CC BY
10
| ГЕМАТОЛОГИЯ И ТРАНСФУЗИОЛОГИЯ | RUSSIAN JOURNAL OF HEMATOLOGY AND TRANSFUSIOLOGY (GEMATOLOGIYA I TRANSFUSIOLOGIYA) | 2020; ТОМ 65; №1 |
частых аллелях HLA-A*02:01 (А*02) и HLA-B*07:02 (В*07). HLA-ге-нотип донора влияет на антигенную направленность и разнообразие Т-лимфоцитов, что может определять эффективность клеточного препарата. Для выбора оптимального донора и метода получения терапевтических лимфоцитов (активация полным рр65 или изоляция эпитоп-специфичных лимфоцитов МНС-тетрамерами) нужен анализ лимфоцитов, полученных различными методами
Цель работы. Изучить антигенную направленность, разнообразие и репертуар Т-клеточных рецепторов (ТКР) CD8+ Т-клеток, отвечающих на белок рр65 ЦМВ и его иммунодоминантные эпитопы (NLV, TPR, RPH) у здоровых доноров, в зависимости от наличия аллелей A*02 и B*07.
Материалы и методы. В исследовании участвовали 87 здоровых доноров. рр65-специфичные Т-клетки (IFNy-продуценты) получали после стимуляции пулом пептидов pp65 ЦМВ. Эпитоп-специфичные Т-клетки получали с помощью МНС-тетрамеров, нагруженных соответствующим пептидом. Из полученных после сортировки клеток выделяли тотальную мРНК, затем получали ДНК-библиотеки ß-це-пей ТКР и секвенировали их с помощью NGS.
Результаты и обсуждение. 1. Наличие аллеля A*02 у здоровых доноров связано с увеличением рр65-специфичных лимфоцитов — в среднем 1,8% (0,2-4,2%), а у доноров без A*02 — 0,8% (0,2-1,4%). 2. Иммунный ответ у доноров с A*02 и/или B*07 фокусируется на иммунодоминантных эпитопах: в группе A'"~02+B'"07- ответ на NLV в среднем 90% (80-100%) от рр65-специфичных Т-клеток;
в группе A*02-B*07+ ответ на TPR и RPH — 70% (61-78%); в группе A*02+B*07+ ответ на NLV, TPR, RPH — 63% (49-75%). 3. Т-клеточ-ный ответ на рр65 ЦВМ характеризуется четкой иерархией эпитопов (TPR и RPH доминантнее NLV). В присутствии B*07 наблюдается значимое снижение NLV-специфичного ответа в среднем до 0,04% (0-0,2%) по сравнению с 0,62% (0-4,1%) в группе без B*07. 4. Репертуар ТКР NLV-специфичных CD8+ Т-клеток в группе A*02+B*07- ограничен несколькими крупными клонами (2-4 клона), занимающими 80-100% репертуара рр65-специфичных Т-клеток, а репертуары ТКР клеток, специфичных к TPR и RPH имеют большее разнообразие (4-7 клонов) и занимают 17-53% общего репертуара. 5. Среди рр65-специфичных клонов обнаруживаются клоны, специфичные к неизвестным эпитопам. При наличии B*07 такие клоны занимают 45% (22-51%), а при отсутствии B*07 — 10% (0-20%). 6. Продукцией IFNy отвечают на рр65 в среднем 29% NLV-специфичных клонов (17-100%); 54% TPR-специфичных клонов (29-100%), 37% RPH-спе-цифичных клонов (13-86%).
Заключение. В контексте клинического применения полученные данные означают, что лимфоциты от B*07+ донора будут неэффективны для B*07- пациента вне зависимости от совпадений по другим аллелям. Для получения ЦМВ-специф ичных Т-клеток предпочтительным является использование пула пептидов рр65 ЦМВ, т.к. клеточный препарат получается клонально более разнообразным и функционально активным. Выполнено при финансовой поддержке РФФИ (№17-04-02088А).
Мальчикова А. О., Клясова Г. А.
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ БИОПЛЕНОК CANDIDA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ГЕМОКУЛЬТУРЫ ОТ БОЛЬНЫХ ОПУХОЛЯМИ СИСТЕМЫ КРОВИ
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Введение. Негативное влияние на лечение инвазивного канди-доза может оказывать способность Candida spp. к формированию биопленок, прежде всего по причине резистентности биопленок Candida spp. к большинству противогрибковых препаратов, применяемых в клинике.
Цель работы. Изучить чувствительность к противогрибковым препаратам биопленок Candida spp., выделенных из гемокультуры от больных опухолями системы крови.
Материалы и методы. Определение чувствительности биопленок Candida spp. проводили стандартизованным методом последовательных серийных микроразведений в бульоне [Pierce C. G., 2008]. Значения минимальной подавляющей концентрации (МПК) противогрибковых препаратов против биопленок Candida spp. определяли спектрофотомет-рически при длине волны 490 нм с использованием соли тетразолия. Для интерпретации результатов чувствительности Candida spp. в планктонных формах и биопленках использовали критерии CLSI 2012 г.
Результаты и обсуждение. Чувствительность к анидулафун-гину, каспофунгину, флуконазолу и амфотерицину-В была изучена у 26 изолятов Candida spp., включая C. krusei (n=8), C. tropicalis (n=7), C. parapsilosis (n=6) и C. albicans (n=5), выращенных в состоянии планктонных форм и биопленок. На рисунке представлены результаты чувствительности к противогрибковым препаратам биопленок и планктонных форм Candida spp., в таблице — значения МПК анти-микотиков против исследуемых форм грибов. Анидулафунгин был активен in vitro в отношении биопленок и планктонных форм всех видов Candida, и значения МПК90 анидулафунгина были идентичными.
К каспофунгину были чувствительными 92,3% планктонных форм и 80,8% биопленок Candida spp. Значения МПК90 каспофунгина в отношении биопленок и планктонных форм Candida spp. были идентичными для C. parapsilosis (1 мкг/мл) и C. krusei (8 мкг/мл) и несколько выше для биопленок C. albicans (0,032 и 0,125 мкг/мл соответственно) и C. tropicalis (0,125 и 1 мкг/мл соответственно). К флуконазолу были резистентными все биопленки Candida spp. и 9 (34%) изолятов в планктонных формах. Крайне высокие значения МПК флуконазола были детектированы для всех биопленок Candida spp. и составили более 1024 мкг/мл. Резистентными к амфотерицину-В были 92,3% (n=24) биопленок Candida spp., в то время как планктонные формы были чувствительными. Значения МПК50 амфотерицина-В у биопленок Candida spp., были в 64 раза выше чем значения МПК50 планктонных форм (4 мкг/мл против 0,064 мкг/мл), МПК90 — в 16 раз выше (16 мкг/мл против 1 мкг/мл соответственно).
Таблица. МПК противогрибковых препаратов в отношении планктонных форм и биопленок разных видов Candida
Значения МПК противогрибковых препаратов для Candida spp. (мкг/мл)
Показатель планктонные формы биопленки
МПК50 МПК90 МПК50 МПК90
Candida spp. (n = 26) Амфотерицин-В Флуконазол Каспофунгин Анидулафунгин 0,064 0,5 0,032 0,016 1 0,5 0,5 0,25 4 >1024 0,125 0,125 16 >1024 1 1
C. albicans (n = 5) Амфотерицин-В Флуконазол Каспофунгин Анидулафунгин 0,032 0,125 0,016 0,008 0,125 0,25 0,032 0,125 4 >1024 0,125 0,125 4 >1024 0,125 0,125
C. parapsilosis (n = 6) Амфотерицин-В Флуконазол Каспофунгин Анидулафунгин 0,016 0,25 0,25 0,125 1 4 1 1 8 >1024 0,125 0,25 16 >1024 1 1
C. krusei (n = 8) Амфотерицин-В Флуконазол Каспофунгин Анидулафунгин 0,25 32 0,25 0,032 1 64 8 0,125 16 >1024 0,25 0,064 16 >1024 8 0,125
C. tropicalis (n = 7) Амфотерицин-В Флуконазол Каспофунгин Анидулафунгин 0,064 0,25 0,032 0,008 1 8 0,125 0,125 4 >1024 0,25 0,064 16 >1024 1 0,125
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Заключение. Доказана активность эхинокандинов in vitro в отношении биопленок Candida spp. Среди биопленок Candida spp. была определена более высокая чувствительность к анидулафунгину (100%), чем к каспофунгину (80,8%). К флуконазолу были рези-
стентными все биопленки Candida spp. и 9 (34%) изолятов в планктон -ных формах. Резистентность к амфотерицину-В определена у 92,3% биопленок Candida spp., в то время как все планктонные формы были чувствительными.
Мамаев Н. Н., Шакирова А. И.
НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПАТОГЕНЕЗА ПРЕД- И ПОСТТРАНСПЛАНТАЦИОННЫХ РЕЦИДИВОВ И ОЦЕНКИ ИХ КОРРЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ МИЕЛОИДНЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ В УСЛОВИЯХ СЕРИЙНЫХ ИЗМЕРЕНИЙ УРОВНЕЙ
ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ BAALC И WT1
НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии имени Р.М. Горбачевой
Введение. Недавно стало ясно, что массы ответственных за резистентность к терапии и рецидивы лейкозных клеток предшественниц с иммунофенотипом CD34+CD38- успешно оцениваются методом количественной ПЦР в реальном времени по уровням экспрессиру-
емого ими гена BAALC [ЛеПя^сЬ et а1., 2017а, Ь; Shakirova et а1., 2019]. В комбинации же с параллельно измеряемыми аналогичным способом массами WT1 экспрессирующих бластных элементов открывается реальная возможность не только изучать патогенез этих рецидивов, но и эффективно оценивать предлагаемые способы их коррекции.
Цель работы. Оценить вклад BAALC-экспрессирующих опухолевых предшественников в возникновении рецидивов у леченных ал-ло-ТГСК больных.
Материалы и методы. Обследовано 96 больных острым миело-идным лейкозом (ОМЛ) в возрасте от 2 до 66 лет (медиана — 25 лет). Одновременное серийное измерение уровней экспрессии генов BAALC и WT1 было осуществлено до трансплантации гемопоэтиче-ских стволовых клеток (ТГСК) и после нее методом количественной ПЦР в реальном времени. В качестве пороговых уровней экспрессии генов BAALC и WT1 были взяты разработанные нами величины в 31% и 250 копий/104 копий АВК1 соответственно.
Результаты и обсуждение. В группе из 12 больных со скрытым рецидивом на день Д0 показано, что в случае гиперэкспрессии гена BAALC (N=3) кумулятивная частота рецидивов (КЧР) по сравнению с группой сравнения была достоверно выше (р=0,002), а сроки безрецидивной выживаемости (БРВ) короче (р=0,019) [Shakirova
et а1., 2019]. Тестирование этого неблагоприятного параметра показало, что комбинированная гиперэкспрессия обоих генов на этапах посттрансплантационных рецидивов (ПТР) встречалась одинаково часто при М1 (4/7, 57%), М2 (3/5, 60%) и М4 (4/7, 57%) ФАБ- вариантах ОМЛ. Сравнение 2-летней КЧР у больных с зафиксированной после ТГСК гиперэкспрессией гена BAALC и без таковой обнаружило достоверное повышение (р = 0,026) в первой группе. Расширяя это исследование, на основании данных посттрансплантационного анализа мы выделили 4 группы больных ОМЛ с молекулярными статусами BAALC+WT1+ (п=11), BAALC+WT1- (п=6), BAALC-WT1+ (п= 22) и BAALC- WT1- (п=50). Как оказалось, наихудшие 2-летние КЧР (100%), БРВ (0%) и ОВ (18,2%) были свойственны больным первой группы (рис. 1). Они были достоверно хуже, чем те же параметры у больных контрольной группы (8, 72 и 74%, р<0,0001 для всех показателей). У больных с гиперэкспрессией одного из этих генов изученные показатели занимали промежуточное положение в отношении КЧР, достигая 50 и 31,8% для генов BAALC или WT1 соответственно. Следует отметить, что в этих группах БРВ была достоверно лучше, чем у BAALC+WT1+ больных (р<0,021).
Заключение. Полученные данные о неблагоприятной прогностической значимости повышенной экспрессии гена BAALC, особенно в комбинации с гиперэкспрессией гена WT1, у обследованных больных ОМЛ разного возраста оправдывает расширенное использование этого молекулярного подхода в клинике, в первую очередь для изучения патогенеза и лечения ПТР.
Мартынкевич И. С., Булдаков И. А., Шуваев В. А., Виноградова О. Ю., Полушкина Л. Б., Самородова А. П., Фоминых М. С.,
Шаркунов Н. Н., Кузяева А. А., Волошин С. В., Чечеткин А. В.
СЕКВЕНИРОВАНИЕ СЛЕДУЮЩЕГО ПОКОЛЕНИЯ (NGS) В ДИАГНОСТИКЕ, ОПРЕДЕЛЕНИИ ПРОГНОЗА И ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ С МИЕЛОИДНЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ
ФГБУ «Российский научно-исследовательский
Введение. Стремительное развитие технологии NGS-суще-ственно расширило рамки представлений о патогенезе миелопро-лиферативных новообразований (МПН). Обнаруженные соматические мутации у пациентов с МПН показывают диагностическую или прогностическую ценность, некоторые из них являются мишенью для таргетных препаратов.
Цель работы. Оценить возможности использования NGS-техно-логии в диагностике и определении прогноза течения заболевания у пациентов с различными вариантами миелоидных новообразований в рамках рутинной лабораторной практики.
Материалы и методы. Исследован 21 пациент (9 мужчин и 12 женщин) в возрасте от 36 до 79 лет (медиана Ме=55 лет). Диа-
институт гематологии и трансфузиологии ФМБА»
гноз МПН, не ассоциированных с филадельфийской хромосомой (Ph-МПН), был ранее установлен у 18 больных (в том числе у 5 — в фазе бластной трансформации), миелодиспластических синдромов (МДС) — у 2, первичный острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) — у 1 пациента. Исследование проводилось с целью установления клональной природы заболевания у 12 больных без драйверных мутаций в генах JAK2, CALR, MPL, у остальных — для выявления до -полнительных прогностически значимых генетических аберраций. У всех пациентов секвенирование выполнялось с использованием миелоидной панели из 55 генов со средней глубиной прочтения х200 или х1000 на приборе MiSeq (Illumina). При анализе полученных данных применялся 2% порог частоты встречаемости аллеля (VAF).
