CC BY
63
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 12 No. 1 2016, pp. 5-12 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 by Zhivetev, Dudareva, Graskova and Voinikov
ORIGINAL ARTICLE
Chromatographic Study of Phenolic Compounds in Medicinal Plants Alchemilla subcrenata Buser and Veronica chamaedrys L.
1 1 12
Zhivetev M.A. , Dudareva L.V. , Graskova I.A. ’,
Voinikov V.K.1
1 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, Irkutsk, 664033, Russia
2 The Irkutsk Scientific Center of SB RAS
*E-Mail: [email protected]
Received October 28, 2015
The objects of investigation were leaves and inflorescences of Alchemilla subcrenata and Veronica chamaedry, growing on the left bank at 700 m from the edge of Lake Baikal. Some small differences in the quantity and quality of phenolic compounds in the leaves of one species even selected at one time were found . At the same time, differences in the quantity and quality of phenolic compounds in the different times of the day were even more pronounced. In the inflorescences of Alchemilla subcrenata the dynamics of flavonoids has been characterized by more stable composition than in its leaves. For Veronicas tissues and organs more variety of seasonal cocktail of phenolic compounds than in the Alchemilla subcrenata was detected. Expect a variety of phenolic compounds in inflorescences of Veronica seasonal cocktail was higher than in the leaves.
Key words: daily adaptation, medicinal plants, Alchemilla subcrenata, Veronica chamaedrys, leaves, inflorescence, phenolic compounds
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
6
Chromatographic Study of Phenolic Compounds...
Растения подвергаются значительному MATERIALS AND METHODS
воздействию условий окружающей среды, и в Пробы отбирались в 8-900, 14-1500 и 20-2100 25
первую очередь температуры, изменяющейся не июня, 15 августа и 19 сентября 2013 г. и 16 июня
только в течение года, но и в течение суток. На 2014 г. Для уменьшения влияния разрушающего
территории Сибири такие перепады особенно солнечного света на фенольные соединения в
выражены и достигают вне зависимости от листьях растений пробы отбирались в пасмурные
времени года 15-20 °С в сутки, что не может не дни, сопровождаемые более мягкими перепадами
влиять на вторичный метаболизм растений. Из температур (табл. 1).
вторичных метаболитов растений наиболее Общее содержание фенольных соединений
значимыми являются фенольные соединения и, в после последовательной экстракции 80%
частности, флавоноиды, роль которых как метанолом, очистки объединенного экстракта
показателя устойчивости растений только хлороформом от липофильных пигментов и
возрастает (Pell, 1984). экстракции фенольного комплекса этиловым
Необходимость изучения лекарственных эфиром уксусной кислоты, определяли
растений в Прибайкалье возрастает с учетом спектроскопическим методом с помощью реактива
серьезных изменений в содержании биологически Фолина-Дениса (Zaprometov, 1971). Качественный
активных веществ в зависимости от района состав экстракта исследовали на микроколоночном
произрастания (Shaldaeva, 2009). Суточная и хроматогрофе «Милихром А-02» (Россия) с УФ-
сезонная динамика лекарственных компонентов детекором при градиентном режиме
важна для научного обоснования оптимальных хроматографирования (градиент 40 мин от 5 до
сроков и времени сбора растительного сырья 100 % ацетонитрила), колонка длиной 75 мм,
применительно к конкретному региону. диаметром 2 мм, скорость потока 100 мкл/мин,
В связи с этим, целью наших исследований сорбент ProntoSil 120-5-C 18 AQ # 2362 (обращено
было изучить изменения качественного состава фазный), объем пробы 4 мкл. Элюенты: 0,2 М
флавоноидов и других фенольных соединений в LiClO4 - 0,005 M НСЮ4 в H2O; CH3CN.
листьях и соцветиях двух видов лекарственных Идентификацию полученных хроматографических
растений: манжетки городковатой Alchemilla пиков проводили путем сравнения их УФ-спектров
subcrenata Buser и вероники дубравной Veronica на длинах волн 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280,
chamaedrys L. в условиях суточных перепадов 300 нм с базами данных в программе МультиХром-
температур атмосферного воздуха летом и ранней СПЕКТР для Windows.
осенью. RESULTS AND DISCUSSION
Динамика общего содержания фенол
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
Zhivetev et al.
7
содержащих веществ демонстрировала не только детектируется изменением количества пиков и
тканевую, но и видовую специфичность (табл. 2). появлением соединений, не регистрируемых в
Так, 25 июня у вероники дубравной содержание другое время суток. Например, кемпферол 3-6-D-
фенольных соединений в соцветиях было глюкопиранозид в листьях манжетки обнаружен
стабильно выше, чем в листьях, однако динамика только днем в августе и сентябре, и рано утром в
изменений их содержания была сходной. июне, а кверцетин - утром и вечером в июне и
Максимум приходился на 900 (4,22 и 4,10 мг/г только вечером в августе. Следует отметить, что
сырого веса для соцветий и листьев, спектр полифенолов, свойственных манжетке,
соответственно), после чего наблюдалось ограничивается 21-32 соединениями, а для
уменьшение их содержания в течение дня (2,79 и вероники характерно наличие 33-44 соединений во
2,29 мг/г в 1400 и 2,30 и 1,69 мг/г в 2100). Соцветия всех изученных частях растения. Уменьшение
манжетки городковатой продемонстрировали общего содержания фенольных соединений в
стабильно высокие содержания фенольных листьях или соцветиях исследованных растений
соединений (от 3,95 мг/г сырого веса утром до 3,12 нередко сопровождалось увеличением их
мг/г вечером), в то время как в листьях этого разнообразия. Так, вопреки ожиданиям, в июне
растения в 1500 наблюдали скачкообразное спектр полифенолов, особенно у вероники,
увеличение содержания (5,31 мг/г) с последующим оказался выше в листьях, чем в соцветиях по
минимумом в 2100 (1,25 мг/г) (при исходном данным за оба года исследований (табл. 3). В
содержании в 900 3,28 мг/г). Если в теплое время стеблях вероники в июне 2014 содержание
года для листьев манжетки городковатой фенольных соединений было средним. Не
характерен суточный максимум днем (5,31 в июле и исключено, что в середине и конце лета эта
8,13 мг/г 15 августа), то в сентябре после полудня закономерность может быть другой.
наблюдается, наоборот, суточный минимум (2,43 В июне наибольшее разнообразие фенольных
мг/г). Для листьев вероники дубравной картина веществ наблюдается вечером в листьях обоих
несколько иная: в августе максимум - в 1400 (2,03 исследованных видов лекарственных растений (но
мг/г), а в июне и сентябре высокое содержание утром и вечером - в соцветиях), что может быть
фенолов приходится на 900 (4,10 и 4,84 мг/г) и обусловлено необходимостью адаптации к ночной
постепенно снижается к вечеру в течение дня до прохладе. В августе ситуация иная: в 9 у листьев
1,69 и 2,06 мг/г, соответственно. вероники и в 9-1400 у листьев манжетки
С помощью ВЭЖХ показано, что в течение наблюдается максимум количества полифенолов
периода вегетации и даже в течение одних суток при более затянутом прогреве атмосферного
происходят изменения и в составе фенольных воздуха днем и наступлением тепла только во
соединений и флавоноидов (табл. 3). Это второй половине дня. Для сентября,
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
8
Chromatographic Study of Phenolic Compounds...
характеризующегося в Сибири холодными вечерами, увеличение числа хроматографических пиков особенно сильно проявляется в 2100 как у вероники дубравной, так и у манжетки городковатой.
По-всей видимости, у этих растений фенольные соединения выполняют важную адаптационную роль к суточным температурным колебаниям в условиях резко-континентального климата Сибири и Предбайкалья. Не исключено, что эти вещества
вторичного метаболизма растений активно задействуются и при других видах температурных воздействий, в том числе при адаптации к гипотермии и гипертермическому стрессу.
Очевидно, что для более полного проявления лекарственных свойств сбор представленных растений должен быть приурочен к утреннему или вечернему времени суток в зависимости от срока сбора.
Table 1. Метеорологические условия в течение суток (температура атмосферного воздуха и облачность) в даты отбора проб лекарственных растений
Метеорологические условия в течение суток в даты отбора проб
Время суток 200 500 800 1100 1400 1700 ГО о о о ГО со о о
16 июня
Температура воздуха + 13,3 + 12,2 + 10,1 + 13,9 + 18,7 +20,3 + 13,6 + 13,0
Облачность облачно облачно облачно облачно облачно облачно облачно облачно
15 августа
Температура воздуха + 17,3 + 17,1 + 15,1 + 17,5 + 15,9 + 16,2 + 15,3 + 19,1
Облачность облачно облачно облачно облачно облачно облачно облачно облачно
19 сентября
Температура воздуха +8,1 +8,0 +7,7 +6,9 +7,0 +8,5 +4,7 +3,4
Облачность облачно облачно облачно облачно облачно облачно облачно облачно
Table 2. Общее содержание фенольных соединений, мг/ г сырой массы в листьях и соцветиях манжетки городковатой и вероники дубравной
Вид растения Время суток Общее содержание фенольных соединений, мг/ г сырой массы
Соцветия Листья
25 июня 25 июня 15 августа 19 сентября
Alchemilla subcrenata 9.00 3,95±0,43 3,28±0,73 3,22±0,21 4,84±0,34
14.00 3,81±0,18 5,31±0,57 8,13±0,41 2,43±0,20
21.00 3,12±0,15 1,25±0,06 2,92±0,20 4,17±0,69
Veronica chamaedris 9.00 4,22±0,29 4,10±0,27 1,04±0,08 4,00±0,30
14.00 2,79±0,40 2,29±0,14 2,03±0,45 3,64±0,20
21.00 2,30±0,26 1,69±0,11 1,76±0,16 2,06±0,09
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
Zhivetev et al.
9
Table 3. Сводные данные ВЭЖХ тканей манжетки городковатой и вероники дубравной
Орган растения Дата отбора Время суток Число пиков Из них идентифицировано:
Veronica chamaedrys Alchemilla subcrenata Alchemilla subcrenata
соцветия 25 июня 2013 г 900 36 26
1400 34 22
2100 36 24
лист 25 июня 2013 г 900 34 23-24 кемпферол 3-б^-глюкопиранозид, фенилуксусная кислота, рутин, гиперозид, протоцеанидин В1, кверцетин 3-б-Д-глюкозид, кверцетин
1400 41 22
2100 44 32-35 кверцетин, периндопил
лист 15 августа 2013 г 900 43 30
1400 37 31 кемпферол 3-б^-глюкопиранозид
2100 36 24 кверцетин, кемпферол
лист 19 сентября 2013 г 900 33 24
1400 28 21 кемпферол 3-б^-глюкопиранозид
2100 38-39 26
лист 16 июня 2014 г 1400 41 - -
соцветия 1400 36 - -
стебель 1400 38 - -
В таблицах 4 и 5 приведены характерные результаты хроматографического исследования листьев манжетки городковатой утром (900) и вечером (2100), отобранных в течение одних суток (25 июня 2013) с одной экспериментальной площадки. Вечером разнообразие фенольных соединений в данном случае увеличилось на треть и дополнилось восемью новыми соединениями. При этом в обеих пробах идентифицированный рутин утром (пик № 23, табл. 2) содержится в количестве всего 0,007 ± 0,001 мкг/мкл а вечером (пик № 24, табл. 3) его содержание заметно выше
(0,046±0,005 мкг/мкл). В то же время, в утренней пробе (900) идентифицирован еще один пик (№ 15, табл. 2), который вероятно представлен несколькими соединениями (рутин 0,125 ± 0,012 мкг/мкл, гиперозид 0,075 ± 0,007 мкг/мкл,
протоцеанидин В1 0,167 ± 0,017 мкг/мкл и кверцетин 3-б-Д-глюкозид 0,171 ± 0,017 мкг/мкл). Не менее заметный на хроматограмме пик № 15 в пробе, отобранной в 2100 (табл. 3), имеющий большую площадь (53,2 мкл), очевидно, тоже соответствует рутину.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
10
Chromatographic Study of Phenolic Compounds...
Table 4. Выявленные пики и их УФ-спектры в листьях манжетки городковатой, отобранных утром в 900 25 июня 2013 г.
№ время, мкл (объем удерживания, мкл) высота пика, AU площадь пика, AU*мкл УФ-спектры относительно 210 нм
220 нм 230 нм 240 нм 250 нм 260 нм 280 нм
1 273,71 0,34 2,409 0,428 0,293 0,210 0,131 0,102 0,177
2 709,40 0,01 0,160 1,051 1,046 0,802 0,658 0,654 0,294
3 773,57 0,09 2,255 0,708 0,256 0,111 0,078 0,042 0,059
4 816,33 0,01 0,106 0,238 0,168 0,124 0,214 0,238 0,062
5 828,40 0,03 0,350 0,265 0,189 0,005 -0,059 -0,030 0,024
6 860,58 0,01 0,109 1,121 1,564 1,039 0,446 0,546 1,366
7 911,34 0,04 0,977 0,978 0,780 0,565 0,510 0,531 0,574
8 948,37 0,02 0,190 0,774 0,437 0,464 0,517 0,468 0,516
9 982,56 0,07 1,369 1,043 0,799 0,763 0,667 0,461 0,498
10 1003,86 0,05 0,731 0,924 0,793 0,538 0,417 0,427 0,286
11 1037,84 0,15 1,639 1,160 0,943 0,617 0,493 0,444 0,518
12 1055,40 1,03 14,696 1,032 0,958 0,686 0,552 0,552 0,394
13 1085,51 0,32 5,855 0,998 0,860 0,611 0,514 0,497 0,354
14 1136,83 0,05 0,870 1,048 0,922 0,374 -0,011 0,039 0,300
15 1181,13 1,34 26,178 0,586 0,434 0,399 0,555 0,593 0,242
16 1230,09 0,01 0,142 0,667 0,333 0,231 0,362 0,431 0,314
17 1261,68 0,08 1,306 0,669 0,622 0,506 0,514 0,692 0,497
18 1296,18 0,08 0,885 0,580 0,523 0,468 0,541 0,717 0,342
19 1330,86 0,37 4,977 0,686 0,541 0,427 0,416 0,537 0,352
20 1364,09 0,11 1,221 0,663 0,494 0,461 0,543 0,511 0,281
21 1403,21 0,03 0,439 0,135 -0,095 -0,089 -0,065 -0,018 -0,057
22 1423,06 0,05 0,593 0,867 0,763 0,630 0,560 0,644 0,394
23 1448,82 0,22 2,907 0,578 0,444 0,424 0,611 0,595 0,252
24 1954,71 0,01 0,317 0,318 0,100 -0,019 -0,008 0,032 0,057
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
Zhivetev et al.
11
Table 5. Выявленные пики и их УФ-спектры в листьях манжетки городковатой, отобранных вечером в 2100 25 июня 2013 г.
№ время, мкл (объем удерживания, мкл) высота пика, AU площадь пика, AU*мкл УФ-спектры относительно 210 нм
220 нм 230 нм 240 нм 250 нм 260 нм 280 нм
1 273,43 2,01 15,508 0,422 0,291 0,211 0,128 0,092 0,167
2 774,24 0,19 5,116 0,750 0,288 0,139 0,084 0,030 0,068
3 816,61 0,14 1,438 0,432 0,321 0,242 0,339 0,369 0,136
4 828,02 0,19 2,476 0,389 0,285 0,109 0,068 0,091 0,078
5 861,38 0,02 0,267 1,179 1,409 0,880 0,272 0,343 1,350
6 895,30 0,01 0,081 0,769 0,763 0,410 0,059 0,277 0,676
7 913,60 0,02 0,194 1,152 0,602 0,363 0,353 0,345 0,637
8 952,18 0,04 0,509 1,041 0,687 0,614 0,561 0,395 0,581
9 978,33 0,22 4,241 1,171 0,851 0,891 0,802 0,437 0,726
10 1008,37 0,01 0,119 0,242 0,202 -0,471 -0,679 -0,074 -0,649
11 1034,38 0,22 3,128 1,125 0,785 0,792 0,706 0,386 0,666
12 1054,93 0,33 4,106 0,912 0,862 0,574 0,459 0,496 0,256
13 1083,93 0,13 2,449 0,714 0,570 0,335 0,391 0,552 0,118
14 1136,69 0,05 0,748 0,867 0,737 0,717 0,914 0,825 0,177
15 1182,52 2,74 53,189 0,607 0,443 0,402 0,557 0,583 0,261
16 1229,49 0,03 0,407 0,603 0,361 0,338 0,727 0,514 0,295
17 1253,90 0,08 1,006 0,552 0,397 0,334 0,564 0,547 0,249
18 1267,80 0,14 1,796 0,755 0,662 0,472 0,406 0,596 0,648
19 1295,85 0,02 0,260 0,614 0,433 0,396 0,555 0,594 0,279
20 1329,57 1,50 21,712 0,669 0,517 0,406 0,377 0,538 0,384
21 1362,34 0,65 9,770 0,621 0,449 0,421 0,506 0,493 0,299
22 1401,73 0,13 2,201 0,308 0,112 0,089 0,111 0,132 0,057
23 1420,34 0,26 3,915 0,626 0,536 0,465 0,477 0,582 0,326
24 1447,00 1,25 18,088 0,572 0,442 0,417 0,592 0,581 0,252
25 1486,53 0,02 0,321 0,564 0,286 0,181 0,269 0,289 0,171
26 1532,52 0,01 0,072 0,639 0,742 0,402 0,078 0,150 0,698
27 1546,56 0,01 0,094 0,531 0,391 0,208 0,081 0,044 0,427
28 1566,01 0,02 0,234 0,648 0,512 0,395 0,352 0,538 0,399
29 1601,12 0,01 0,154 0,562 0,391 0,422 0,503 0,352 0,253
30 1683,68 0,02 0,220 0,511 0,423 0,421 0,619 0,581 0,225
31 2251,99 0,01 0,191 0,539 0,063 0,209 0,535 0,808 0,269
32 2579,34 0,02 0,318 0,825 0,043 -0,001 0,015 0,035 -0,006
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
12
Chromatographic Study of Phenolic Compounds...
CONCLUSIONS
Изучение суточных и сезонных изменений количественного и качественного состава фенольных соединений в листьях двух видов травянистых лекарственных растений: манжетки городковатой Alchemilla subcrenata и вероники дубравной Veronica chamaedrys выявило, на наш взгляд, существенные особенности содержания фенольных соединений и флавоноидов в зависимости от сроков сбора лекарственного сырья и времени суток.
ACKNOWLEDGMENT
Работа выполнена при поддержке Интеграционной программы «Фундаментальные исследования и прорывные технологии как основа
опережающего развития Байкальского региона и
его межрегиональных связей».
REFERENCES
Pell E.J. (1984) Secondary metabolism and air pollutants. In: Gaseous air pollutants and plant metabolism, Koziot M.J., Wratley F.R. (ed.) Butterworths: London, 222-237.
Shaldaev T.M. (2009) Soderzhanie flavonoidov v prirodnyh populjazijah Artemisia absinthium L., proizrastajushchej v lesostepnoj zone zapadnoj Sibiri. Himija rastitelnogo syrja, 2, 169-170.
Zaprometov M.N. (1971) Fenolnye soedinenija i metody ih issledovanija. In: Biohimicheskie metody v fiziologii rastenii, pod red. Pavlinoj O.A. M.: Nauka, 185-197.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
