ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.151.45
Посвящается 120-летию со дня рождения академика Александра Евсеевича Браунштейна
Citrobacter freundii метионин—у-лиаза: роль серина 339 в катализе реакций Y- и в-элиминирования
Н. В. Ануфриева1, Е. А. Морозова1, С. В. Ревтович1, Н. П. Бажулина1, В. П. Тимофеев 1, Я. В. Ткачев1, Н. Г. Фалеев 2, А. Д. Никулин3, Т. В. Демидкина1*
1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, 119991 Россия
2Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, 119991 Россия
3Институт белка РАН, Пущино, Московская обл., 142290 Россия
*E-mail: tvdemidkina@yandex.ru
Поступила в редакцию 22.10.2020
Принята к печати 21.07.2021
DOI: 10.32607/actanaturae.11242
РЕФЕРАТ Остаток активного центра Citrobacter freundii метионин-у-лиазы (МГЛ) серин 339 является консервативным у большинства пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов структурного подкласса цистатионин-в-лиазы, к которому принадлежит МГЛ. Механизм реакции у-элиминирования, катализируемой МГЛ, изучен недостаточно. Методом сайт-направленного мутагенеза серин 339 был заменен на аланин. Замена серина 339 на аланин привела к существенному (на два порядка) снижению эффективности катализа мутантной формой фермента реакций у- и в-элиминирования. Скорости обмена С-а- и C-в-протонов аминокислот в комплексах фермента с конкурентными ингибиторами снизились на один-два порядка. Спектральные характеристики мутантной формы фермента свидетельствуют, что замена не приводит к существенным изменениям конформации и таутомерии внутреннего альди-мина МГЛ. Получены кристаллы холофермента и его пространственная структура определена c разрешением 1.7 А. Замена серина 339 на аланин не повлияла на общий ход полипептидной цепи субъединицы МГЛ и тетрамерную организацию молекулы фермента. Анализ кинетических, спектральных данных и известных пространственных структур C. freundii МГЛ свидетельствует, что остаток серина 339 необходим для эффективного катализа реакций у- и в-элиминирования на стадии отрыва С-а-протона внешнего альдимина и в реакции у-элиминирования на стадиях протонирования С4'-атома кофермента и отрыва С-в-протона в кетиминном интермедиате.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА метионин-у-лиаза, пиридоксаль-5'-фосфат, Ser339, мутантная форма, кинетические параметры, спектральные характеристики, пространственная структура.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ МГЛ - метионин-у-лиаза; ПЛФ - пиридоксаль-5'-фосфат; ЛДГ - лактатдегидро-геназа; HOHxoDH - D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназа.
ВВЕДЕНИЕ
Пиридоксаль-5'-фосфат (ПЛФ)-зависимые ферменты определяют жизнедеятельность большинства про- и эукариот. Особенностью этих биокатализаторов является возможность осуществления широкого спектра химических превращений аминокислот и аминов с участием кофактора. Субстратная и реакционная специфичности каждого конкретного фермента обеспечиваются взаимодействием кофактора и субстрата с апоферментом. Исследования ПЛФ-зависимых ферментов и данные рентге-ноструктурного анализа позволили существенно продвинуть знания о взаимоотношении структу-
ра-функция в ферментативном катализе и еще в 1995 году использовать рациональный дизайн для изменения субстратной специфичности в ПЛФ-зависимом катализе [1]. Определение кристаллических структур ПЛФ-зависимых ферментов, принадлежащих к различным классам, способствовало расширению знания о критических остатках для химически различных ферментативных реакций и формулировке ряда принципиальных идей в области биокатализа. Замена коферментсвязываю-щей белковой матрицы на матрицу суперсемейства иммуноглобулинов показала правильность основных выводов о механизмах превращений аминокислот
этими ферментами и возможности предсказания изменения ферментативной активности [2-5].
Метионин-у-лиаза (МГЛ, [КФ 4.4.1.11]) - ПЛФ-зависимый фермент, катализирующий реакции у-элиминирования L-метионина, ß-элиминирования L-цистеина и их S-замещенных производных, а также реакции у- и ß-замещения L-метионина, L-цистеина и их аналогов [6, 7]. Фермент найден у патогенных простейших [8, 9], в ряде бактерий, в том числе патогенных [10-14], грибах [15] и растениях [16].
Недавно нами было показано, что МГЛ катализирует реакцию ß-элиминирования сульфоксидов S-замещенных аналогов цистеина с образованием тиосульфинатов [17, 18]. Антибактериальная активность тиосульфинатов, получаемых «фармакологической парой» МГЛ/сульфоксид S-замещенного L-цистеина, показана in vitro против ряда бактерий [18-20] и in vivo против Pseudomonas aueroginosa [21]. Перспективность применения фермента в качестве противоопухолевого агента показана in vitro и in vivo [22-25].
Механизмы физиологической реакции и реакций ß-элиминирования и замещения, катализируемых МГЛ, мало исследованы. Исследование этих механизмов вносит вклад не только в фундаментальную энзимологию, оно необходимо для создания новых антибактериальных и противоопухолевых препаратов.
МГЛ принадлежит к структурному подклассу цистатионин^-лиазы с типом укладки I полипептидной цепи ПЛФ-зависимых ферментов [26]. В те-трамерной молекуле МГЛ, образованной четырьмя идентичными полипептидными цепями, две субъединицы формируют два так называемых «каталитических димера», в каждом из которых аминокислотные остатки из двух субъединиц образуют два активных центра [27, 28].
Определение трехмерных структур комплексов МГЛ с конкурентными ингибиторами, глицином [29], циклосерином [30] и норлейцином [31, 32] показало, что остаток активного центра фермента, Ser339, консервативный в подклассе цистатионин^-лиазы, участвует, по всей вероятности, в оптимальной для катализа ориентации боковой группы Lys210, связывающей кофермент.
Для изучения роли остатка Ser339 в катализе реакций y- и ß-элиминирования методом сайт-направленного мутагенеза получена мутантная форма фермента с заменой Ser339Ala, определены пространственная структура холофермента, стационарные кинетические параметры реакций Y- и ß-элиминирования ряда субстратов, скорости обмена С-а- и C-ß-протонов аминокислот в ком-
плексах Ser339Ala МГЛ с ингибиторами и спектральные характеристики мутантной формы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы и материалы
В работе использованы: L-метионин, L-норвалин, L-норлейцин, L-а-аминомасляная кислота, глицин, L-аланин, L-гомосерин, L-гомоцистеин, L-фенилаланин, DL-пеницилламин, фенилметил-сульфонилфторид, лактатдегидрогеназа из мышцы кролика (ЛДГ), дитиотреитол (ДТТ), NADH и D2O (Sigma, США); пиридоксаль-5'-фосфат (Merck, Германия); S-этил-L-цистеин, S-метил-L-цистеин, S-бензил-L-цистеин, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), протаминсульфат, додецилсуль-фат натрия (SDS) (Serva, США); лактоза (Panreac, Испания); глюкоза, глицерин, сульфат магния, сульфат аммония, калий фосфорнокислый одноза-мещенный, натрий фосфорнокислый двузамещен-ный, уксусная кислота, уксусный ангидрид, триэ-таноламин, HClO4 («Реахим», Россия); дрожжевой экстракт, триптон (Difco, США); DEAE-целлюлоза (Whatmann, Англия); супердекс 200 (Amersham Biosciences, Швеция); плазмиды Bluescript II SK(+/-) и pET28 (Novagen, США); набор для выделения ДНК, эндонуклеазы рестрикции Bsp119I и Bvel (Fermentas, Литва). О-Ацетил^-гомосерин получен ацетилированием L-гомосерина [33]; D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназа (HOHxoDH) получена согласно [34].
Сайт-направленный мутагенез
Сайт-направленный мутагенез проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы использовали плазмиду mglBlue, полученную клонированием гена МГЛ в вектор Bluescript II SK(+/-). Для замены Ser339 на Ala использовали следующие синтетические олигонуклеотиды (F -прямой праймер, R - обратный праймер): (F) TATCAGCTTCGAATCGCTGGC, (RS339/A) GTATCACCGAGAGCGACCGCGA, (FS339/A) TCGCGGTCGCTCTCGGTGATAC, (R) ATACCTGCTTTAAGCCGCTCTTCTGGCGCA.
После проведения ПЦР из реакционной смеси выделяли ампликон (использовали набор для выделения ДНК). Очищенный препарат ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Bsp119I и BveI и лигировали с вектором mglBlue, обработанным этими же ферментами. Полученную смесь трансформировали электропорацией в клетки Escherichia coli DH10B и выращивали на твердой среде (1.8% агар на среде Лурия-Бертани (LB) с ампициллином). Выращенные колонии переносили в жидкую
среду LB с добавлением ампициллина и растили в течение 15-18 ч. Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора для выделения плазмид и идентифицировали путем аналитической рестрикции. Фрагмент, содержащий замену Ser339Ala, был переклонирован из плазмиды mglBlue в pET28. Точность клонирования контролировали путем сек-венирования вставки ДНК (ЦКП «Геном», Москва). Клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали плаз-мидой, содержащей необходимую вставку.
Выращивание бактериальной массы и очистка фермента
Клетки E. coli BL21(DE3), содержащие плазмиду с геном мутантной формы, выращивали и очищали фермент как описано ранее [35]. Концентрацию очищенных препаратов фермента определяли по поглощению при 278 нм, используя коэффициент поглощения А1см01% = 0.8 [36].
Гомогенность препаратов проверяли ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях [37]. Активность в процессе очистки определяли в реакции в-элиминирования, активность конечного препарата определяли в реакциях в- и у-элиминирования. Реакционная смесь содержала 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 8.0, 0.1 мМ ПЛФ, 1 мМ ДТТ, 0.2 мМ NADH, 10 ед. ЛДГ и 30 мМ S-этил-Ь-цистеин (реакция в-элиминирования) или 70 мкг HOHxoDH и 30 мМ L-метионин (реакция у-элиминирования). За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1.0 мкМ/мин кетокислоты. Удельная активность препаратов фермента 95%-ной чистоты была равна 0.31 ед/мг в реакции у-элиминирования L-метионина и 1.03 ед/мг в реакции в-элиминирования S-этил-L-цистеина.
Кинетические исследования
Кинетические параметры реакций у- и в-элиминирования определяли при 30°C в сопряженной реакции с HOHxoDH или ЛДГ по уменьшению поглощения NADH при 340 нм (е = 6220 М-1см-1). Реакционные смеси содержали 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 8.0, 0.1 мМ ПЛФ, 1 мМ ДТТ, 0.2 мМ NADH, 70 мкг HOHxoDH или 10 ед. ЛДГ и варьируемые количества субстратов в общем объеме 1 мл. Реакцию инициировали добавлением 10 мкг фермента.
Ингибирование реакции у-элиминирования L-метионина различными аминокислотами исследовали в условиях, описанных выше, варьируя количества ингибитора в пробах.
Кинетические параметры обрабатывали согласно уравнению Михаэлиса-Ментен, используя програм-
му EnzFitter [38]. В расчетах использовали величину молекулярной массы субъединицы фермента, равную 43 кДа. Значения констант ингибирования также определяли с помощью программы EnzFitter [38].
Изотопный обмен С-а- и С-0-протонов ингибиторов в комплексах с ферментом
Кинетику реакций изотопного обмена С-а- и C-P-протонов ингибиторов на дейтерон, катализируемых мутантной формой, регистрировали с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии. Реакцию проводили в D2O, содержащей 50 мМ калий-фосфат (pD = 7.6), 0.1 мМ ПЛФ и ингибитор в общем объеме 0.5 мл при 30°С и концентрации L-аланина и L-норлейцина 144.23 и 98.04 мМ. Реакцию инициировали, добавляя 0.3-0.7 мг фермента. Спектры 1Н-ЯМР записывали через определенные интервалы времени на спектрометре Bruker AMXIII-400 c рабочей частотой 400 МГц. Сигналы С-а- и С-Р-протонов интегрировали с помощью модифицированной программы автоматизации enzkin, входящей в состав XWIN_NMR-программ. Кинетические кривые накопления дейтерированных продуктов обрабатывали по методу, описанному в [39].
Изотопный обмен протонов глицина проводили в D2O, pD = 7.6, содержащей 50 мМ калий-фосфат, 0.1 мМ ПЛФ, 60 мг глицина и 3.6 мг фермента. После инкубирования в течение 72 ч при 30°С фермент инактивировали нагреванием (90°С, 5 мин) и отделяли центрифугированием. Растворитель удаляли на роторном испарителе. Для определения конфигурации у С-а-атома дейтерированный продукт был превращен в дипептид, L-фенилаланил-^-глицин в реакции с Boc-L-Phe-ONp [40, 41]. Дипептид растворяли в 0.5 мл D2O, и 1Н-ЯМР-спектр записывали на спектрометре Bruker AMXIII-400 с рабочей частотой 400 МГц.
Спектральные исследования
Спектры поглощения холофермента и его комплекса с метионином регистрировали при 25°С на спектрофотометре Cary-50 (Varian, США) в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ, 1 мМ EDTA, 20 мМ L-метионина при концентрации фермента 1 мг/мл.
Получение холофермента и апофермента
Апофермент и холофермент получали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ, 1 мМ EDTA. Холофермент получали добавлением 50-кратного молярного избытка ПЛФ. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 25°С. Избыток ПЛФ удаляли диализом. Для получения апофер-мента к препарату добавляли 100-кратный моляр-
ный избыток DL-пеницилламина [42]. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 25°C. DL-пеницилламин удаляли диализом. Процедуру повторяли до тех пор, пока активность фермента не снизилась до 1% от начальной. Содержание ПЛФ в препарате определяли в 100 мМ NaOH, используя значение молярного коэффициента поглощения ПЛФ при 390 нм, равное 6600 М-1 см-1 [43].
Определение константы диссоциации кофермента
Для определения константы диссоциации ПЛФ использовали метод ультрафильтрации [44]. Варьируемые количества ПЛФ (в диапазоне 5 х 10-3-1.2 х 10-1 мМ) добавляли к 8 х 10-3 мМ раствору апофермента в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ и 1 мМ EDTA. После 30 мин инкубации при 30°C свободный ПЛФ отделяли ультрафильтрацией на Centricon-30 microconcentrator (Amicon, США) центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об/мин и 4°C. Содержание ПЛФ в каждой пробе определяли в 100 мМ NaOH. Данные обрабатывали в координатах Скэтчарда [45].
Кристаллизация и сбор данных
Кристаллы МГЛ Ser339Ala получали методом диффузии паров в висящей капле в условиях, приведенных в [28]. Кристаллы, пригодные для сбора дифракционных данных, образовывались в течение 10 дней и имели ромбическую форму. Дифракционные данные были собраны на источнике синхротронного излучения, линия BESSY BEAMLINE 14.1 (Берлин, Германия), с использованием детектора MARMOSAIC 225 mm CCD при 100 К и обработаны в программном комплексе XDS [46] (табл. 1).
Определение и уточнение пространственной структуры Ser339Ala МГЛ
Структура МГЛ Ser339Ala решена методом молекулярного замещения с помощью программного комплекса CCP4 [47] и использованием в качестве модели определенной нами ранее структуры C. freundii МГЛ (1.35 А, код PDB 2RFV), из которой были исключены подвижные участки фермента, молекулы воды и кофермент. Для полученной модели была рассчитана карта электронной плотности. Дальнейший расчет структуры проводили с использованием протоколов уточнения Phenix [48] с минимизацией энергии и оптимизацией геометрии модели с последующей ручной правкой в программе COOT [49]. Процесс уточнения контролировали с использованием фактора достоверности модели
Таблица 1. Статистические характеристики дифракционных данных и уточненной структуры Ser339Ala МГЛ
Пространственная группа I222
Параметры элементарной ячейки, А a = 56.66, b = 123.09, с = 128.79 a = в = Y = 90°
Длина волны, А 0.91841
Разрешение, А 30.0-1.70 (1.79-1.70)
Полнота набора, % 99.4 (97.5)
Избыточность 7.0 (6.3)
Rmerge, % 4.5 (34.9)
Неупорядоченные аминокислотные остатки в структуре белка 1, 46-61, 398
Число неводородных атомов белка 2879
Число молекул воды 393
Число уникальных отражений 49574 (7001)
^^^ Rfree 0.173/0.205 (0.243/0.285)
Средний температурный фактор B, А макромолекулы растворителя 29.28 27.51 41.64
Среднеквадратическое отклонение от идеальных значений
длин связей 0.007 А
валентных углов 1.095°
хиральных углов 0.047°
планарных углов 0.005°
Область расположения аминокислотных остатков на карте Рамачандрана
наиболее предпочтительная, % 98.64
дополнительно разрешенная, % 1.36
допустимая, % 0.0
Примечание. В скобках приведены значения для слоя высокого разрешения.
Rfree, рассчитанный по 5% отражений, исключенных из уточнения. Окончательная модель уточнена до разрешения 1.70 А с показателями R , и R,
work free
17.3 и 20.5%. Модель содержит 2879 неводородных атомов белка и 393 молекулы воды; боковая группа остатка Lys210 ковалентно связана с ПЛФ. Для трех цистеинов (Cy4, Cys193 и Cys245) возле атома серы наблюдалась избыточная электронная плотность, что позволило сделать вывод об их окисленных состояниях и заменить на 3-сульфеноаланины. Структура депонирована в банк данных белковых структур (код PDB 5D5S), статистика уточнения структуры приведена в табл. 1 .
Винилглициновый хиноид (9)
ß,Y-ненасыщенный кетимин (8) X ~ 320 нм
H
Енамин (7)
Xmax ~ 320 нм
Кетиминный интермедиат (6) X ~ 320 нм
Xmax ~ 500 нм
CH3-"V
Ai
COO"
-N СН3 H
а-аминокротонат (10)
nh/ mgl
+
О
а-кетобутират (11) X ~ 320 нм
Схема. Механизм реакций ß- и у-элиминирования, катализируемых ПЛФ-зависимыми ферментами
Xmax ~ 460-480 нм
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Механизм реакций у- и в-элиминирования, приведенный на схеме, предложен в работах [50, 51]. Благодаря наличию кофермента, ПЛФ-зависимые ферменты обладают уникальными спектральными свойствами, позволяющими идентифицировать ин-термедиаты ферментативной реакции. Основные полосы поглощения внутреннего альдимина и ин-термедиатов реакций у- и в-элиминирования приведены на схеме согласно [52].
В ПЛФ-зависимых ферментах, катализирующих разнообразные реакции, начинающиеся с отрыва С-а-протона во внешнем альдимине, основанием, акцептирующим этот протон, является остаток лизина, связывающий кофермент. Предполагается, что в реакции в-элиминирования серосодержащих аминокислот, катализируемых ферментами подкласса цистатионин-в-лиазы, коферментсвязывающий остаток лизина является также общим кислотным катализатором на стадии элиминирования уходящей группы [51, 53].
В работе [54] авторы предположили, что кофер-ментсвязывающий остаток лизина цистатионин-у-лиазы переносит протон от С-а-атома к С4'-атому
ПЛФ. Исходя из структурных данных сделан вывод, что боковая цепь этого остатка может «качаться как лиана» между С-а-, C4'- и C-ß-атомами субстрата, а его е-аминогруппа также является основанием, акцептирующим C-ß-протон.
Анализ пространственной структуры комплекса C. freundii МГЛ с глицином, моделирующего структуру внешнего альдимина, позволил предположить, что ПЛФ-связывающий остаток Lys210 обеспечивает как 1,3-прототропный сдвиг С-а-протона, так и отрыв C-ß-протона [29]. Исследование мутантной формы Pseudomonas putida МГЛ с заменой Tyr114 активного центра на Phe показало, что роль общего кислотного катализатора на стадии элиминирования уходящей группы, по всей вероятности, выполняет Tyr114 [55].
Анализ пространственных структур четырех ин-термедиатов, образующихся при взаимодействии МГЛ из Entamoeba hystolytica с L-метионином, позволил предложить механизм реакции у-элимини-рования, отличный от приведенной выше схемы, исключающий стадии двух хиноидных интермеди-атов (схема, интермедиаты 3 и 9) [56]. Этот механизм постулирует образование а-аминокротоната
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 2. Кинетические параметры реакций у- и Р-элиминирования
Субстрат МГЛ, дикий тип МГЛ, Ser339Ala
k , c-1 кат Km, мМ M-1c-1 k , c-1 кат Km, мМ k /KM, M-1c-1 кат M'
L-Met 6.2 ± 0.42* 0.7 ± 0.11* 8.85 x 103 0.21 ± 0.002 1.84 ± 0.15 1.77 x 102
DL-Hcy 8.51 ± 0.41* 0.97 ± 0.15* 8.77 x 103 0.28 ± 0.009 3.39 ± 0.34 8.25 x 101
S-Et-L-Hcy 6.78 ± 0.02* 0.54 ± 0.01* 1.25 x 104 0.16 ± 0.0016 0.54 ± 0.037 2.92 x 102
O-Ac-L-Hse 2.1 ± 0.053** 2.91 ± 0.18** 7.21 x 102 0.77 ± 0.011 2.07 ± 0.22 3.73 x 102
S-Me-L-Cys 4.6 ± 0.29* 0.71 ± 0.11* 6.48 x 103 0.41 ± 0.018 21.8 ± 2.25 1.88 x 101
S-Et-L-Cys 5.03 ± 0.16* 0.17 ± 0.02* 2.96 x 104 0.67 ± 0.024 6.47 ± 0.54 1.04 x 102
S-Bzl-L-Cys 8.16 ± 0.23* 0.18 ± 0.02* 4.53 x 104 1.81 ± 0.094 5.76 ± 0.59 3.14 x 102
O-Ac-L-Ser 2.13 ± 0.037*** 4.28 ± 0.33*** 4.98 x 102 0.047 ± 0.001 16.36 ± 1.09 2.87
*Данные [35]. **Данные [36]. ***Данные [57].
вслед за Р,у-ненасыщенным кетимином в результате 1,5-сигматропного сдвига протона от С4'-атома к Су-атому, не требующего катализа.
Параметры стационарной кинетики, ингибирование реакции у-элиминирования и обмен С-а- и С-0-протонов в комплексах Ser339Ala МГЛ с ингибиторами
В табл. 2 приведены параметры стационарной кинетики реакций у- и Р-элиминирования, катализируемых МГЛ дикого типа [35, 36, 57] и мутантной формой. Замена остатка Ser339 на Ala привела к снижению скоростей реакций Р-элиминирования в 5-10 раз и у-элиминирования в 30-40 раз по сравнению с ферментом дикого типа. Величины KM в большей степени увеличились для субстратов, содержащих уходящую группу в Р-положении. Как результат, каталитическая эффективность обеих реакций снизилась одинаково, в среднем на два порядка. В случае субстратов с хорошо уходящей группой, каталитическая эффективность мутант-ной формы в реакции у-элиминирования сравнима с эффективностью МГЛ дикого типа, но в реакции Р-элиминирования O-Ac-L-Ser параметр k /КМ меньше на два порядка.
Как и для дикого типа, для мутантной формы фермента глицин, L-аланин, L-a-аминомасляная кислота, L-норвалин, L-норлейцин являются конкурентными ингибиторами физиологической реакции. Величины констант ингибирования оказались
сравнимыми с константами для МГЛ дикого типа (табл. 3).
Данные изотопного обмена протонов субстратов и ингибиторов позволяют оценить вклад отдельных стадий в ферментативную реакцию и выяснить стереохимию обмена протонов. В табл. 3 приведены результаты исследования скоростей обмена С-а- и С-Р-протонов ингибиторов, катализируемого МГЛ Ser339Alа в сравнении с МГЛ дикого типа. Замена привела к замедлению скоростей обмена С-а- и С-Р-протонов ингибиторов. Скорость обмена С-а-протона в комплексах мутантной формы фермента с глицином и норлейцином по сравнению с комплексами фермента дикого типа уменьшилась на два порядка, скорости обмена С-Р-протонов снизились на порядок.
Изучение стереоспецифичности обмена протонов глицина ферментом дикого типа показало, что соотношение скоростей обмена рго-Щ)- и рго-^)-протонов составляет 14000 : 1 [40]. Спектр 4Н-ЯМР дипептида Ь-фенилаланилглицин (данные не приведены), содержавшего глицин, выделенный после инкубации мутантной формы фермента с глицином в D2O, содержал сигнал при 3.4 м.д., характерный для метиленового рго-^)-протона глицина [41].
Нам не удалось обнаружить обмен рго-^)-протона после инкубации мутантной формы с глицином в течение длительного времени, поскольку это приводило к инактивации МГЛ Ser339Ala. Полученные данные показали, что, как и фермент
Таблица 3. Ингибирование реакции у-элиминирования ^-метионина и кинетические параметры изотопного обмена С-а- и С-Р-протонов ингибиторов
Аминокислота МГЛ, дикий тип МГЛ, Ser339A1a Количество обмениваемых С-а- и С-Р-протонов
Кж, мМ ^ с-1 Км = Кш мМ Ки, мМ ^ С-1 Км = Кп мМ
а-Н Р-Н а-Н Р-Н
С1у 48.49 ± 4.37* 20.2* - 22.87 ± 2.84 0.078 - 1, рго-^)-протон**
Ь-А1а 3.41 ± 0.40* 2.71* 2.63* 1.25 ± 0.32 0.387 0.116 1; 3
Ь-а-АЬи 8.01 ± 0.76* - - 4.66 ± 0.51 - -
Ь-^а 4.60 ± 0.43* - - 1.7 ± 0.32 - -
Ь-Ше 0.6 ± 0.06* 41.78* 4.74* 0.89 ± 0.09 0.46 0.12 1; 2
Примечание. ^ - константа ингибирования, KМ - константа Михаэлиса, ^ - константа ингибирования продуктом, характеризующая связывание фермента с продуктом изотопного обмена. *Данные [36]. **Данные [40].
Длина волны, нм Длина волны, нм
Рис. 1. Спектры поглощения: холофермента МГЛ Ser339Ala (А); комплексов МГЛ с ^-метионином: МГЛ дикого типа (сплошная линия) и МГЛ Ser339Ala (пунктирная линия) (Б). Спектры снимали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ, 1 мМ EDТА при концентрации фермента 1 мг/мл
дикого типа, мутантная форма МГЛ преимущественно обменивает рго-^)-протон.
Спектральные исследования
На рис. 1 приведены спектры поглощения холофермента Ser339Ala и его комплекса с Ь-метионином. Спектр поглощения мутантной формы фермента имеет типичный для альдиминов ПЛФ вид с основной полосой в области 420 нм и полосой в области 320 нм.
Данные логнормального разложения спектра холофермента, которое проводили, как опи-
сано для фермента дикого типа [37], приведены в табл. 4. Внутренний альдимин мутантной формы описывается четырьмя структурами: кетоенамин, его таутомер, енолимин (рис. 1А; структуры II, I) и два конформера кетоенамина - конформер, у которого альдиминная группа находится в плоскости, перпендикулярной плоскости пиридинового цикла (табл. 4, структура IIх), и конформер с альдиминной связью, выведенной из плоскости кольца кофермен-та, но с сохранением сопряжения с п-электронами кольца кофермента и водородной связи между аль-диминным атомом азота и З'-оксигруппой кофер-
Примечание. Е - энергия электронного перехода; V - волновое число; к - длина волны; е - коэффициент молярного поглощения; W — полуширина; р - асимметрия; f — сила осциллятора; п - содержание таутомеров и кон-формеров.
Надстрочные индексы (1, 2) относятся к первому и второму электронным переходам структуры II. Надстрочные индексы А) относятся к двум конформерам структуры II (конформер с альдиминной связью, находящейся в плоскости, перпендикулярной плоскости пиридинового цикла, и конформер с альдиминной связью, частично выведенной из плоскости пиридинового кольца, но сохраняющей сопряжение с п-электронами кольца кофактора и водородную связь между альдиминным азотом и З'-оксигруппой кофермента). 'Экспериментальная информация об этих полосах недостаточна.
Таблица 4. Параметры полос спектра поглощения внутреннего альдимина Ser339Ala МГЛ
Структура E, эВ v x 10-3, см-1 X, нм е x 10-3, М-1см-1 W x 10-3, см-1 Р f n, %
II1 2.92 23.58 424.1 10.46 3.58 1.55 0.18 52.9
IIa 3.24 26.10 383.1 8.27 3.87 1.37 0.03 10.4
I 3.63 29.26 341.8 9.75 3.65 1.23 0.06 20.0
II" 3.80 30.67 326.1 8.50 3.47 1.29 0.05 16.7
II2* 4.28 34.52 289.7 12.20 5.06 1.20 0.29
* 4.55 36.56 272.8 23.10 4.56 1.39 0.79
мента (табл. 4, структура П^). Параметры полос поглощения, полученные при разложении спектра, приведены в табл. 4.
Найденные структуры и параметры их полос поглощения оказались практически такими же, как у фермента дикого типа [36]. Величина константы диссоциации комплекса ПЛФ для МГЛ дикого типа составляет 6.24 х 10-4 мМ [57]. Константа диссоциации ПЛФ мутантной формы фермента составила 1.01 х 10-3 мМ. Таким образом, замена несущественно повлияла на сродство апофермента к кофермен-ту и на конформацию и таутомерию внутреннего альдимина. Она привела к некоторому изменению количественного состава таутомеров и конформе-ров внутреннего альдимина. Реакционноспособной формой внутреннего альдимина является кетоена-мин. В холоферменте дикого типа его содержание составляет 67.6% [36], в холоферменте мутантной формы - 52.9% (табл. 4).
В спектрах поглощения и кругового дихроизма комплекса МГЛ дикого типа с Ь-метионином имеются полосы с максимумами при 440 и 480 нм [36]. Эти полосы в спектрах ПЛФ-зависимых ферментов относят к интермедиатам реакций в- и у-элимини-рования - а-аминокротонату или а-аминоакрилату [54]. Наличие а-аминокротоната в спектре комплекса МГЛ дикого типа с Ь-метионином и кинетические данные взаимодействия фермента дикого типа с рядом субстратов и ингибиторов позволили предположить, что скоростьлимитирующая стадия физиологической реакции следует после стадии образования а-аминокротоната [36]. В спектре поглощения комплекса мутантной формы фермента
с L-метионином отсутствует поглощение в области 440-480 нм. Следовательно, замена Ser339 на Ala привела к торможению реакции у-элиминирования на стадии/ях, следующих за стадией внешнего аль-димина.
Пространственная структура холофермента мутантной формы
Пространственная структура Ser339Ala МГЛ определена с разрешением 1.7 А. Замена серина 339 на аланин не повлияла на пространственную структуру фермента. Общий ход полипептидной цепи Ser339Ala МГЛ остается практически таким же, как у холофермента МГЛ дикого типа (рис. 2А). Среднеквадратическое отклонение положений Са-атомов Ser339Ala МГЛ по сравнению с их положениями в структуре фермента дикого типа (код PDB 2RFV) составляет 0.29 А2. Как и в определенных нами ранее структурах C. freundii МГЛ [29-31], а также в структурах МГЛ из других микроорганизмов, для структуры Ser339Ala МГЛ характерна подвижность фрагментов N- и С-концевых участков полипептидной цепи (рис. 2А) [28]. Из-за высокой подвижности N-концевого фрагмента в структуре Ser339Ala МГЛ не локализован длинный участок, состоящий из 16 аминокислот (46-61), включающий остатки тирозина 58 и аргинина 60, боковые группы которых образуют водородные связи с 02Р-атомом фосфатной «ручки» кофермента (рис. 2Б).
Средний температурный В-фактор аминокислотных остатков, принадлежащих подвижному С-концевому фрагменту (54.02 А2, остатки 353-368), в 2 раза выше среднего температурного фактора
А
А5р240* 1_уз239*
Не241*
Р1че37*
Рис. 2. Наложение структур C. freundii МГЛ дикого типа (код PDB 2RFV; зеленый) и Ser339Ala МГЛ (код PDB 5D5S; темно-синий): А - общий ход полипептидной цепи с окраской по В-фактору от темно-синего до красного при увеличении значения; Б - фрагменты активных центров; звездочками отмечены остатки, принадлежащие соседней субъединице каталитического диме-ра. PLP - кофермент
ТИгЗб*
Рис. 3. Стереоизображение наложения фрагментов активного центра МГЛ C. freundii\ холофермент дикого типа (код PDB 2RFV, темно-синий) и комплекс с ^-циклосерином (код PDB 40МА, голубой). Звездочками отмечены остатки, принадлежащие соседней субъединице каталитического диме-ра. Альтернативные положения аминокислотных остатков показаны штриховыми линиями
стабильных участков фермента. Такая мобильность может быть связана с обеспечением вывода из активного центра фермента продуктов реакций у-и Р-элиминирования [30]. Замена серина 339 на ала-нин привела к потере водородной связи между ним и остатком треонина 36 соседней субъединицы каталитического димера (рис. 2Б), однако это не вызвало изменений в тетрамерной организации молекулы Ser339A1a МГЛ.
Пространственные структуры ковалентных и нековалентных комплексов МГЛ с ингибиторами, роль Ser339 в катализе реакций у- и в-элиминирования
В пространственной структуре холофермента C. freundii МГЛ дикого типа (код PDB 2RFV) боковая
цепь Ser339 находится в двух равновероятных положениях (рис. 3). В одном из них она располагается в области активного центра фермента рядом с Lys210, во втором - в области межсубъединичного взаимодействия с ^концевым доменом соседней субъединицы каталитического димера. Оба положения боковой цепи Ser339 стабилизированы водородными связями и хорошо различимы на карте электронной плотности.
В пространственных структурах комплексов МГЛ с ингибиторами, моделирующими комплекс Михаэлиса, внешний альдимин и кетиминный ин-термедиат, боковая цепь Ser339 занимает единственное положение, при котором его Оу-атом направлен в сторону Lys210 [29-32]. При связывании МГЛ с ингибиторами их карбоксильные группы
«выталкивают» карбонильную группу пептидной связи между Ser339 и Val338 из полости активного центра в область межсубъединичных контактов и С=О-группа поворачивается на 180° [29, 32]. При таком повороте расстояние между Oy-атомом Ser339 и атомом кислорода главной цепи Val338 сокращается до 2.12 А, это приводит к выталкиванию Oy-атома Ser339 в область активного центра фермента (рис. 3). Так обеспечивается единственное положение боковой группы Ser339, при котором его Oy-атом образует с NZ-атомом Lys210 водородную связь. Ее расстояние составляет 2.85 А в комплексе Cys115His МГЛ с L-норлейцином, моделирующим внешний альдимин [31], и 2.79 А в комплексе C. freundii МГЛ с L-циклосерином, моделирующим кетиминный интермедиат [30] (рис. 3).
Выше отмечалось, что N-концевой фрагмент МГЛ подвижен как в структурах холофермента дикого типа, так и в холоферменте Ser339Ala МГЛ. Связывание ингибиторов МГЛ дикого типа приводит к стабилизации этого фрагмента [30, 32]. Вероятно, такая стабилизация имеет место и при связывании субстратов и ингибиторов Ser339Ala МГЛ.
На рис. 4 представлены фрагменты активного центра комплекса C. freundii МГЛ с L-цикло-серином, в которых наблюдаются два положения боковой цепи Lys210.
В одном положении, аналогичном положению боковой цепи Lys210 в структуре комплекса мутантной формы с норлейцином [31], моделирующего внешний альдимин, N^-атом Lys210 стабилизирован водородными связями с гидроксильными группами боковых цепей Ser339 и Tyr58* (2.79 А и 2.82 А; рис. 4А). Боковая группа Lys210 практически перпендикулярна плоскости кольца кофермента и находится на расстоянии 3.28 А от С-а-рго-^)-протона и 3.15 А от Cß-атома L-циклосерина (рис. 4Б). Такое положение благоприятно для обеспечения отрыва С-а-рго-^)-протона или C-ß-протона боковой аминогруппой Lys210.
В другом положении N^-атом Lys210 находится на расстоянии водородной связи от гидроксильных групп боковых цепей Ser207 и Tyr58* (3.30 А и 2.96 А; рис. 4А). В этом положении N^-атом Lys210 находится наиболее близко (3.23 А) к С4'-атому ПЛФ, в то время как расстояние до Са-атома субстрата увеличивается на 0.43 А (рис. 4Б). Это положение боковой группы Lys210 благоприятно для переноса С-а-протона к С4'-атому кофермента.
Таким образом, если Tyr58* участвует в стабилизации обоих положений N^-атома Lys210, то боковые группы Ser339 и Ser207, располагающиеся с противоположных сторон от Lys210, обеспечивают оптимальное положение его е-аминогруппы на ста-
Рис. 4. А - окружение Lys210 в активном центре комплекса С. freundii МГЛ с ^-циклосерином (код PDB 40МА). Звездочками обозначены аминокислотные остатки, принадлежащие второй субъединице каталитического димера. Б - положение ^-атома азота боковой цепи Lys210 относительно С4'-атома ПЛФ, С-а- и С-Р-атомов ингибитора
диях отрыва С-а-протона во внешнем альдимине, протонировании С4'-атома ПЛФ и отрыва С-Р-протона в кетиминном интермедиате.
В комплексах мутантной формы с субстратами и ингибиторами группа Lys210 может образовывать только одну водородную связь с гидроксильной группой туг58*. Это будет приводить к нарушению оптимальной для отрыва С-а-протона конформа-ции боковой группы Lys210 и понижению ее рКа. Очевидно, этим объясняется уменьшение наблюдаемой скорости обмена С-а-протона ингибиторов. Ранее предположили, что обмен С-Р-протонов осуществляется по механизму с обращением конфигурации, когда первый протон отрывается боковой группой Lys210, а второй протон приходит с противоположной стороны от боковой группы туг113. В результате оба С-Р-протона обмениваются с одинаковой скоростью [29]. В случае мутантной формы Ser339A1a реакция изотопного обмена С-Р-протонов замедляется и оба Р-протона обмениваются с одинаковой скоростью.
Вероятно, водородная связь между ^-атомом Lys210 и Оу-атомом Ser339 обеспечивает как оптимальное для отрыва С-а- и С-Р-протонов положение аминогруппы Lys210, так и стабилизацию ее аммонийной формы для 1,3-прототропного сдвига С-а-протона к С4'-атому кофермента и эффективный обмен С-а- и С-Р-протонов в комплексах с субстратами и ингибиторами. Присутствие в спектре поглощения комплекса Ser339A1a с Ь-метионином полосы
Б
поглощения внешнего альдимина также позволяет считать, что замена серина 339 на аланин приводит к торможению физиологической реакции на стадии отрыва С-а-протона во внешнем альдимине.
Если образование а-аминокротоната происходит по механизму, предложенному в работе [50], е-аминогруппа Lys210 может принимать участие как основание или кислота на стадиях физиологической реакции, следующих за элиминированием метилмеркаптана, и замена Ser339 может приводить к замедлению этих стадий физиологической реакции.
Замена серина 339 на аланин приводит к торможению реакции в-элиминирования на стадии отрыва С-а-протона внешнего альдимина. Поскольку в ПЛФ-зависимых реакциях в-элиминирования серосодержащих аминокислот Lys210 постулируется как общий кислотный катализатор [54], возможно, гидроксильная группа Ser339 обеспечивает оптимальные для катализа положение и основность Lys210.
Ранее подобную роль остатка серина, соответствующего Ser339 МГЛ, предложили для двух ферментов структурного подкласса, к которому принадлежит МГЛ, цистатионин-у-синтазы [58] и цистатионин-в-лиазы [59].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами показано участие остатка Ser339 в механизме реакций у- и ß-элиминирования, катализируемых МГЛ из C. freundii. Используя рентгеноструктур-ные, кинетические и спектральные данные, установлено, что Ser339 необходим для обеспечения оптимального положения боковой группы Lys210 на стадии отрыва С-а-протона субстрата в реакции ß-элиминирования и стадиях отрыва С-а- и C-ß-протонов субстрата в реакции у-элиминирования. Предположено, что в реакции у-элиминирования остаток Ser339 обеспечивает необходимую основность боковой аминогруппы Lys210 на стадии 1,3-прототропного сдвига С-а-протона субстрата к С4'-атому кофермента. Понимание механизмов реакций у- и ß-элиминирования, катализируемых МГЛ, не только вносит вклад в фундаментальную энзимологию, оно необходимо для создания новых антибактериальных и противоопухолевых препаратов, основанных на изменении/улучшении субстратной и реакционной специфичности фермента.
Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных исследований государственных академий наук (№ 01201363820) и при поддержке РФФИ (проекты № 14-04-00349 и 14-04-31398).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Onuffer J.J., Kirsch J.F. // Protein Sci. 1995. V. 4. № 9. P. 1750-1757.
2. Vacca R.A., Giannattasio S., Capitani G., Marra E., Christen P. // BMC Biochem. 2008. V. 9. Р. 17.
3. Golinelli-Pimpaneau B., Lüthi C., Christen P. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 33. P. 23969-23977.
4. Belogurov A. Jr., Kozyr A., Ponomarenko N., Gabibov A. // Bioessays. 2009. V. 31. № 11. P. 1161-1171.
5. Durova O.M., Vorobiev I.I., Smirnov I.V., Reshetnyak A.V., Telegin G.B., Shamborant O.G., Orlova N.A., Genkin D.D., Bacon A., Ponomarenko N.A., et al. // Mol. Immunol. 2009. V. 47. № 1. P. 87-95.
6. Tanaka H., Esaki N., Soda K. // Enzyme Microb. Technol. 1985. V. 7. P. 530-537.
7. Фалеев Н.Г., Троицкая М.В., Ивойлов В.С., Карпова В.В., Беликов В.М. // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. № 3. С. 458-463.
8. Tokoro M., Asai T., Kobayashi S., Takeuchi T., Nozaki T. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 43. P. 42717-42727.
9. Lockwood B., Coombs G. // Biochem. J. 1991. V. 279. № 3. P. 675-682.
10. Kreis W., Hession C. // Cancer Res. 1973. V. 33. № 8. P. 1862-1865.
11. Yoshimura M., Nakano Y., Yamashita Y., Oho T., Saito T., Koga T. // Infection Immunity. 2000. V. 68. № 12. P. 69126916.
12. Nakayama T., Esaki N., Lee W.-J., Tanaka I., Tanaka H., Soda K. // Agric. Biol. Chem. 1984. V. 48. P. 2367-2369.
13. Ревтович С.В., Морозова Е.А., Ануфриева Н.В., Котлов
М.И., Белый Ю.Ф., Демидкина Т.В. // ДАН. 2012. Т. 445. № 2. С. 214-220.
14. Kulikova V.V., Morozova E.A., Revtovich S.V., Kotlov M.I., Anufrieva N.V., Bazhulina N.P., Raboni S., Faggiano S., Gabellieri E., Cion P., et al. // IUBMB Life. 2017. V. 69. № 9. P. 668-676.
15. El-Sayed A.S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 86. № 2. P. 445-467.
16. Goyer A., Collakova E., Shachar-Hill Y., Hanson A.D. // Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. № 2. P. 232-242.
17. Morozova E.A., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Kulikova V.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2014. V. 70. № 11. P. 3034-3042.
18. Ануфриева Н.В., Морозова Е.А., Куликова В.В., Бажули-на Н.П., Манухов И.В., Дёгтев Д.И., Гнучих Е.Ю., Родионов А.Н., Завильгельский Г.Б., Демидкина Т.В. // Acta Naturae. 2015. Т. 7. № 4 (27). С. 141-148.
19. Kulikova V.V., Anufrieva N.V., Revtovich S.V., Chernov A.S., Telegin G.B., Morozova E.A., Demidkina T.V. // IUBMB Life. 2016. V. 68. № 10. P. 830-835.
20. Morozova E.A., Kulikova V.V., Rodionov A.N., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Demidkina T.V. // Biochimie. 2016.
V. 128-129. P. 92-98.
21. Куликова В.В., Чернуха М.Ю., Морозова Е.А., Ревтович С.В., Родионов А.Н., Коваль В.С., Аветисян Л.Р., Кулястова Д.Г., Шагинян И.А., Демидкина Т.В. // Acta Naturae. 2018. T. 10. № 3 (38). C. 83-87.
22. Yoshioka T., Wada T., Uchida N., Maki H., Yoshida H., Ide N., Kasai H., Hojo K., Shono K., Maekawa R., et al. // Cancer Res. 1998. V. 58. № 12. P. 2583-2587.
23. Miki K., Al-Refaie W., Xu M., Jiang P., Tan Y., Bouvet M., Zhao M., Gupta A., Chishima T., Shimada H., et al. // Cancer Res. 2000. V. 60. № 10. P. 2696-2702.
24. Tan Y., Xu M., Hoffman R.M. // Anticancer Res. 2010. V. 30. № 4. P. 1041-1046.
25. Hoffman R.M. // Expert Opin. Biol. Ther. 2015. V. 15. № 1. P. 21-31.
26. Kack H., Sandmark J., Gibson K., Schneider G., Lindqvist Y. // J. Mol. Biol. 1999. V. 291. № 4. P. 857-876.
27. Mamaeva D.V., Morozova E.A., Nikulin A.D., Revtovich S.V., Nikonov S.V., Garber M.B., Demidkina T.V. // Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 2005. V. 61. № 6. P. 546-549.
28. Nikulin A., Revtovich S., Morozova E., Nevskaya N., Nikonov S., Garber M., Demidkina T. // Acta Crystallogr. Sect. D. 2008. V. D64. № 2. P. 211-218.
29. Revtovich S.V., Faleev N.G., Morozova E.A., Anufrieva N.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Biochimie. 2014. V. 101. P. 161-167.
30. Kuznetsov N.A., Faleev N.G., Kuznetsova A.A., Morozova E.A., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Nikulin A.D., Fedorova O.S., Demidkina T.V. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. № 1.
P. 671-681.
31. Revtovich S.V., Morozova E.A., Kulikova V.V., Anufrieva N.V., Osipova T.I., Koval V.S., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // BBA-Proteins Proteom. 2017. V. 1865. № 9. P. 1123-1128.
32. Ревтович С.В., Морозова Е.А., Хурс Е.Н., Закомырдина Л.Н., Никулин А.Д., Демидкина Т.В., Хомутов Р.М. // Биохимия. 2011. Т. 76. № 5. С. 690-698.
33. Nagai S., Flavin M. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. № 17. P. 3884-3895.
34. Morneau D.J.K., Abouassaf E., Skanes J.E., Aitken S.M. // Anal. Biochem. 2012. V. 423. № 1. P. 78-85.
35. Манухов И.В., Мамаева Д.В., Морозова Е.А., Расторгуев С.М., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В., Завильгельский Г.Б. // Биохимия. 2006. Т. 71. № 4. С. 454-463.
36. Морозова Е.А., Бажулина Н.П., Ануфриева Н.В., Ткачев Я.В., Стрельцов С.А., Тимофеев В.П., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 10. С. 1435-1445.
37. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.
38. Cleland W.W. // Methods Enzymol. 1979. V. 63. P. 103-138.
39. Фалеев Н.Г., Рувинов С.Б., Бахмутов В.И., Демидкина Т.В., Мягких И.В., Беликов В.М. // Молекуляр. биология. 1987. Т. 21. С. 1636-1644.
40. Koulikova V.V., Zakomirdina L.N., Gogoleva O.I., Tsvetikova M.A., Morozova E.A., Komissarov V.V., Tkachev Y.V., Timofeev V.P., Demidkina T.V., Faleev N.G. // Amino Acids. 2011. V. 41. № 5. P. 1247-1256.
41. Kainosho M., Ajisaka K., Kamisaku M., Murai A., Kyogoku
Y. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 64. № 1. P. 425-432.
42. Morino Y., Snell E.E. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. № 23. P. 5591-5601.
43. Peterson E.A., Sober H.A. // J. Am. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 169-175.
44. Osterman A.L., Brooks H.B., Rizo J., Phillips M.A. // Biochemistry. 1997. V. 36. № 15. P. 4558-4567.
45. Scatchard G. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1949. V. 51. P. 660-672.
46. Kabsch W. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr.
2010. V. 66. № 2. P. 125-132.
47. Winn M.D., Ballard C.C., Cowtan K.D., Dodson E.J., Emsley P., Evans P.R., Keegan R.M., Krissinel E.B., Leslie A.G., McCoy A., et al. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr.
2011. V. 67. № 2. P. 235-242.
48. Adams P.D., Grosse-Kunstleve R.W., Hung L.-W., Ioerger T.R., McCoy A.J., Moriarty N.W., Read R.J., Sacchettini J.C., Sauter N.K., Terwilliger T.C. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2002. V. 58. № 11. P. 1948-1954.
49. Emsley P., Lohkamp B., Scott W., Cowtan K. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010. V. 66. № 4. P. 486-501.
50. Brzovic P., Holbrook E.L., Greene R.C., Dunn M.F. // Biochemistry. 1990. V. 29. № 2. P. 442-451.
51. Clausen T., Huber R., Laber B., Pohlenz H.D., Messerschmidt A. // J. Mol. Biol. 1996. V. 262. № 2. P. 202224.
52. Davis L., Metzler D. The Enzymes. 3rd Edn. V. 7 / Ed. Boyer P.D. N.Y.: Acad. Press, 1972. P. 33-74. https://www. elsevier.com/books/the-enzymes/boyer/978-0-12-122707-4
53. Clausen T., Huber R., Prade L., Wahl M.C., Messerschmidt A. // EMBO J. 1998. V. 17. № 23. P. 6827-6838.
54. Messerschmid A., Worbs M., Steegborn C., Wahl M.C., Huber R., Laber B., Clausen T. // Biol. Chem. 2003. V. 384. № 3. P. 373-386.
55. Inou H., Inagaki K., Adachi N., Tamura T., Esaki N., Soda K., Tanaka H. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64. № 11. P. 2336-2343.
56. Sato D., Shiba T., Karaki T., Yamagat W., Nozaki T., Nakazawa T., Harada S. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. P. 4874.
57. Anufrieva N.V., Faleev N.G., Morozova E.A., Bazhulina N.P., Revtovich S.V., Timofeev V.P., Tkachev Y.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Biochim. Biophys. Acta. 2015. V. 1854. № 9. P. 1220-1228.
58. Jaworski A.F., Lodha P.H., Manders A.L., Aitken S.M. // Protein Sci. 2012. V. 21. № 11. P. 1662-1671.
59. Lodha P.H., Aitken S.M. // Biochemistry. 2011. V. 50. № 45. P. 9876-9885.