CC BY
10
Установлено, что мета- и пара-дизопропилбензолы, монокарбинолы и дикарбинолы мета- и пара-диизопропилбензолов, гидрохинон и ацетон (до 1,5 мг) не реагируют с ванилином в соляной кислоте; резорцин реагирует аналогично дигидроперекиси мета-диизопропилбензола. Количественное содержание дигидроперекисей в смеси гидроперекисей мы определяли по калибровочным графикам (рис. 2 и 3). В пределах концентраций от 1 до 100 мкг зависимость оптической плотности от концентрации дигидроперекиси мета-диизопропилбензола прямолинейная, а дигидроперекиси пара-диизопропилобензола близка к прямой.
Разработанные нами методы проверены на искусственных смесях. Растворы, содержащие сумму гидроперекисей, делили на 2 части, объем каждой части доводили до 3 мл спирто-водной смесью в соотношении 1:1; в одной части определяли сумму гидроперекисей реакцией с орто-толидином, а в другой части — содержание дигидроперекиси. Относительная ошибка определений не превышала 10%.
Заключительным этапом исследования явилась разработка условий поглощения гидроперекисей из воздуха. Оптимальные условия поглощения аэрозолей гидроперекисей из воздуха следующие. Воздух пропускают через последовательно соединенные воронку с пористой пластинкой № 2 и поглотительный прибор с пористой пластинкой с 3 мл спирто-водной смеси в соотношении 1:1 со скоростью 0,8—1 л/мин. Достаточо отобрать 10— 15 л воздуха.
После отбора воздуха воронку промывают 5 мл спирто-водной смеси в соотношении 1:1 (2+2+1 мл). Полученные извлечения и содержимое поглотительного прибора сливают вместе и доводят объем раствора спирто-водной смесью до 8 мл.
Для анализа отбирают 2 порции по 3 мл\ в одной из них определяют суммарное содержание гидроперекисей, а в другой — содержание дигидроперекиси.
Установлено также, что моногидроперекись мета-диизопропилбензола малолетуча, а моногидроперекись пара-диизопропилбензола при температуре от 8 до 45° нелетуча; при температуре же выше 45° обнаруживаются незначительные количества вещества в паровой фазе.
ЛИТЕРАТУРА
Т и у н о в Л. А. Гиг и сан., 1964, N° 1, с. 82.— П е р е г у д Е. А., ГернетЕ. В. Химический анализ воздуха промышленных предприятий. М.— Л., 1965, с. 216,— Соловьева Т. В. Тезисы докл. 4-й Всесоюзн. научно-практической конференции по про-мышленно-санитарной химии. М., 1965, с. 55.— Arrhenius S., Acta ehem. scand., 1955, v. 9, p. 71S
Поступила 10/XI 1966 г.
УДК 614.3:576.8.077
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЭКСПРЕССНЫХ И УСКОРЕННЫХ МЕТОДОВ ИНДИКАЦИИ ; ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
И. В. Шантаренко, В. Д. Загорная (Киев)
Под контролем классического метода выделения чистых культур патогенных микроорганизмов изучали чувствительность и специфичность следующих экспрессных методов—метода флюоресцирующих антител (МФА),
реакции гаптоцеллюлозной агглютинации (РГЦА), реакции гаптохолевой флоккуляции (РГХФ), реакции угольной агломерации (РУА)— и ускоренных — метода флюоресцирующих антител при подращивании исследуемых проб и реакции нарастания титра фага (РНФ). Для этой цели пользовались бактериями брюшного тифа и паратифа В, дизентерийными бактериями Флекснера (штаммы № 170, 1504), Зонне (штаммы № 2464 и 14), Шмитца — Штуцера (штамм № 47), вибрионом Мечникова, вакцинными штаммами чумы (ЕУ) и туляремии; в части опытов применяли также сибиреязвенный вакцинный штамм СТИ. В качестве диагностических бактериальных препаратов использованы индикаторные фаги тифов и дизентерии производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи и Тбилисского научно-исследовательского института, сухие специфические конъюгаты для прямого и непрямого «МФА производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи и жидкие специфические конъюгаты производства Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова. Специфические угольные сыворотки готовили по методике Яфаева, в последующем заменив в ней центрифугирование отмывкой угля на фильтровальной бумаге.
В I серии опытов культуры бактерий суточного роста на скошенном агаре эмульгировали в физиологическом растворе, по оптическому стандарту устанавливали концентрацию в 1 млрд. микробных тел в 1 мл и последовательно двукратно разводили до 30-й пробирки. Известные концентрации бактерий наполовину разводили материалом из внешней среды: вода разной степени загрязненности (речная, колодезная, из луж), смывы с сена, предметов оборудования кухни-столовой и др. В дальнейшем как чистые, так и загрязненные пробы подвергали исследованию одновременно всеми упомянутыми выше методами.
Для выделения культур пользовались дифференциальными элективными средами и средами обогащения (Эндо, Левина, Плоскирева, висмут сульфит-агар, генцианвиолет-агар, Мюллера, среда О и желточная для туляремии, щелочной агар и пептонная вода для холеры), на которые засевали по 0,5 мл разной концентрации взвеси бактерий. В методе подращивания через каждые 2, 4, 6 и 18 часов из жидких и твердых питательных сред проводили исследования всеми экспрессными методами. РНФ ставили только с исходным материалом по методике Тимакова — Гольдфарб для тифозной и дизентерийной группы и на чуму по методике Доморадского с соавторами.
Для МФА препараты на стекле фиксировали на пламени горелки, сыворотками обрабатывали до 5 мин. и 30 сек. промывали под краном. Пользовались люминесцентным микроскопом МЛ-1 с иммерсионным объективом 95x1,25 и светофильтром ЖС-3.
II серия опытов включала индикацию патогенных микроорганизмов, поступающих в лабораторию в пробах внешней среды (вода, смывы, пищевые продукты, трупы грызунов и пр.). При этом нам не было известно, чем заражены поступившие пробы; мы лишь знали, что диапазон бактериальных агентов соответствует перечисленному выше.
\ !
I 1 I
1
/О
/оо гоо soo /о /оо zoo soo /о /оо гоо soo
6 4 4 в
I i
: 1
: /
li
/
П
г
II
ш
Предел чувствительности методов выявления бактериальных культур в материале из внешней среды.
/ — брюшной тиф. паратифы и дизентерия; // — вакцинные штаммы чумы и туляремии; /// — вибрион Мечникова; I — МФА экспресс; 2 — РГЦА. РГХФ; 3 — РУА; 4 — выделение чистой культуры; 6 —РНФ; 6 — МФА при подращивании.
В I серии с каждой из используемых культур бактерий проведено от 5 до 10 опытов с одновременным использованием всех изучаемых методов индикации. Предел чувствительности отдельных методов иллюстрируется приводимым графиком (см. рисунок).
Предел чувствительности наиболее достоверного метода индикации, выделение и идентификация чистой культуры для кишечной группы бактерий и вибриона Мечникова достигал одного или несколько десятков их в 1 мл. Для чумы и туляремии он был несколько ниже — около сотни особей в 1 мл. Вакцинный штамм туляремии значительно лучше выделяется на среде Э, чем на желточной. Следует отметить, что вакцинный штамм чумы также быстрее и из более высоких разведений выделяется со среды Э туляремийного варианта, однако на этой среде происходит диссоциация колоний с И- в Б-форму. Время для выделения чистой культуры из предельных разведений вибриона Мечникова составляет 24—30 часов, бактерий кишечной группы — 2—4 суток, вакцинных штаммов чумы и туляремии — 5—6 суток.
РНФ с кишечной группой бактерий не только достигает предела чувствительности метода выделения чистой культуры, но и превосходит его. К вакцинному штамму чумы, наоборот, РНФ значительно уступает бактериологическому методу — 100 млн. и больше в 1 мл.
МФА, примененный после подращивания исследуемых проб, исходную концентрацию 1000—5000 микробных тел в 1 мл вибриона Мечникова и бактерий кишечной группы выявляет через 2 часа инкубации, а предела бактериологического метода достигает через 4 часа инкубации. Для чумы и туляремии МФА достигает бактериологического предела лишь к 18 часам, да и то не с постоянством.
РГЦА после подращивания открывает вибрионы Мечникова и бактерии кишечной группы через 4—6 часов лишь из исходных концентраций 1—10 млн. микробных тел в 1 мл, не достигая предела бактериологического метода даже через 18 часов инкубации. Для вакцинных штаммов чумы и туляремии эта реакция неспецифична. Еще ниже по чувствительности в методе подращивания РУА.
Предел чувствительности методов в условиях нахождения бактерий в объектах внешней среды почти приближается к чувствительности их при выделении возбудителей из чистой культуры. Однако если в чистых культурах в указанных концентрациях эти агенты выявляются с постоянством, то в объектах внешней среды это достигается далеко не всегда. Результаты II серии опытов приведены в таблице.
Как видно, методом выделения чистой культуры получено около 89% правильных результатов. При этом обсеменение проб во II серии опытов исчислялось в концентрациях 10 млн.—500 тыс. микробных тел в 1 мл; кроме того, экспрессный МФА подсказывал нам, какие агенты находятся в данной пробе; поэтому весьма тщательно велись исследования с целью выделения заподозренного агента. Для этого прибегали к рассевке выросшей в пробе посторонней микрофлоры, а иногда и к повторным высевам исследуемого материала. Без этого, разумеется, процент правильных результатов был бы ниже полученного нами. Чаще всего не удавалось выделить бактерии чумы и туляремии.
Иммуносуспензионными методами (РГЦА, РГХФ, РУА) в экспрессном порядке не выявлено ни одного из присутствующих бактериальных агентов, а после подращивания дано лишь около 36% правильных результатов и около 10% гипердиагностических показателей.
В препаратах из проб с ложноположительными результатами, полученными иммуносуспензионными методами, МФА показано наличне большого количества кокковой микрофлоры и больших размеров палочковидных форм (типа сенной палочки), сорбирующих на себе сыворотки разной специфичности. Вероятно, это и служило причиной ложноположительных результатов, полученных иммуносуспензионными методами.
В этой серии опытов, приближенных к естественным условиям индикации, наилучшие результаты достигнуты с помощью МФА. В экспрессном варианте получено 100% правильных результатов. МФА, примененный при подращивании проб, показал в 97%правильные результаты, примерно в 1 % случаев находившийся в пробе агент не был выявлен, в 1 % получен гипердиагностический результат. Последнее имело место при исследовании подросшей пробы из мышцы трупа мыши непрямым МФА, когда были обнаружены единичные, на 2 плюса ореольно светящиеся палочковидные формы бактерий. В данном случае, несмотря на сомнения, возникшие при сравнении форм бактерий с контрольным препаратом чумы, был дан положительный ответ.
Иммуносуспензионные методы экспрессной индикации значительно уступают МФА. Во-первых, они все малочувствительные; 200— 100 млн. микробных тел в 1 мл — маловероятная концентрация в естественных (а подчас и искусственных) условиях внешней среды. Во-вторых, отдельные методы предназначаются только для выявления определенной группы микроорганизмов и даже отдельных фракций микробного тела (антиген, гаптен). В-третьих, все эти методы позволяют лишь косвенно судить о специфическом процессе антиген (гаптен) — антитело на основании неспецифических явлений (агглютинация, агломерация, флоккуляция и др.). Известно, что эти явления могут быть вызваны другими физико-коллоидными причинами, независимыми от специфического процесса антиген—антитело, а наличие антигенных двойников патогенных микроорганизмов может обусловливать истинно специфический процесс, который, однако, не указывает на наличие патогенного агента в исследуемом материале. Больше того, сорбция антитела на антигене, являющаяся необходимым условием специфического процесса, возможна и по неспецифическим причинам, а путей
4 Гигиена и санитария, № 12
доказательства природы этого рассматриваемые методы не имеют. Контрольная нормальная сыворотка, применяемая с этой целью, также дает косвенные показания, а по специфической природе (здесь не учитывается специфический компонент) она не всегда соответствует опытной сыворотке. И, наконец, до сих пор в практику, являющуяся надежнейшим критерием оценки методов, не внедрен ни один из них, хотя уже несколько десятков лет они предлагаются как способы экспрессной индикации бактерий.
Во всех этих отношениях выгодно отличается МФА. Чувствительность метода в экспрессном варианте сравнительно выше — 100 ООО — 50 ООО микробных тел в 1 мл, а при 4-часовом подращивании для большинства бактерий достигает чувствительности бактериологического метода. Этому методу присуще непосредственное наблюдение за состоянием комплекса антиген — антитело, что дает много отправных данных для доказательства специфичности процесса. Во-первых, форма микроорганизма, адсорбировавшего на себе сыворотку данной специфичности, дает основание подтвердить или отбросить этиологическую специфичность антиген — антитело. Во-вторых, характер свечения также говорит о специфичности процесса. Специфический процесс антиген—антитело разыгрывается на поверхности бактериальной клетки, на ее оболочке, и определяется адсорбцией антител, что обусловливает ореольное свечение бактериальных тел и увеличение их размеров по сравнению с размерами в световом микроскопе.
Диффузное, крапчатое, биполярное свечение без увеличения размеров есть результат неспецифической абсорбции. Это подтверждается тем, что стареющие культуры бактерий, подвергнутые кипячению, воздействию антибиотиков, фагов, приобретают свойство подобного вида свечения под влиянием сыворотки любой специфичности. Вероятно, это объясняется нарушением оболочки бактерий, что позволяет молекулам у-глобулинов проникать внутрь клеток. В отношении ореольного свечения исключением служат бактерии туляремии. В прямой постановке опыта они светятся диффузно, а при непрямой обработке препарата светятся ореольно. На наш взгляд, это зависит от природы расположения специфических рецепторов на поверхности тела бактерии. Очевидно, на небольших участках бактериальных тел возбудителя туляремии имеются условия для присоединения больших количеств молекул специфического конъюгата, что и обусловливает одинаковую интенсивность свечения всего тела бактерий. В непрямом методе, когда специфическая мозаика рецепторов туляремии прикрыта антителами, при II этапе обработки специфический конъюгат присоединяется уже к другой антигенной структуре. В этом случае свечение тел бактерий выглядит ореольным.
В-третьих, МФА делает возможным доказательство специфичности свечения даже в тех случаях, когда бактерии светятся по типу специфического свечения, хотя суть сорбции не носит специфического характера. Иногда это наблюдается при электростатической адсорбции кислых 7-глобулинов на щелочных телах клеток. В основе такого доказательства лежит понятие об обратимости специфического процесса антиген — антитело, выражающегося в том, что специфически присоединившаяся к антигену сыворотка может быть вытеснена и заменена сывороткой другого происхождения, но той же специфичности. На этом основании одним из авторов настоящей статьи (И. В. Шантаренко) был предложен способ трехэтапной обработки препаратов по гашению специфического свечения. Механизм этого явления не может считаться окончательно выясненным. Учитывая, что специфически гасящий свечение титр у разных сывороток бывает разным, необходимо иметь 2 одинаковой специфичности сыворотки разного происхождения с установленным гасящим титром. Для доказательства специфичности из нативного материала пробы делают 2 препарата на одном стекле; затем на I этапе оба препарата обрабатывают вытесняемой сывороткой, а на II этапе только первый препарат обрабатывают вытесняющей сывороткой. На III этапе для выявления феномена гашения применяют
конъюгат, специфический к вытесняемой сыворотке. Фактом, доказывающим специфичность реакции, служит специфическое свечение второго препарата и отсутствие его в первом.
И, наконец, не менее важным преимуществом МФА перед другими является то, что этот метод приемлем не только для обнаружения всех бактериальных форм микроорганизмов, но и для определения риккетсий и некоторых вирусов. Нам представляется, что еще не исчерпаны все возможности экспрессного МФА, в частности повышения его чувствительности. Только путем 100% фиксации внесенных в препарат микроорганизмов последняя обещает возрасти в 100 раз. Неменьшие результаты принесут методы концентрации бактерий с нативного материала. Мы считаем полезными дальнейшие поиски совершенствования метода флюоресцирующих антител как экспрессного. Для улучшения его в качестве ускоренного перспективны поиски элективно-обогатительных сред.
Выводы
1. Из экспрессных методов индикации бактерий в объектах внешней среды наиболее чувствительным и специфичным является метод флюоресцирующих антител, которых претендует на положение эталонного экспресс-метода.
2. Иммуносуспензионные экспресс-методы индикации малочувствительны, проявляют большую возможность неспецифических показаний, ограничиваются индикацией только отдельных видов бактерий, в связи с чем практически малопригодны.
3. Из ускоренных методов индикации РНФ к кишечной группе бактерий достигает и превосходит чувствительность бактериологического метода. Для чумы чувствительность реакции весьма низкая.
Чувствительность МФА при подращивании проб достигает чувствительности бактериологического метода для кишечной группы и вибриона Мечникова через 4 часа, для чумы и туляремии через 18 часов.
ЛИТЕРАТУРА
Михайлов И. Ф. Ж. микробиол., 1965, № 4, с. 84,— Никитин В. М. Воен.-мед. ж., 1963, № 8, с. 42. — О р л о в А. В. Там же, 1958, № 9, с. 44. — Ш а н-таренкоИ. В. В кн.: Материалы 6-й Всесоюзн. конференции по вопросам санитарной микробиологии. М., 1966, с. 85. — Я ф а е в Р. X. Ж. микробиол., 1963, № 10, с. 83.
Поступила 5/VII 1966 г.
УДК 613.83-07 : 616.153.963.1-074
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СИАЛОВЫХ КИСЛОТ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ В САНИТАРНО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
H.H. Пушкина, Г. Н. Клевцова
Биохимическая лаборатория Института общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина
АМН СССР, Москва
При изучении воздействия малых концентраций химических веществ особенную актуальность приобретает изыскание чувствительных методов выявления функциональных и органических изменений внутренней среды организма. Нередко приходится решать вопрос о функциональном состоянии печени и почек.
4*
51
