Научная статья на тему 'CITROBACTER FREUNDII МЕТИОНИН-γ-ЛИАЗА: РОЛЬ СЕРИНА 339 В КАТАЛИЗЕ РЕАКЦИЙ γ- И β-ЭЛИМИНИРОВАНИЯ'

CITROBACTER FREUNDII МЕТИОНИН-γ-ЛИАЗА: РОЛЬ СЕРИНА 339 В КАТАЛИЗЕ РЕАКЦИЙ γ- И β-ЭЛИМИНИРОВАНИЯ Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

CC BY
24
3
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Acta Naturae (русскоязычная версия)
WOS
Scopus
ВАК
RSCI
PubMed
Область наук
Ключевые слова
МЕТИОНИН-γ-ЛИАЗА / ПИРИДОКСАЛЬ-5'-ФОСФАТ / SER339 / МУТАНТНАЯ ФОРМА / КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ / СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ / ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Ануфриева Наталья Валерьевна, Морозова Елена Андреевна, Ревтович Светлана Владимировна, Бажулина Наталия Павловна, Тимофеев Владимир Петрович

Остаток активного центра Citrobacter freundii метионин-γ-лиазы (МГЛ) серин 339 является консервативным у большинства пиридоксаль-5’-фосфат-зависимых ферментов структурного подкласса цистатионин-β-лиазы, к которому принадлежит МГЛ. Механизм реакции γ-элиминирования, катализируемой МГЛ, изучен недостаточно. Методом сайт-направленного мутагенеза серин 339 был заменен на аланин. Замена серина 339 на аланин привела к существенному (на два порядка) снижению эффективности катализа мутантной формой фермента реакций γ- и β-элиминирования. Скорости обмена С-α- и C-β-протонов аминокислот в комплексах фермента с конкурентными ингибиторами снизились на один-два порядка. Спектральные характеристики мутантной формы фермента свидетельствуют, что замена не приводит к существенным изменениям конформации и таутомерии внутреннего альдимина МГЛ. Получены кристаллы холофермента и его пространственная структура определена c разрешением 1.7 Å. Замена серина 339 на аланин не повлияла на общий ход полипептидной цепи субъединицы МГЛ и тетрамерную организацию молекулы фермента. Анализ кинетических, спектральных данных и известных пространственных структур C. freundii МГЛ свидетельствует, что остаток серина 339 необходим для эффективного катализа реакций γ- и β-элиминирования на стадии отрыва С-α-протона внешнего альдимина и в реакции γ-элиминирования на стадиях протонирования С4’-атома кофермента и отрыва С-β-протона в кетиминном интермедиате.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Ануфриева Наталья Валерьевна, Морозова Елена Андреевна, Ревтович Светлана Владимировна, Бажулина Наталия Павловна, Тимофеев Владимир Петрович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

CITROBACTER FREUNDII METHIONINE γ-LYASE: THE ROLE OF SERINE 339 IN THE CATALYSIS OF γ- AND β-ELIMINATION REACTIONS

Serine 339 of the active site of Citrobacter freundii methionine γ-lyase (MGL) is a conserved amino acid in most pyridoxal 5’-phosphate-dependent enzymes of the cystathionine β-lyase subclass, to which MGL belongs. The reaction mechanism of the MGL-catalyzed γ-elimination reaction is poorly explored. We replaced serine 339 with alanine using site-directed mutagenesis. The replacement of serine 339 with alanine led to a significant (by two orders of magnitude) decrease in efficiency in the catalysis of the γ- and β-elimination reactions by the mutant form of the enzyme. The exchange rates of the C-α- and C-β-protons in the amino acids in complexes consisting of the enzyme and competitive inhibitors decreased by one-two orders of magnitude. The spectral characteristics of the mutant form indicated that the replacement did not lead to significant changes in the conformation and tautomerism of MGL internal aldimine. We crystallized the holoenzyme and determined its spatial structure at 1.7 Å resolution. The replacement of serine 339 with alanine did not affect the overall course of the polypeptide chain of the MGL subunit and the tetrameric enzyme structure. An analysis of the obtained kinetic and spectral data, as well as the known spatial structures of C. freundii MGL, indicates that serine 339 is necessary for efficient catalysis of γ- and β-elimination reactions at the stage of C-α-proton abstraction from the external aldimine, the γ-elimination reaction at the stages of coenzyme C4’-atom protonation, and C-β-proton abstraction from a ketimine intermediate.

Текст научной работы на тему «CITROBACTER FREUNDII МЕТИОНИН-γ-ЛИАЗА: РОЛЬ СЕРИНА 339 В КАТАЛИЗЕ РЕАКЦИЙ γ- И β-ЭЛИМИНИРОВАНИЯ»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 577.151.45

Посвящается 120-летию со дня рождения академика Александра Евсеевича Браунштейна

Citrobacter freundii метионин—у-лиаза: роль серина 339 в катализе реакций Y- и в-элиминирования

Н. В. Ануфриева1, Е. А. Морозова1, С. В. Ревтович1, Н. П. Бажулина1, В. П. Тимофеев 1, Я. В. Ткачев1, Н. Г. Фалеев 2, А. Д. Никулин3, Т. В. Демидкина1*

1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, 119991 Россия

2Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, 119991 Россия

3Институт белка РАН, Пущино, Московская обл., 142290 Россия

*E-mail: tvdemidkina@yandex.ru

Поступила в редакцию 22.10.2020

Принята к печати 21.07.2021

DOI: 10.32607/actanaturae.11242

РЕФЕРАТ Остаток активного центра Citrobacter freundii метионин-у-лиазы (МГЛ) серин 339 является консервативным у большинства пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов структурного подкласса цистатионин-в-лиазы, к которому принадлежит МГЛ. Механизм реакции у-элиминирования, катализируемой МГЛ, изучен недостаточно. Методом сайт-направленного мутагенеза серин 339 был заменен на аланин. Замена серина 339 на аланин привела к существенному (на два порядка) снижению эффективности катализа мутантной формой фермента реакций у- и в-элиминирования. Скорости обмена С-а- и C-в-протонов аминокислот в комплексах фермента с конкурентными ингибиторами снизились на один-два порядка. Спектральные характеристики мутантной формы фермента свидетельствуют, что замена не приводит к существенным изменениям конформации и таутомерии внутреннего альди-мина МГЛ. Получены кристаллы холофермента и его пространственная структура определена c разрешением 1.7 А. Замена серина 339 на аланин не повлияла на общий ход полипептидной цепи субъединицы МГЛ и тетрамерную организацию молекулы фермента. Анализ кинетических, спектральных данных и известных пространственных структур C. freundii МГЛ свидетельствует, что остаток серина 339 необходим для эффективного катализа реакций у- и в-элиминирования на стадии отрыва С-а-протона внешнего альдимина и в реакции у-элиминирования на стадиях протонирования С4'-атома кофермента и отрыва С-в-протона в кетиминном интермедиате.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА метионин-у-лиаза, пиридоксаль-5'-фосфат, Ser339, мутантная форма, кинетические параметры, спектральные характеристики, пространственная структура.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ МГЛ - метионин-у-лиаза; ПЛФ - пиридоксаль-5'-фосфат; ЛДГ - лактатдегидро-геназа; HOHxoDH - D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназа.

ВВЕДЕНИЕ

Пиридоксаль-5'-фосфат (ПЛФ)-зависимые ферменты определяют жизнедеятельность большинства про- и эукариот. Особенностью этих биокатализаторов является возможность осуществления широкого спектра химических превращений аминокислот и аминов с участием кофактора. Субстратная и реакционная специфичности каждого конкретного фермента обеспечиваются взаимодействием кофактора и субстрата с апоферментом. Исследования ПЛФ-зависимых ферментов и данные рентге-ноструктурного анализа позволили существенно продвинуть знания о взаимоотношении структу-

ра-функция в ферментативном катализе и еще в 1995 году использовать рациональный дизайн для изменения субстратной специфичности в ПЛФ-зависимом катализе [1]. Определение кристаллических структур ПЛФ-зависимых ферментов, принадлежащих к различным классам, способствовало расширению знания о критических остатках для химически различных ферментативных реакций и формулировке ряда принципиальных идей в области биокатализа. Замена коферментсвязываю-щей белковой матрицы на матрицу суперсемейства иммуноглобулинов показала правильность основных выводов о механизмах превращений аминокислот

этими ферментами и возможности предсказания изменения ферментативной активности [2-5].

Метионин-у-лиаза (МГЛ, [КФ 4.4.1.11]) - ПЛФ-зависимый фермент, катализирующий реакции у-элиминирования L-метионина, ß-элиминирования L-цистеина и их S-замещенных производных, а также реакции у- и ß-замещения L-метионина, L-цистеина и их аналогов [6, 7]. Фермент найден у патогенных простейших [8, 9], в ряде бактерий, в том числе патогенных [10-14], грибах [15] и растениях [16].

Недавно нами было показано, что МГЛ катализирует реакцию ß-элиминирования сульфоксидов S-замещенных аналогов цистеина с образованием тиосульфинатов [17, 18]. Антибактериальная активность тиосульфинатов, получаемых «фармакологической парой» МГЛ/сульфоксид S-замещенного L-цистеина, показана in vitro против ряда бактерий [18-20] и in vivo против Pseudomonas aueroginosa [21]. Перспективность применения фермента в качестве противоопухолевого агента показана in vitro и in vivo [22-25].

Механизмы физиологической реакции и реакций ß-элиминирования и замещения, катализируемых МГЛ, мало исследованы. Исследование этих механизмов вносит вклад не только в фундаментальную энзимологию, оно необходимо для создания новых антибактериальных и противоопухолевых препаратов.

МГЛ принадлежит к структурному подклассу цистатионин^-лиазы с типом укладки I полипептидной цепи ПЛФ-зависимых ферментов [26]. В те-трамерной молекуле МГЛ, образованной четырьмя идентичными полипептидными цепями, две субъединицы формируют два так называемых «каталитических димера», в каждом из которых аминокислотные остатки из двух субъединиц образуют два активных центра [27, 28].

Определение трехмерных структур комплексов МГЛ с конкурентными ингибиторами, глицином [29], циклосерином [30] и норлейцином [31, 32] показало, что остаток активного центра фермента, Ser339, консервативный в подклассе цистатионин^-лиазы, участвует, по всей вероятности, в оптимальной для катализа ориентации боковой группы Lys210, связывающей кофермент.

Для изучения роли остатка Ser339 в катализе реакций y- и ß-элиминирования методом сайт-направленного мутагенеза получена мутантная форма фермента с заменой Ser339Ala, определены пространственная структура холофермента, стационарные кинетические параметры реакций Y- и ß-элиминирования ряда субстратов, скорости обмена С-а- и C-ß-протонов аминокислот в ком-

плексах Ser339Ala МГЛ с ингибиторами и спектральные характеристики мутантной формы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы и материалы

В работе использованы: L-метионин, L-норвалин, L-норлейцин, L-а-аминомасляная кислота, глицин, L-аланин, L-гомосерин, L-гомоцистеин, L-фенилаланин, DL-пеницилламин, фенилметил-сульфонилфторид, лактатдегидрогеназа из мышцы кролика (ЛДГ), дитиотреитол (ДТТ), NADH и D2O (Sigma, США); пиридоксаль-5'-фосфат (Merck, Германия); S-этил-L-цистеин, S-метил-L-цистеин, S-бензил-L-цистеин, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), протаминсульфат, додецилсуль-фат натрия (SDS) (Serva, США); лактоза (Panreac, Испания); глюкоза, глицерин, сульфат магния, сульфат аммония, калий фосфорнокислый одноза-мещенный, натрий фосфорнокислый двузамещен-ный, уксусная кислота, уксусный ангидрид, триэ-таноламин, HClO4 («Реахим», Россия); дрожжевой экстракт, триптон (Difco, США); DEAE-целлюлоза (Whatmann, Англия); супердекс 200 (Amersham Biosciences, Швеция); плазмиды Bluescript II SK(+/-) и pET28 (Novagen, США); набор для выделения ДНК, эндонуклеазы рестрикции Bsp119I и Bvel (Fermentas, Литва). О-Ацетил^-гомосерин получен ацетилированием L-гомосерина [33]; D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназа (HOHxoDH) получена согласно [34].

Сайт-направленный мутагенез

Сайт-направленный мутагенез проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы использовали плазмиду mglBlue, полученную клонированием гена МГЛ в вектор Bluescript II SK(+/-). Для замены Ser339 на Ala использовали следующие синтетические олигонуклеотиды (F -прямой праймер, R - обратный праймер): (F) TATCAGCTTCGAATCGCTGGC, (RS339/A) GTATCACCGAGAGCGACCGCGA, (FS339/A) TCGCGGTCGCTCTCGGTGATAC, (R) ATACCTGCTTTAAGCCGCTCTTCTGGCGCA.

После проведения ПЦР из реакционной смеси выделяли ампликон (использовали набор для выделения ДНК). Очищенный препарат ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Bsp119I и BveI и лигировали с вектором mglBlue, обработанным этими же ферментами. Полученную смесь трансформировали электропорацией в клетки Escherichia coli DH10B и выращивали на твердой среде (1.8% агар на среде Лурия-Бертани (LB) с ампициллином). Выращенные колонии переносили в жидкую

среду LB с добавлением ампициллина и растили в течение 15-18 ч. Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора для выделения плазмид и идентифицировали путем аналитической рестрикции. Фрагмент, содержащий замену Ser339Ala, был переклонирован из плазмиды mglBlue в pET28. Точность клонирования контролировали путем сек-венирования вставки ДНК (ЦКП «Геном», Москва). Клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали плаз-мидой, содержащей необходимую вставку.

Выращивание бактериальной массы и очистка фермента

Клетки E. coli BL21(DE3), содержащие плазмиду с геном мутантной формы, выращивали и очищали фермент как описано ранее [35]. Концентрацию очищенных препаратов фермента определяли по поглощению при 278 нм, используя коэффициент поглощения А1см01% = 0.8 [36].

Гомогенность препаратов проверяли ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях [37]. Активность в процессе очистки определяли в реакции в-элиминирования, активность конечного препарата определяли в реакциях в- и у-элиминирования. Реакционная смесь содержала 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 8.0, 0.1 мМ ПЛФ, 1 мМ ДТТ, 0.2 мМ NADH, 10 ед. ЛДГ и 30 мМ S-этил-Ь-цистеин (реакция в-элиминирования) или 70 мкг HOHxoDH и 30 мМ L-метионин (реакция у-элиминирования). За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1.0 мкМ/мин кетокислоты. Удельная активность препаратов фермента 95%-ной чистоты была равна 0.31 ед/мг в реакции у-элиминирования L-метионина и 1.03 ед/мг в реакции в-элиминирования S-этил-L-цистеина.

Кинетические исследования

Кинетические параметры реакций у- и в-элиминирования определяли при 30°C в сопряженной реакции с HOHxoDH или ЛДГ по уменьшению поглощения NADH при 340 нм (е = 6220 М-1см-1). Реакционные смеси содержали 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 8.0, 0.1 мМ ПЛФ, 1 мМ ДТТ, 0.2 мМ NADH, 70 мкг HOHxoDH или 10 ед. ЛДГ и варьируемые количества субстратов в общем объеме 1 мл. Реакцию инициировали добавлением 10 мкг фермента.

Ингибирование реакции у-элиминирования L-метионина различными аминокислотами исследовали в условиях, описанных выше, варьируя количества ингибитора в пробах.

Кинетические параметры обрабатывали согласно уравнению Михаэлиса-Ментен, используя програм-

му EnzFitter [38]. В расчетах использовали величину молекулярной массы субъединицы фермента, равную 43 кДа. Значения констант ингибирования также определяли с помощью программы EnzFitter [38].

Изотопный обмен С-а- и С-0-протонов ингибиторов в комплексах с ферментом

Кинетику реакций изотопного обмена С-а- и C-P-протонов ингибиторов на дейтерон, катализируемых мутантной формой, регистрировали с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии. Реакцию проводили в D2O, содержащей 50 мМ калий-фосфат (pD = 7.6), 0.1 мМ ПЛФ и ингибитор в общем объеме 0.5 мл при 30°С и концентрации L-аланина и L-норлейцина 144.23 и 98.04 мМ. Реакцию инициировали, добавляя 0.3-0.7 мг фермента. Спектры 1Н-ЯМР записывали через определенные интервалы времени на спектрометре Bruker AMXIII-400 c рабочей частотой 400 МГц. Сигналы С-а- и С-Р-протонов интегрировали с помощью модифицированной программы автоматизации enzkin, входящей в состав XWIN_NMR-программ. Кинетические кривые накопления дейтерированных продуктов обрабатывали по методу, описанному в [39].

Изотопный обмен протонов глицина проводили в D2O, pD = 7.6, содержащей 50 мМ калий-фосфат, 0.1 мМ ПЛФ, 60 мг глицина и 3.6 мг фермента. После инкубирования в течение 72 ч при 30°С фермент инактивировали нагреванием (90°С, 5 мин) и отделяли центрифугированием. Растворитель удаляли на роторном испарителе. Для определения конфигурации у С-а-атома дейтерированный продукт был превращен в дипептид, L-фенилаланил-^-глицин в реакции с Boc-L-Phe-ONp [40, 41]. Дипептид растворяли в 0.5 мл D2O, и 1Н-ЯМР-спектр записывали на спектрометре Bruker AMXIII-400 с рабочей частотой 400 МГц.

Спектральные исследования

Спектры поглощения холофермента и его комплекса с метионином регистрировали при 25°С на спектрофотометре Cary-50 (Varian, США) в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ, 1 мМ EDTA, 20 мМ L-метионина при концентрации фермента 1 мг/мл.

Получение холофермента и апофермента

Апофермент и холофермент получали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ, 1 мМ EDTA. Холофермент получали добавлением 50-кратного молярного избытка ПЛФ. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 25°С. Избыток ПЛФ удаляли диализом. Для получения апофер-мента к препарату добавляли 100-кратный моляр-

ный избыток DL-пеницилламина [42]. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 25°C. DL-пеницилламин удаляли диализом. Процедуру повторяли до тех пор, пока активность фермента не снизилась до 1% от начальной. Содержание ПЛФ в препарате определяли в 100 мМ NaOH, используя значение молярного коэффициента поглощения ПЛФ при 390 нм, равное 6600 М-1 см-1 [43].

Определение константы диссоциации кофермента

Для определения константы диссоциации ПЛФ использовали метод ультрафильтрации [44]. Варьируемые количества ПЛФ (в диапазоне 5 х 10-3-1.2 х 10-1 мМ) добавляли к 8 х 10-3 мМ раствору апофермента в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ и 1 мМ EDTA. После 30 мин инкубации при 30°C свободный ПЛФ отделяли ультрафильтрацией на Centricon-30 microconcentrator (Amicon, США) центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об/мин и 4°C. Содержание ПЛФ в каждой пробе определяли в 100 мМ NaOH. Данные обрабатывали в координатах Скэтчарда [45].

Кристаллизация и сбор данных

Кристаллы МГЛ Ser339Ala получали методом диффузии паров в висящей капле в условиях, приведенных в [28]. Кристаллы, пригодные для сбора дифракционных данных, образовывались в течение 10 дней и имели ромбическую форму. Дифракционные данные были собраны на источнике синхротронного излучения, линия BESSY BEAMLINE 14.1 (Берлин, Германия), с использованием детектора MARMOSAIC 225 mm CCD при 100 К и обработаны в программном комплексе XDS [46] (табл. 1).

Определение и уточнение пространственной структуры Ser339Ala МГЛ

Структура МГЛ Ser339Ala решена методом молекулярного замещения с помощью программного комплекса CCP4 [47] и использованием в качестве модели определенной нами ранее структуры C. freundii МГЛ (1.35 А, код PDB 2RFV), из которой были исключены подвижные участки фермента, молекулы воды и кофермент. Для полученной модели была рассчитана карта электронной плотности. Дальнейший расчет структуры проводили с использованием протоколов уточнения Phenix [48] с минимизацией энергии и оптимизацией геометрии модели с последующей ручной правкой в программе COOT [49]. Процесс уточнения контролировали с использованием фактора достоверности модели

Таблица 1. Статистические характеристики дифракционных данных и уточненной структуры Ser339Ala МГЛ

Пространственная группа I222

Параметры элементарной ячейки, А a = 56.66, b = 123.09, с = 128.79 a = в = Y = 90°

Длина волны, А 0.91841

Разрешение, А 30.0-1.70 (1.79-1.70)

Полнота набора, % 99.4 (97.5)

Избыточность 7.0 (6.3)

Rmerge, % 4.5 (34.9)

Неупорядоченные аминокислотные остатки в структуре белка 1, 46-61, 398

Число неводородных атомов белка 2879

Число молекул воды 393

Число уникальных отражений 49574 (7001)

^^^ Rfree 0.173/0.205 (0.243/0.285)

Средний температурный фактор B, А макромолекулы растворителя 29.28 27.51 41.64

Среднеквадратическое отклонение от идеальных значений

длин связей 0.007 А

валентных углов 1.095°

хиральных углов 0.047°

планарных углов 0.005°

Область расположения аминокислотных остатков на карте Рамачандрана

наиболее предпочтительная, % 98.64

дополнительно разрешенная, % 1.36

допустимая, % 0.0

Примечание. В скобках приведены значения для слоя высокого разрешения.

Rfree, рассчитанный по 5% отражений, исключенных из уточнения. Окончательная модель уточнена до разрешения 1.70 А с показателями R , и R,

work free

17.3 и 20.5%. Модель содержит 2879 неводородных атомов белка и 393 молекулы воды; боковая группа остатка Lys210 ковалентно связана с ПЛФ. Для трех цистеинов (Cy4, Cys193 и Cys245) возле атома серы наблюдалась избыточная электронная плотность, что позволило сделать вывод об их окисленных состояниях и заменить на 3-сульфеноаланины. Структура депонирована в банк данных белковых структур (код PDB 5D5S), статистика уточнения структуры приведена в табл. 1 .

Винилглициновый хиноид (9)

ß,Y-ненасыщенный кетимин (8) X ~ 320 нм

H

Енамин (7)

Xmax ~ 320 нм

Кетиминный интермедиат (6) X ~ 320 нм

Xmax ~ 500 нм

CH3-"V

Ai

COO"

-N СН3 H

а-аминокротонат (10)

nh/ mgl

+

О

а-кетобутират (11) X ~ 320 нм

Схема. Механизм реакций ß- и у-элиминирования, катализируемых ПЛФ-зависимыми ферментами

Xmax ~ 460-480 нм

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Механизм реакций у- и в-элиминирования, приведенный на схеме, предложен в работах [50, 51]. Благодаря наличию кофермента, ПЛФ-зависимые ферменты обладают уникальными спектральными свойствами, позволяющими идентифицировать ин-термедиаты ферментативной реакции. Основные полосы поглощения внутреннего альдимина и ин-термедиатов реакций у- и в-элиминирования приведены на схеме согласно [52].

В ПЛФ-зависимых ферментах, катализирующих разнообразные реакции, начинающиеся с отрыва С-а-протона во внешнем альдимине, основанием, акцептирующим этот протон, является остаток лизина, связывающий кофермент. Предполагается, что в реакции в-элиминирования серосодержащих аминокислот, катализируемых ферментами подкласса цистатионин-в-лиазы, коферментсвязывающий остаток лизина является также общим кислотным катализатором на стадии элиминирования уходящей группы [51, 53].

В работе [54] авторы предположили, что кофер-ментсвязывающий остаток лизина цистатионин-у-лиазы переносит протон от С-а-атома к С4'-атому

ПЛФ. Исходя из структурных данных сделан вывод, что боковая цепь этого остатка может «качаться как лиана» между С-а-, C4'- и C-ß-атомами субстрата, а его е-аминогруппа также является основанием, акцептирующим C-ß-протон.

Анализ пространственной структуры комплекса C. freundii МГЛ с глицином, моделирующего структуру внешнего альдимина, позволил предположить, что ПЛФ-связывающий остаток Lys210 обеспечивает как 1,3-прототропный сдвиг С-а-протона, так и отрыв C-ß-протона [29]. Исследование мутантной формы Pseudomonas putida МГЛ с заменой Tyr114 активного центра на Phe показало, что роль общего кислотного катализатора на стадии элиминирования уходящей группы, по всей вероятности, выполняет Tyr114 [55].

Анализ пространственных структур четырех ин-термедиатов, образующихся при взаимодействии МГЛ из Entamoeba hystolytica с L-метионином, позволил предложить механизм реакции у-элимини-рования, отличный от приведенной выше схемы, исключающий стадии двух хиноидных интермеди-атов (схема, интермедиаты 3 и 9) [56]. Этот механизм постулирует образование а-аминокротоната

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 2. Кинетические параметры реакций у- и Р-элиминирования

Субстрат МГЛ, дикий тип МГЛ, Ser339Ala

k , c-1 кат Km, мМ M-1c-1 k , c-1 кат Km, мМ k /KM, M-1c-1 кат M'

L-Met 6.2 ± 0.42* 0.7 ± 0.11* 8.85 x 103 0.21 ± 0.002 1.84 ± 0.15 1.77 x 102

DL-Hcy 8.51 ± 0.41* 0.97 ± 0.15* 8.77 x 103 0.28 ± 0.009 3.39 ± 0.34 8.25 x 101

S-Et-L-Hcy 6.78 ± 0.02* 0.54 ± 0.01* 1.25 x 104 0.16 ± 0.0016 0.54 ± 0.037 2.92 x 102

O-Ac-L-Hse 2.1 ± 0.053** 2.91 ± 0.18** 7.21 x 102 0.77 ± 0.011 2.07 ± 0.22 3.73 x 102

S-Me-L-Cys 4.6 ± 0.29* 0.71 ± 0.11* 6.48 x 103 0.41 ± 0.018 21.8 ± 2.25 1.88 x 101

S-Et-L-Cys 5.03 ± 0.16* 0.17 ± 0.02* 2.96 x 104 0.67 ± 0.024 6.47 ± 0.54 1.04 x 102

S-Bzl-L-Cys 8.16 ± 0.23* 0.18 ± 0.02* 4.53 x 104 1.81 ± 0.094 5.76 ± 0.59 3.14 x 102

O-Ac-L-Ser 2.13 ± 0.037*** 4.28 ± 0.33*** 4.98 x 102 0.047 ± 0.001 16.36 ± 1.09 2.87

*Данные [35]. **Данные [36]. ***Данные [57].

вслед за Р,у-ненасыщенным кетимином в результате 1,5-сигматропного сдвига протона от С4'-атома к Су-атому, не требующего катализа.

Параметры стационарной кинетики, ингибирование реакции у-элиминирования и обмен С-а- и С-0-протонов в комплексах Ser339Ala МГЛ с ингибиторами

В табл. 2 приведены параметры стационарной кинетики реакций у- и Р-элиминирования, катализируемых МГЛ дикого типа [35, 36, 57] и мутантной формой. Замена остатка Ser339 на Ala привела к снижению скоростей реакций Р-элиминирования в 5-10 раз и у-элиминирования в 30-40 раз по сравнению с ферментом дикого типа. Величины KM в большей степени увеличились для субстратов, содержащих уходящую группу в Р-положении. Как результат, каталитическая эффективность обеих реакций снизилась одинаково, в среднем на два порядка. В случае субстратов с хорошо уходящей группой, каталитическая эффективность мутант-ной формы в реакции у-элиминирования сравнима с эффективностью МГЛ дикого типа, но в реакции Р-элиминирования O-Ac-L-Ser параметр k /КМ меньше на два порядка.

Как и для дикого типа, для мутантной формы фермента глицин, L-аланин, L-a-аминомасляная кислота, L-норвалин, L-норлейцин являются конкурентными ингибиторами физиологической реакции. Величины констант ингибирования оказались

сравнимыми с константами для МГЛ дикого типа (табл. 3).

Данные изотопного обмена протонов субстратов и ингибиторов позволяют оценить вклад отдельных стадий в ферментативную реакцию и выяснить стереохимию обмена протонов. В табл. 3 приведены результаты исследования скоростей обмена С-а- и С-Р-протонов ингибиторов, катализируемого МГЛ Ser339Alа в сравнении с МГЛ дикого типа. Замена привела к замедлению скоростей обмена С-а- и С-Р-протонов ингибиторов. Скорость обмена С-а-протона в комплексах мутантной формы фермента с глицином и норлейцином по сравнению с комплексами фермента дикого типа уменьшилась на два порядка, скорости обмена С-Р-протонов снизились на порядок.

Изучение стереоспецифичности обмена протонов глицина ферментом дикого типа показало, что соотношение скоростей обмена рго-Щ)- и рго-^)-протонов составляет 14000 : 1 [40]. Спектр 4Н-ЯМР дипептида Ь-фенилаланилглицин (данные не приведены), содержавшего глицин, выделенный после инкубации мутантной формы фермента с глицином в D2O, содержал сигнал при 3.4 м.д., характерный для метиленового рго-^)-протона глицина [41].

Нам не удалось обнаружить обмен рго-^)-протона после инкубации мутантной формы с глицином в течение длительного времени, поскольку это приводило к инактивации МГЛ Ser339Ala. Полученные данные показали, что, как и фермент

Таблица 3. Ингибирование реакции у-элиминирования ^-метионина и кинетические параметры изотопного обмена С-а- и С-Р-протонов ингибиторов

Аминокислота МГЛ, дикий тип МГЛ, Ser339A1a Количество обмениваемых С-а- и С-Р-протонов

Кж, мМ ^ с-1 Км = Кш мМ Ки, мМ ^ С-1 Км = Кп мМ

а-Н Р-Н а-Н Р-Н

С1у 48.49 ± 4.37* 20.2* - 22.87 ± 2.84 0.078 - 1, рго-^)-протон**

Ь-А1а 3.41 ± 0.40* 2.71* 2.63* 1.25 ± 0.32 0.387 0.116 1; 3

Ь-а-АЬи 8.01 ± 0.76* - - 4.66 ± 0.51 - -

Ь-^а 4.60 ± 0.43* - - 1.7 ± 0.32 - -

Ь-Ше 0.6 ± 0.06* 41.78* 4.74* 0.89 ± 0.09 0.46 0.12 1; 2

Примечание. ^ - константа ингибирования, KМ - константа Михаэлиса, ^ - константа ингибирования продуктом, характеризующая связывание фермента с продуктом изотопного обмена. *Данные [36]. **Данные [40].

Длина волны, нм Длина волны, нм

Рис. 1. Спектры поглощения: холофермента МГЛ Ser339Ala (А); комплексов МГЛ с ^-метионином: МГЛ дикого типа (сплошная линия) и МГЛ Ser339Ala (пунктирная линия) (Б). Спектры снимали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 1 мМ ДТТ, 1 мМ EDТА при концентрации фермента 1 мг/мл

дикого типа, мутантная форма МГЛ преимущественно обменивает рго-^)-протон.

Спектральные исследования

На рис. 1 приведены спектры поглощения холофермента Ser339Ala и его комплекса с Ь-метионином. Спектр поглощения мутантной формы фермента имеет типичный для альдиминов ПЛФ вид с основной полосой в области 420 нм и полосой в области 320 нм.

Данные логнормального разложения спектра холофермента, которое проводили, как опи-

сано для фермента дикого типа [37], приведены в табл. 4. Внутренний альдимин мутантной формы описывается четырьмя структурами: кетоенамин, его таутомер, енолимин (рис. 1А; структуры II, I) и два конформера кетоенамина - конформер, у которого альдиминная группа находится в плоскости, перпендикулярной плоскости пиридинового цикла (табл. 4, структура IIх), и конформер с альдиминной связью, выведенной из плоскости кольца кофермен-та, но с сохранением сопряжения с п-электронами кольца кофермента и водородной связи между аль-диминным атомом азота и З'-оксигруппой кофер-

Примечание. Е - энергия электронного перехода; V - волновое число; к - длина волны; е - коэффициент молярного поглощения; W — полуширина; р - асимметрия; f — сила осциллятора; п - содержание таутомеров и кон-формеров.

Надстрочные индексы (1, 2) относятся к первому и второму электронным переходам структуры II. Надстрочные индексы А) относятся к двум конформерам структуры II (конформер с альдиминной связью, находящейся в плоскости, перпендикулярной плоскости пиридинового цикла, и конформер с альдиминной связью, частично выведенной из плоскости пиридинового кольца, но сохраняющей сопряжение с п-электронами кольца кофактора и водородную связь между альдиминным азотом и З'-оксигруппой кофермента). 'Экспериментальная информация об этих полосах недостаточна.

Таблица 4. Параметры полос спектра поглощения внутреннего альдимина Ser339Ala МГЛ

Структура E, эВ v x 10-3, см-1 X, нм е x 10-3, М-1см-1 W x 10-3, см-1 Р f n, %

II1 2.92 23.58 424.1 10.46 3.58 1.55 0.18 52.9

IIa 3.24 26.10 383.1 8.27 3.87 1.37 0.03 10.4

I 3.63 29.26 341.8 9.75 3.65 1.23 0.06 20.0

II" 3.80 30.67 326.1 8.50 3.47 1.29 0.05 16.7

II2* 4.28 34.52 289.7 12.20 5.06 1.20 0.29

* 4.55 36.56 272.8 23.10 4.56 1.39 0.79

мента (табл. 4, структура П^). Параметры полос поглощения, полученные при разложении спектра, приведены в табл. 4.

Найденные структуры и параметры их полос поглощения оказались практически такими же, как у фермента дикого типа [36]. Величина константы диссоциации комплекса ПЛФ для МГЛ дикого типа составляет 6.24 х 10-4 мМ [57]. Константа диссоциации ПЛФ мутантной формы фермента составила 1.01 х 10-3 мМ. Таким образом, замена несущественно повлияла на сродство апофермента к кофермен-ту и на конформацию и таутомерию внутреннего альдимина. Она привела к некоторому изменению количественного состава таутомеров и конформе-ров внутреннего альдимина. Реакционноспособной формой внутреннего альдимина является кетоена-мин. В холоферменте дикого типа его содержание составляет 67.6% [36], в холоферменте мутантной формы - 52.9% (табл. 4).

В спектрах поглощения и кругового дихроизма комплекса МГЛ дикого типа с Ь-метионином имеются полосы с максимумами при 440 и 480 нм [36]. Эти полосы в спектрах ПЛФ-зависимых ферментов относят к интермедиатам реакций в- и у-элимини-рования - а-аминокротонату или а-аминоакрилату [54]. Наличие а-аминокротоната в спектре комплекса МГЛ дикого типа с Ь-метионином и кинетические данные взаимодействия фермента дикого типа с рядом субстратов и ингибиторов позволили предположить, что скоростьлимитирующая стадия физиологической реакции следует после стадии образования а-аминокротоната [36]. В спектре поглощения комплекса мутантной формы фермента

с L-метионином отсутствует поглощение в области 440-480 нм. Следовательно, замена Ser339 на Ala привела к торможению реакции у-элиминирования на стадии/ях, следующих за стадией внешнего аль-димина.

Пространственная структура холофермента мутантной формы

Пространственная структура Ser339Ala МГЛ определена с разрешением 1.7 А. Замена серина 339 на аланин не повлияла на пространственную структуру фермента. Общий ход полипептидной цепи Ser339Ala МГЛ остается практически таким же, как у холофермента МГЛ дикого типа (рис. 2А). Среднеквадратическое отклонение положений Са-атомов Ser339Ala МГЛ по сравнению с их положениями в структуре фермента дикого типа (код PDB 2RFV) составляет 0.29 А2. Как и в определенных нами ранее структурах C. freundii МГЛ [29-31], а также в структурах МГЛ из других микроорганизмов, для структуры Ser339Ala МГЛ характерна подвижность фрагментов N- и С-концевых участков полипептидной цепи (рис. 2А) [28]. Из-за высокой подвижности N-концевого фрагмента в структуре Ser339Ala МГЛ не локализован длинный участок, состоящий из 16 аминокислот (46-61), включающий остатки тирозина 58 и аргинина 60, боковые группы которых образуют водородные связи с 02Р-атомом фосфатной «ручки» кофермента (рис. 2Б).

Средний температурный В-фактор аминокислотных остатков, принадлежащих подвижному С-концевому фрагменту (54.02 А2, остатки 353-368), в 2 раза выше среднего температурного фактора

А

А5р240* 1_уз239*

Не241*

Р1че37*

Рис. 2. Наложение структур C. freundii МГЛ дикого типа (код PDB 2RFV; зеленый) и Ser339Ala МГЛ (код PDB 5D5S; темно-синий): А - общий ход полипептидной цепи с окраской по В-фактору от темно-синего до красного при увеличении значения; Б - фрагменты активных центров; звездочками отмечены остатки, принадлежащие соседней субъединице каталитического диме-ра. PLP - кофермент

ТИгЗб*

Рис. 3. Стереоизображение наложения фрагментов активного центра МГЛ C. freundii\ холофермент дикого типа (код PDB 2RFV, темно-синий) и комплекс с ^-циклосерином (код PDB 40МА, голубой). Звездочками отмечены остатки, принадлежащие соседней субъединице каталитического диме-ра. Альтернативные положения аминокислотных остатков показаны штриховыми линиями

стабильных участков фермента. Такая мобильность может быть связана с обеспечением вывода из активного центра фермента продуктов реакций у-и Р-элиминирования [30]. Замена серина 339 на ала-нин привела к потере водородной связи между ним и остатком треонина 36 соседней субъединицы каталитического димера (рис. 2Б), однако это не вызвало изменений в тетрамерной организации молекулы Ser339A1a МГЛ.

Пространственные структуры ковалентных и нековалентных комплексов МГЛ с ингибиторами, роль Ser339 в катализе реакций у- и в-элиминирования

В пространственной структуре холофермента C. freundii МГЛ дикого типа (код PDB 2RFV) боковая

цепь Ser339 находится в двух равновероятных положениях (рис. 3). В одном из них она располагается в области активного центра фермента рядом с Lys210, во втором - в области межсубъединичного взаимодействия с ^концевым доменом соседней субъединицы каталитического димера. Оба положения боковой цепи Ser339 стабилизированы водородными связями и хорошо различимы на карте электронной плотности.

В пространственных структурах комплексов МГЛ с ингибиторами, моделирующими комплекс Михаэлиса, внешний альдимин и кетиминный ин-термедиат, боковая цепь Ser339 занимает единственное положение, при котором его Оу-атом направлен в сторону Lys210 [29-32]. При связывании МГЛ с ингибиторами их карбоксильные группы

«выталкивают» карбонильную группу пептидной связи между Ser339 и Val338 из полости активного центра в область межсубъединичных контактов и С=О-группа поворачивается на 180° [29, 32]. При таком повороте расстояние между Oy-атомом Ser339 и атомом кислорода главной цепи Val338 сокращается до 2.12 А, это приводит к выталкиванию Oy-атома Ser339 в область активного центра фермента (рис. 3). Так обеспечивается единственное положение боковой группы Ser339, при котором его Oy-атом образует с NZ-атомом Lys210 водородную связь. Ее расстояние составляет 2.85 А в комплексе Cys115His МГЛ с L-норлейцином, моделирующим внешний альдимин [31], и 2.79 А в комплексе C. freundii МГЛ с L-циклосерином, моделирующим кетиминный интермедиат [30] (рис. 3).

Выше отмечалось, что N-концевой фрагмент МГЛ подвижен как в структурах холофермента дикого типа, так и в холоферменте Ser339Ala МГЛ. Связывание ингибиторов МГЛ дикого типа приводит к стабилизации этого фрагмента [30, 32]. Вероятно, такая стабилизация имеет место и при связывании субстратов и ингибиторов Ser339Ala МГЛ.

На рис. 4 представлены фрагменты активного центра комплекса C. freundii МГЛ с L-цикло-серином, в которых наблюдаются два положения боковой цепи Lys210.

В одном положении, аналогичном положению боковой цепи Lys210 в структуре комплекса мутантной формы с норлейцином [31], моделирующего внешний альдимин, N^-атом Lys210 стабилизирован водородными связями с гидроксильными группами боковых цепей Ser339 и Tyr58* (2.79 А и 2.82 А; рис. 4А). Боковая группа Lys210 практически перпендикулярна плоскости кольца кофермента и находится на расстоянии 3.28 А от С-а-рго-^)-протона и 3.15 А от Cß-атома L-циклосерина (рис. 4Б). Такое положение благоприятно для обеспечения отрыва С-а-рго-^)-протона или C-ß-протона боковой аминогруппой Lys210.

В другом положении N^-атом Lys210 находится на расстоянии водородной связи от гидроксильных групп боковых цепей Ser207 и Tyr58* (3.30 А и 2.96 А; рис. 4А). В этом положении N^-атом Lys210 находится наиболее близко (3.23 А) к С4'-атому ПЛФ, в то время как расстояние до Са-атома субстрата увеличивается на 0.43 А (рис. 4Б). Это положение боковой группы Lys210 благоприятно для переноса С-а-протона к С4'-атому кофермента.

Таким образом, если Tyr58* участвует в стабилизации обоих положений N^-атома Lys210, то боковые группы Ser339 и Ser207, располагающиеся с противоположных сторон от Lys210, обеспечивают оптимальное положение его е-аминогруппы на ста-

Рис. 4. А - окружение Lys210 в активном центре комплекса С. freundii МГЛ с ^-циклосерином (код PDB 40МА). Звездочками обозначены аминокислотные остатки, принадлежащие второй субъединице каталитического димера. Б - положение ^-атома азота боковой цепи Lys210 относительно С4'-атома ПЛФ, С-а- и С-Р-атомов ингибитора

диях отрыва С-а-протона во внешнем альдимине, протонировании С4'-атома ПЛФ и отрыва С-Р-протона в кетиминном интермедиате.

В комплексах мутантной формы с субстратами и ингибиторами группа Lys210 может образовывать только одну водородную связь с гидроксильной группой туг58*. Это будет приводить к нарушению оптимальной для отрыва С-а-протона конформа-ции боковой группы Lys210 и понижению ее рКа. Очевидно, этим объясняется уменьшение наблюдаемой скорости обмена С-а-протона ингибиторов. Ранее предположили, что обмен С-Р-протонов осуществляется по механизму с обращением конфигурации, когда первый протон отрывается боковой группой Lys210, а второй протон приходит с противоположной стороны от боковой группы туг113. В результате оба С-Р-протона обмениваются с одинаковой скоростью [29]. В случае мутантной формы Ser339A1a реакция изотопного обмена С-Р-протонов замедляется и оба Р-протона обмениваются с одинаковой скоростью.

Вероятно, водородная связь между ^-атомом Lys210 и Оу-атомом Ser339 обеспечивает как оптимальное для отрыва С-а- и С-Р-протонов положение аминогруппы Lys210, так и стабилизацию ее аммонийной формы для 1,3-прототропного сдвига С-а-протона к С4'-атому кофермента и эффективный обмен С-а- и С-Р-протонов в комплексах с субстратами и ингибиторами. Присутствие в спектре поглощения комплекса Ser339A1a с Ь-метионином полосы

Б

поглощения внешнего альдимина также позволяет считать, что замена серина 339 на аланин приводит к торможению физиологической реакции на стадии отрыва С-а-протона во внешнем альдимине.

Если образование а-аминокротоната происходит по механизму, предложенному в работе [50], е-аминогруппа Lys210 может принимать участие как основание или кислота на стадиях физиологической реакции, следующих за элиминированием метилмеркаптана, и замена Ser339 может приводить к замедлению этих стадий физиологической реакции.

Замена серина 339 на аланин приводит к торможению реакции в-элиминирования на стадии отрыва С-а-протона внешнего альдимина. Поскольку в ПЛФ-зависимых реакциях в-элиминирования серосодержащих аминокислот Lys210 постулируется как общий кислотный катализатор [54], возможно, гидроксильная группа Ser339 обеспечивает оптимальные для катализа положение и основность Lys210.

Ранее подобную роль остатка серина, соответствующего Ser339 МГЛ, предложили для двух ферментов структурного подкласса, к которому принадлежит МГЛ, цистатионин-у-синтазы [58] и цистатионин-в-лиазы [59].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами показано участие остатка Ser339 в механизме реакций у- и ß-элиминирования, катализируемых МГЛ из C. freundii. Используя рентгеноструктур-ные, кинетические и спектральные данные, установлено, что Ser339 необходим для обеспечения оптимального положения боковой группы Lys210 на стадии отрыва С-а-протона субстрата в реакции ß-элиминирования и стадиях отрыва С-а- и C-ß-протонов субстрата в реакции у-элиминирования. Предположено, что в реакции у-элиминирования остаток Ser339 обеспечивает необходимую основность боковой аминогруппы Lys210 на стадии 1,3-прототропного сдвига С-а-протона субстрата к С4'-атому кофермента. Понимание механизмов реакций у- и ß-элиминирования, катализируемых МГЛ, не только вносит вклад в фундаментальную энзимологию, оно необходимо для создания новых антибактериальных и противоопухолевых препаратов, основанных на изменении/улучшении субстратной и реакционной специфичности фермента.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных исследований государственных академий наук (№ 01201363820) и при поддержке РФФИ (проекты № 14-04-00349 и 14-04-31398).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Onuffer J.J., Kirsch J.F. // Protein Sci. 1995. V. 4. № 9. P. 1750-1757.

2. Vacca R.A., Giannattasio S., Capitani G., Marra E., Christen P. // BMC Biochem. 2008. V. 9. Р. 17.

3. Golinelli-Pimpaneau B., Lüthi C., Christen P. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 33. P. 23969-23977.

4. Belogurov A. Jr., Kozyr A., Ponomarenko N., Gabibov A. // Bioessays. 2009. V. 31. № 11. P. 1161-1171.

5. Durova O.M., Vorobiev I.I., Smirnov I.V., Reshetnyak A.V., Telegin G.B., Shamborant O.G., Orlova N.A., Genkin D.D., Bacon A., Ponomarenko N.A., et al. // Mol. Immunol. 2009. V. 47. № 1. P. 87-95.

6. Tanaka H., Esaki N., Soda K. // Enzyme Microb. Technol. 1985. V. 7. P. 530-537.

7. Фалеев Н.Г., Троицкая М.В., Ивойлов В.С., Карпова В.В., Беликов В.М. // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. № 3. С. 458-463.

8. Tokoro M., Asai T., Kobayashi S., Takeuchi T., Nozaki T. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 43. P. 42717-42727.

9. Lockwood B., Coombs G. // Biochem. J. 1991. V. 279. № 3. P. 675-682.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

10. Kreis W., Hession C. // Cancer Res. 1973. V. 33. № 8. P. 1862-1865.

11. Yoshimura M., Nakano Y., Yamashita Y., Oho T., Saito T., Koga T. // Infection Immunity. 2000. V. 68. № 12. P. 69126916.

12. Nakayama T., Esaki N., Lee W.-J., Tanaka I., Tanaka H., Soda K. // Agric. Biol. Chem. 1984. V. 48. P. 2367-2369.

13. Ревтович С.В., Морозова Е.А., Ануфриева Н.В., Котлов

М.И., Белый Ю.Ф., Демидкина Т.В. // ДАН. 2012. Т. 445. № 2. С. 214-220.

14. Kulikova V.V., Morozova E.A., Revtovich S.V., Kotlov M.I., Anufrieva N.V., Bazhulina N.P., Raboni S., Faggiano S., Gabellieri E., Cion P., et al. // IUBMB Life. 2017. V. 69. № 9. P. 668-676.

15. El-Sayed A.S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 86. № 2. P. 445-467.

16. Goyer A., Collakova E., Shachar-Hill Y., Hanson A.D. // Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. № 2. P. 232-242.

17. Morozova E.A., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Kulikova V.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2014. V. 70. № 11. P. 3034-3042.

18. Ануфриева Н.В., Морозова Е.А., Куликова В.В., Бажули-на Н.П., Манухов И.В., Дёгтев Д.И., Гнучих Е.Ю., Родионов А.Н., Завильгельский Г.Б., Демидкина Т.В. // Acta Naturae. 2015. Т. 7. № 4 (27). С. 141-148.

19. Kulikova V.V., Anufrieva N.V., Revtovich S.V., Chernov A.S., Telegin G.B., Morozova E.A., Demidkina T.V. // IUBMB Life. 2016. V. 68. № 10. P. 830-835.

20. Morozova E.A., Kulikova V.V., Rodionov A.N., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Demidkina T.V. // Biochimie. 2016.

V. 128-129. P. 92-98.

21. Куликова В.В., Чернуха М.Ю., Морозова Е.А., Ревтович С.В., Родионов А.Н., Коваль В.С., Аветисян Л.Р., Кулястова Д.Г., Шагинян И.А., Демидкина Т.В. // Acta Naturae. 2018. T. 10. № 3 (38). C. 83-87.

22. Yoshioka T., Wada T., Uchida N., Maki H., Yoshida H., Ide N., Kasai H., Hojo K., Shono K., Maekawa R., et al. // Cancer Res. 1998. V. 58. № 12. P. 2583-2587.

23. Miki K., Al-Refaie W., Xu M., Jiang P., Tan Y., Bouvet M., Zhao M., Gupta A., Chishima T., Shimada H., et al. // Cancer Res. 2000. V. 60. № 10. P. 2696-2702.

24. Tan Y., Xu M., Hoffman R.M. // Anticancer Res. 2010. V. 30. № 4. P. 1041-1046.

25. Hoffman R.M. // Expert Opin. Biol. Ther. 2015. V. 15. № 1. P. 21-31.

26. Kack H., Sandmark J., Gibson K., Schneider G., Lindqvist Y. // J. Mol. Biol. 1999. V. 291. № 4. P. 857-876.

27. Mamaeva D.V., Morozova E.A., Nikulin A.D., Revtovich S.V., Nikonov S.V., Garber M.B., Demidkina T.V. // Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 2005. V. 61. № 6. P. 546-549.

28. Nikulin A., Revtovich S., Morozova E., Nevskaya N., Nikonov S., Garber M., Demidkina T. // Acta Crystallogr. Sect. D. 2008. V. D64. № 2. P. 211-218.

29. Revtovich S.V., Faleev N.G., Morozova E.A., Anufrieva N.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Biochimie. 2014. V. 101. P. 161-167.

30. Kuznetsov N.A., Faleev N.G., Kuznetsova A.A., Morozova E.A., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Nikulin A.D., Fedorova O.S., Demidkina T.V. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. № 1.

P. 671-681.

31. Revtovich S.V., Morozova E.A., Kulikova V.V., Anufrieva N.V., Osipova T.I., Koval V.S., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // BBA-Proteins Proteom. 2017. V. 1865. № 9. P. 1123-1128.

32. Ревтович С.В., Морозова Е.А., Хурс Е.Н., Закомырдина Л.Н., Никулин А.Д., Демидкина Т.В., Хомутов Р.М. // Биохимия. 2011. Т. 76. № 5. С. 690-698.

33. Nagai S., Flavin M. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. № 17. P. 3884-3895.

34. Morneau D.J.K., Abouassaf E., Skanes J.E., Aitken S.M. // Anal. Biochem. 2012. V. 423. № 1. P. 78-85.

35. Манухов И.В., Мамаева Д.В., Морозова Е.А., Расторгуев С.М., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В., Завильгельский Г.Б. // Биохимия. 2006. Т. 71. № 4. С. 454-463.

36. Морозова Е.А., Бажулина Н.П., Ануфриева Н.В., Ткачев Я.В., Стрельцов С.А., Тимофеев В.П., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 10. С. 1435-1445.

37. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.

38. Cleland W.W. // Methods Enzymol. 1979. V. 63. P. 103-138.

39. Фалеев Н.Г., Рувинов С.Б., Бахмутов В.И., Демидкина Т.В., Мягких И.В., Беликов В.М. // Молекуляр. биология. 1987. Т. 21. С. 1636-1644.

40. Koulikova V.V., Zakomirdina L.N., Gogoleva O.I., Tsvetikova M.A., Morozova E.A., Komissarov V.V., Tkachev Y.V., Timofeev V.P., Demidkina T.V., Faleev N.G. // Amino Acids. 2011. V. 41. № 5. P. 1247-1256.

41. Kainosho M., Ajisaka K., Kamisaku M., Murai A., Kyogoku

Y. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 64. № 1. P. 425-432.

42. Morino Y., Snell E.E. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. № 23. P. 5591-5601.

43. Peterson E.A., Sober H.A. // J. Am. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 169-175.

44. Osterman A.L., Brooks H.B., Rizo J., Phillips M.A. // Biochemistry. 1997. V. 36. № 15. P. 4558-4567.

45. Scatchard G. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1949. V. 51. P. 660-672.

46. Kabsch W. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr.

2010. V. 66. № 2. P. 125-132.

47. Winn M.D., Ballard C.C., Cowtan K.D., Dodson E.J., Emsley P., Evans P.R., Keegan R.M., Krissinel E.B., Leslie A.G., McCoy A., et al. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr.

2011. V. 67. № 2. P. 235-242.

48. Adams P.D., Grosse-Kunstleve R.W., Hung L.-W., Ioerger T.R., McCoy A.J., Moriarty N.W., Read R.J., Sacchettini J.C., Sauter N.K., Terwilliger T.C. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2002. V. 58. № 11. P. 1948-1954.

49. Emsley P., Lohkamp B., Scott W., Cowtan K. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010. V. 66. № 4. P. 486-501.

50. Brzovic P., Holbrook E.L., Greene R.C., Dunn M.F. // Biochemistry. 1990. V. 29. № 2. P. 442-451.

51. Clausen T., Huber R., Laber B., Pohlenz H.D., Messerschmidt A. // J. Mol. Biol. 1996. V. 262. № 2. P. 202224.

52. Davis L., Metzler D. The Enzymes. 3rd Edn. V. 7 / Ed. Boyer P.D. N.Y.: Acad. Press, 1972. P. 33-74. https://www. elsevier.com/books/the-enzymes/boyer/978-0-12-122707-4

53. Clausen T., Huber R., Prade L., Wahl M.C., Messerschmidt A. // EMBO J. 1998. V. 17. № 23. P. 6827-6838.

54. Messerschmid A., Worbs M., Steegborn C., Wahl M.C., Huber R., Laber B., Clausen T. // Biol. Chem. 2003. V. 384. № 3. P. 373-386.

55. Inou H., Inagaki K., Adachi N., Tamura T., Esaki N., Soda K., Tanaka H. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64. № 11. P. 2336-2343.

56. Sato D., Shiba T., Karaki T., Yamagat W., Nozaki T., Nakazawa T., Harada S. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. P. 4874.

57. Anufrieva N.V., Faleev N.G., Morozova E.A., Bazhulina N.P., Revtovich S.V., Timofeev V.P., Tkachev Y.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Biochim. Biophys. Acta. 2015. V. 1854. № 9. P. 1220-1228.

58. Jaworski A.F., Lodha P.H., Manders A.L., Aitken S.M. // Protein Sci. 2012. V. 21. № 11. P. 1662-1671.

59. Lodha P.H., Aitken S.M. // Biochemistry. 2011. V. 50. № 45. P. 9876-9885.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.