkina M.N., Minin A.A. Gormonal'naya indukciya sozrevaniya i ovulyacii in vitro ovocitov Danio rerio (Danio rerio) i poluchenie yajcekletok, sposobnyh k oplodotvoreniyu i razvitiyu. [Hormonal induction of maturation and ovulation in vitro of Danio rerio ovo-cytes and production of eggs capable of fertilization and development]. Ontogenez. 2016; T. 47(5): 314319 (in Russian).
8. SHabanov P.D., Lebedev V.A., Lebedev A.A. i soavt. Vliyanie stressa novizny na povedencheskie otvety Danio rerio i ocenka dozozavisimyh ehffektov anksi-olitikov benzadiazepinovogo ryada na primere fenaze-pama. [The effects of stress on behavioural novelty responses Danio rerio and evaluation of dose-dependent effects of anxiolytics benzodiazepinovogo series on the example of phenazepam]. Obzory po klinicheskoj farmakologii i lekarstvennoj terapii. 2017; T. 15(3): 57-63. dol: 10.17816/RCF15357-63 (in Russian).
9. Eric J. Mercero, Shelby L. Poitra, Ana Espinoza et al. The effect of cocaine on heart rate and electrocardiogram in Danio rerio. Biochem Physiol С Toxicol Pharmacol. 2015: 1-6. DOI: 10.1016 / j. cbpc.2015.03.007.
10. Silvia Ribeiro, Tiago Torres, Rosario Martins et al. Toxicity screening of Diclofenac, Propranolol, Sertraline and Simvastatin using Danio rerio and Paracen-trotus lividus embryo bioassays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2015: 67-74.
11. Souza J.P. et al. Aquatic Toxicology. 2017; 186: 11-18.
12. Yang T., Martin P., Fogarty B. et al. Pharm Res (2015) 32: 2003. https://doi. org/10.1007/s11095-014-1593-y.
