CC BY
3
ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 17. ПОЧВОВЕДЕНИЕ. 2023. Т. 78. № 3 LOMONOSOV SOIL SCIENCE JOURNAL. 2023. Vol. 78. No. 3
УДК 631.453
DOI:10.55959/MSU0137-0944-17-2023-78-3-65-75
ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ В НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОМ ЧЕРНОЗЕМЕ ОБЫКНОВЕННОМ ПОСЛЕ РЕМЕДИАЦИИ
Т. В. Минникова*, А. С. Русева, С. И. Колесников, Д. А. Труфанов
Южный федеральный университет, 344006, Россия, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, д. 105/42 * E-mail: [email protected]
Бактерии являются чувствительным индикатором состояния почвы, в частности, загрязненной нефтью и нефтепродуктами. После внесения ремедиантов содержание нефти и продуктов ее трансформации в почве изменяется, что влияет на численность бактерий. Цель — оценить численность бактерий в нефтезагряз-ненном черноземе обыкновенном после ремедиации. В нефтезагрязненный чернозем (5% нефти от массы почвы) вносили биочар, гумат натрия, нитроаммофоску и микробиологическое удобрение «Байкал ЭМ-1». Через 90 суток эксперимента численность бактерий в почве оценивали по общей численности бактерий, определенной методом люминесцентной микроскопии, численности актиномицетов, амилолитических и аммонифицирующих бактерий, определенной методом посева на плотные питательные среды. Рассчитывали интегральный показатель численности бактерий (ИПЧБ) почвы до и после применения ремедиантов. Для оценки экологического состояния почвы при ремедиации нефтезагрязненного чернозема биочаром возможно использовать общую численность бактерий, нитроаммофоской — численность аммонифицирующих бактерий, гуматом натрия — численность актиномицетов, удобрением «Байкал ЭМ-1» — численность амилолитических бактерий. Согласно ИПЧБ почв при ремедиации нитроаммофоской, биочаром и удобрением «Байкал ЭМ-1» наиболее эффективная доза Д05, а при ремедиации гуматом натрия — Д2. Результаты исследования целесообразно использовать при биодиагностике и мониторинге состояния не-фтезагрязненных черноземов после ремедиации.
Ключевые слова: почва, экотоксичность, биочар, гумат натрия, нитроаммофоска, «Байкал ЭМ-1», биодиагностика.
Введение
Территория Юга России — это важный стратегический путь транспортировки нефти и нефтепродуктов в нашей стране и в соседние страны. Через территорию Азербайджана и далее по Югу России (Ставропольский и Краснодарский край, Республики Дагестан, Ингушетия и Чечня, Ростовская и Волгоградская области) проложены тысячи километров нефтепроводов и автомобильных дорог, по которым транспортируют нефть и нефтепродукты [Ховард и др., 2007; Исмаилов, Наджафова, 2022]. Учитывая, что места добычи нефти в основном расположены на морском шельфе, уровень загрязнения нефтью и нефтепродуктами вод прибрежной территории Черного и Азовского морей превышает в несколько раз установленные нормативы [Миронов, Миронов, 2020]. Загрязнение морской воды сказывается напрямую также на загрязнении прибрежных территорий. При возникновении аварийных ситуаций происходит загрязнение почвы, что влечет нарушение растительного покрова и отчуждение земель на долгие годы. В Южном федеральном округе расположено три сектора нефтеперерабатывающих заводов с мощностью переработки 27,9
млн тонн нефти в год: крупные заводы (Волгоградский — 15,7 млн тонн и «РН-Туапсинский НПЗ» — 12 млн тонн), несколько небольших заводов, а также мини-заводов (ООО «Славянск-Эко», Афипский, Ильский, Новошахтинский НПЗ) [https://yfo.spr. ги/а11/пеА:ерегегаЬаиуаушсЫе-2ауо^; kommersant.ru/].
Применение ремедиантов позволит снизить содержание нефти, нефтепродуктов и сопутствующих соединений, как бенз(а)пирен, с целью восстановления экологического состояния почвы [Минни-кова и др., 2018, 2019; Наджафова, Багирова, 2021; Смагин и др., 2021; Ковалева и др., 2022; Мтшкоуа et а1., 2021; 8огта, Dani1ov, 2023]. Чувствительными индикаторами нарушения состояния почв и их последующего восстановления являются микробиологические показатели, отражающие состояние почвы на микроскопическом уровне [Водопьянов и др., 2009; Киреева и др., 2011; КаЫгс^ et а1., 2012]. По данным Т.Г. Добровольской [2015] в биомассе чернозема обыкновенного при оптимальных условиях функционирования абсолютно доминируют грибы (87,8% от общего числа) и споры грибов (8%), а доля бактерий составляет лишь 2,8%. При антропогенной нагрузке на почвы это равновесие нарушается.
© Минникова Т.В., Русева А.С., Колесников С.И., Труфанов Д.А., 2023
шшЕ^т
65
BY-NC
В связи с этим происходят существенные изменения в циклах углерода и азота. Достаточный уровень численности актиномицетов, амилолитических и аммонифицирующих бактерий обеспечивает самоочищение (самовосстановление) почвы при различных видах антропогенного воздействия [Артамонова и др., 2002; Акименко и др., 2013; Akimenko et al., 2014].
Численность бактерий является важнейшим диагностическим показателем состояния почв при различных видах антропогенного воздействия, в том числе при загрязнении нефтяными углеводородами [Звягинцев и др., 2002; Kolesnikov et al., 2010; Дегтярева и др., 2009]. Изменение численности и состава бактерий при нефтезагрязнении непосредственно связано с физико-химическими свойствами почвы после загрязнения и влияет на ферментативную активность почв, а также на эмиссию СО2 [Во-дяницкий и др., 2016; Minnikova et al., 2019, 2021].
Цель исследования — оценить численность бактерий в нефтезагрязненном черноземе обыкновенном после ремедиации.
Материалы и методы
Объект исследования — чернозем обыкновенный карбонатный, место отбора образцов почвы для модельного эксперимента — пашня Ботанического сада Южного федерального университета. Образцы отбирались из пахотного горизонта с глубины 0-10 см. Содержание органического вещества определяли методом мокрого сжигания почвы дихроматной смесью со спектрофотометрическим окончанием по И.В. Тюрину [Тюрин, 1931]; реакцию почвенной среды анализировали в почвенной вытяжке (вода:почва — 2,5:1) с помощью анализатора рН-150МИ; гранулометрический состав чернозема определяли по Н.А. Качинскому [Галеева и др., 2012]. Горизонт характеризуется содержанием гумуса, равным 3,7%, рН=7,8, и тяжелосуглинистым гранулометрическим составом.
Для оценки численности бактерий после реме-диации в лабораторных условиях моделировали нефтяное загрязнение чернозема (5% нефти от массы почвы) с внесением биочара (5% от массы почвы), нитроаммофоски (0,375% от массы почвы), гумата натрия (1% раствор) и удобрения «Байкал ЭМ-1» (0,5%-й раствор). Каждый ремедиант вносили в рекомендуемой производителем и на основании литературных данных дозе (Д), в уменьшенной на 50% (Д0,5) и в удвоенной — 200% (Д2).
Биочар — это чистый древесный уголь березы (Betula alba Ehrh.) марки А ГОСТ 7657-84 с содержанием углерода не менее 85%. Продукт производится методом пиролиза древесины (800°С) в ретортных установках без доступа кислорода (ООО «ДианАГРО», Новосибирск, Россия). Количество углерода в одной тонне биочара эквивалентно содержанию трех тонн углерода (С) в углекислом газе
(СО2). По отношению к нефтяным углеводородам биочар служит сорбентом и стимулятором натив-ной биоты почвы.
Нитроаммофоска — минеральное азотно-фос-форно-калийное удобрение. Это физиологически нейтральное и наиболее распространенное удобрение, где соотношение N:P:K составляет 15:15:15. В нитроаммофоске азот и калий находятся в виде легкорастворимых соединений (NH4NO3, NH4Cl, KNO3, KCl), а фосфор частично в виде дикальций фосфата, нерастворимого в воде, но доступного для растений, частично в виде водорастворимого фосфата аммония и монофосфата кальция. В исследованиях использовали нитроаммофоску фирмы АО «Минудобрения» (Россошь, Воронежская область, Россия). Внесение такого азотного удобрения обусловлено нарушением равновесия между углеродом (C) и азотом (N) после внесения нефти как антропогенного источника углерода.
Гумат натрия вносили в почву в виде раствора ГУМИ-30 фирмы НВП «Башинком» (Уфа, Республика Башкортостан, Россия). В состав гумата натрия входят натриевые соли гумусовых кислот (до 70%), а также микроэлементы: Mo, Cu, Co, Mg и Zn и тяжелые металлы: Pb и Cd. Гумат натрия — один из лучших стимуляторов роста овощных и плодовых культур.
Микробиологическое удобрение «Байкал ЭМ-1» содержит 60 полезных микроорганизмов, в состав которых входят штаммы бактерий (Paenibacillus pabuli, Azotobacter vinelandii, Lactobacillus casei, Clostridium limosum, Cronobacter sakazakii, Rhodotorulla mucilaginosa, Cryptococcus), гибридные дрожжи (Saccharomyces, Candida lipolitica, Candida norvegensis, Candida guilliermondii) и грибы (Aspergillus, Penicillium, Actinomycetales). Внесение такого сочетания микроорганизмов стимулирует разложение нефти и способствует восстановлению экологических функций почвы после загрязнения.
Предварительно высушенную и просеянную через сито 3 мм почву массой 300 г помещали в пронумерованные вегетационные сосуды согласно нумерации по вариантам эксперимента в 3-кратной повторности, увлажняли до 25% от массы почвы, вносили нефть концентрации 5% от массы почвы и тщательно перемешивали с почвой. Эта концентрация нефти в почве является наиболее распространенной при аварийных разливах нефти. Для модельного эксперимента использовали сернистую нефть Новошахтинского завода нефтепродуктов, г. Новошахтинск, Ростовская область. Характеристики нефти: плотность — 0,861 кг-м-3, содержание серы — 1,34%, массовая доля воды — 0,27%, концентрация хлористых солей — 73 мг-дм-3, массовая доля механических примесей — 0,006%, массовая доля парафина — 4.46%. После внесения нефти в почву вносили ремедианты. Инкубацию сосудов
проводили в климатической камере Binder KBW 240 при контроле температуры (25°С) и влажности почв (25% от массы почвы) на протяжении 90 суток от начала эксперимента. По окончании периода экспозиции в почве проводили оценку численности бактерий методом люминесцентной микроскопии и прямым посевом в почвенные среды (табл. 1) [Казеев и др., 2016].
Таблица 1
Методы определения численности бактерий
Б - Бх1 Б1 - "с-
х 100,
(2)
№ Наименование Метод Единицы измерения
1 Общая численность бактерий Люминесцентной микроскопии по Д.Г. Звягинцеву 1 млрд / грамм почвы
2 Численность актиномицетов Глубинный посев на плотную питательную подкисленную среду Чапека — Докса тыс. КОЕ / 1 грамм почвы
3 Численность аммонифицирующих бактерий Глубинный посев на плотную питательную среду МПА тыс. КОЕ / 1 грамм почвы
4. Численность амилолитических бактерий Глубинный посев на плотную питательную среду КАА тыс. КОЕ / 1 грамм почвы
Общую численность бактерий оценивали методом люминесцентной микроскопии по Д.Г. Звягинцеву [Звягинцев и др., 2002]. Результаты определения общей численности бактерий выражали в 109 бактерий на грамм сухой массы почвы (уравнение 1):
Ь х А х Н х Т
M - -
(1)
где М — число клеток в 1 г свежей почвы; А — среднее количество клеток в пределах одного поля зрения; Ь — коэффициент увеличения (Ь = 4); Н — индекс разбавления; Т — коэффициент пересчета в миллиардах бактерий на 1 грамм почвы (Т = 1010); Р — площадь поля зрения, мкм2.
Для оценки состояния почв после ремедиации биочаром, гуматом натрия, нитроаммофоской, удобрением «Байкал ЭМ-1» по всем микробиологическим показателям рассчитывали интегральный показатель численности бактерий в черноземе обыкновенном (ИПЧБ) [Ко1е8шкоу е! а1., 2019]. Для этого в выборке контрольное значение каждого из показателей принимается за 100%, и по отношению к нему в процентах выражается значение микробиологического показателя в остальных образцах. Расчет относительных значений проводили для всех показателей: общая численность бактерий, численность актиномицетов, численность аммонифицирующих бактерий, численность амилолитических бактерий. Представлен этап расчета относительного значения (Б1) на примере показателя № 1 (уравнение 2):
где Б1 — относительный балл показателя № 1; Бх1 — фактическое значение показателя № 1; Бтах1 — максимальное значение показателя № 1.
После этого рассчитывается средний оценочный балл всех изученных микробиологических показателей для каждого варианта, абсолютные значения которых не могут быть суммированы, так как имеют разные единицы измерения (1 млрд /г; тыс. КОЕ /1 г почвы) (уравнение 3):
Б = Б, + Б2 + Б3 + Б4 "ср 4 '
(3)
Интегральный показатель численности бактерий (ИПЧБ) почвы рассчитывают по уравнению 4:
Бс
ИПЧБ - х 100,,
Б
(4)
ср.тах
где Бср — средний оценочный балл всех показателей, Бсртах — максимальный оценочный балл всех показателей.
Статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием программного пакета Statistica 12.0. Статистика (средние значения, дисперсия) была определена, а надежность различных образцов была установлена с использованием дисперсионного анализа (Student t-test).
Результаты
Изменение общей численности бактерий.
Было исследовано самостоятельное влияние реме-диантов на общую численность бактерий в незагрязненном черноземе (рис. 1). При загрязнении нефтью численность бактерий снизилась на 76% относительно контроля. Установлено, что общая численность бактерий снижается при внесении всех ремедиантов на 32-81% от контроля соответственно. Увеличение численности наблюдали после внесения Д2 гумата натрия — 30% выше контроля. При внесении реме-диантов в нефтезагрязненный чернозем наблюдали разнонаправленное влияние на общую численность бактерий. Численность бактерий была максимальной после внесения Д0,5 биочара и нитроаммофоски — на 52 и 11% выше, чем при нефтезагрязнении.
Внесение удобрения «Байкал ЭМ-1» в рекомендуемой дозе позволило увеличить численность бактерий в нефтезагрязненном черноземе на 26% относительно нефтезагрязнения. По общей численности бактерий составлен ряд эффективности применения ремедиантов в черноземе:
биочар >«Байкал ЭМ-1» >гумат натрия > нитроаммофоска
Изменение численности актиномицетов. При
загрязнении нефтью численность актиномицетов снизилась на 81% относительно контроля. Численность актиномицетов в почве после внесения Д0,5 биочара и Д2 гумата натрия повышалась на 19% и
А
140 120 100 80 60 40 20 0
гЪ
1ш
140 120 100 80 60 40 20 0
гЕп
11п ПП пп Пп
Почва Д 0,5
Д 2
Почва Д 0,5
Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
пЬ
1
Почва Д 0,5
Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
Г*1
1_Ш
| | без нефти
с нефтью
Лж
Почва Д 0,5
Д 2
Рис. 1. Изменение общей численности бактерий в нефтезагрязненном черноземе после внесения ремедиантов, % от контроля: А) биочар; Б) нитроаммофоска; В) гумат натрия; Г) «Байкал ЭМ-1»
Б
Д
Д
Г
В
Д
Д
достигала уровня контроля соответственно (рис. 2). Численность актиномицетов в нефтезагрязненном черноземе, напротив, при внесении биочара снижалась на 8% относительно нефтезагрязненного чернозема без ремедиантов, а при внесении Д и Д2 гумата натрия увеличилась на 20-22% по сравнению с загрязненной почвой без ремедиантов. Внесение удобрения «Байкал ЭМ-1» уже при дозе Д05 положительно повлияло на численность актиномицетов — на 12% от нефтезагрязнения.
По численности актиномицетов составлен ряд эффективности применения ремедиантов в черноземе:
гумат натрия >«Байкал ЭМ-1» > биочар > нитроаммофоска
Изменение численности амилолитических бактерий. При загрязнении нефтью численность амилолитических бактерий снизилась на 75% относительно контроля. Биочар в концентрации Д0,5 и Д2 увеличил численность амилолитических бактерий на 28 и 17% выше контроля соответственно (рис. 3). Нитроаммофоска в концентрации Д05 увеличила численность амилолитических бактерий на 18% относительно контроля.
В нефтезагрязненной почве при внесении Д2 биочара установлено увеличение численности ами-лолитических бактерий на 44% относительно нефте-
загрязненного чернозема. Внесение Д0,5 нитроаммофоски увеличило численность амилолитических бактерий на 51% от нефтезагрязнения.
По численности амилолитических бактерий в нефтезагрязненном черноземе после ремедиации составлен ряд эффективности применения реме-диантов:
«Байкал ЭМ-1» >нитроаммофоска >биочар > гумат натрия
Изменение численности аммонифицирующих бактерий. Численность аммонифицирующих бактерий в чистой почве без нефти при внесении Д0,5 биочара была увеличена на 11% по сравнению с контролем (рис. 4). В остальных концентрациях (Д и Д2) наблюдали снижение численности аммонифицирующих бактерий при любой концентрации каждого ремедианта на 60-98% относительно контроля. При загрязнении нефтью численность аммонифицирующих бактерий в почве снижалась на 98% относительно контроля.
При внесении биочара в нефтезагрязненный чернозем численность аммонифицирующих бактерий была увеличена на 35-80% относительно не-фтезагрязнения. При этом с ростом концентрации биочара численность бактерий имела тенденцию к снижению. Увеличение численности аммонифицирующих бактерий в нефтезагрязненном черноземе
А
140 120 100 80 60 40 20 0
Г*1
rii
I
1+1
Почва Д 0,5 Д
rii
Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
nh
rii
Почва Д 0,5
rîl
rin
Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
rii
Почва Д 0,5
rii
il
nh
JL
140 120 100 80 60 40 20 0
rii
Д 2 Почва
I I без нефти | | с нефтью
rii
I
Д 0,5
i
Д 2
Рис. 2. Изменение численности актиномицетов в нефтезагрязненном черноземе после внесения ремедиантов, % от контроля: А) биочар; Б) нитроаммофоска; В) гумат натрия; Г) «Байкал ЭМ-1»
Б
Д
Г
В
Д
Д
140 120 100 80 60 40 20 0
il
rîi
rb
1
140 120 100 80 60 40 20 0
rii
jL
Пи ni
Почва
Д 0,5
Д 2
Почва
Д 0,5
Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
rfi
rîi
i
Й_П
Почва
Д 0,5
L
Д 2
140 120 100 80 60 40 20
rîi
1
I
Почва
Д 0,5
I I без нефти | | с нефтью
Д 2
Рис. 3. Изменение численности амилолитических бактерий в нефтезагрязненном черноземе после внесения ремедиантов, % от контроля: А) биочар; Б) нитроаммофоска; В) гумат натрия; Г) «Байкал ЭМ-1»
Б
А
Д
Д
Г
В
0
Д
Д
также было установлено при внесении нитроаммофоски (22-64%) и гумата натрия (26-51%) относительно нефтезагрязненного варианта почвы без ремедиантов. Внесение удобрения «Байкал ЭМ-1» привело к увеличению численности аммонифицирующих бактерий в нефтезагрязненном черноземе только при рекомендуемой концентрации (Д) и удвоенной (Д2) на 19 и 16% относительно нефте-загрязнения соответственно. По численности аммонифицирующих бактерий в нефтезагрязненном черноземе после ремедиации составлен ряд эффективности применения ремедиантов:
биочар >гумат натрия >нитроаммофоска > «Байкал ЭМ-1»
Оценка информативности бактерий. Информативность каждого проанализированного вида микроорганизмов оценивали по тесноте корреляции с содержанием нефти в почве после ремедиа-ции. При внесении биочара в нефтезагрязненный чернозем по информативности биологических показателей представлен ряд:
общая численность бактерий = аммонифицирующие бактерии > актиномицеты = амилолитические бактерии
Наибольшая информативность, оцененная по степени восстановления численности бактерий при внесении биочара в нефтезагрязненном чернозе-
ме, установлена для общей численности бактерий, а наименьшая — для численности актиномицетов и амилолитических бактерий.
При внесении нитроаммофоски в нефтезагряз-ненный чернозем информативность биологических показателей представляет ряд:
аммонифицирующие бактерии = амилолитические бактерии > актиномицеты = общая численность бактерий
Наибольшая информативность, оцененная по степени восстановления численности бактерий в нефтезагрязненном черноземе при внесении нитроаммофоски, установлена для численности аммонифицирующих и амилолитических бактерий, а наименьшая — для общей численности бактерий в черноземе обыкновенном после ремедиации.
При внесении гумата натрия в нефтезагрязнен-ный чернозем информативность микробиологических показателей представляет ряд:
актиномицеты > аммонифицирующие бактерии > общая численность бактерий > амилолитические бактерии
Наибольшая информативность, оцененная по степени восстановления численности бактерий при внесении гумата натрия, установлена для актино-мицетов, а наименьшая — для амилолитических бактерий.
А
140 120 100 80 60 40 20 0
I I
Почва
Д 0,5
Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
пЬ
: . I__^_ ~ : I_
Почва
Д 0,5
Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
Г*1
О.
Почва
Д 0,5
Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
гЬ
| I
Почва
Д 0,5
Д 2
| | без нефти
с нефтью
Рис. 4. Изменение численности аммонифицирующих бактерий в нефтезагрязненном черноземе после внесения ремедиантов, % от контроля: А) биочар; Б) нитроаммофоска; В) гумат натрия; Г) «Байкал ЭМ-1»
Б
Д
Д
Г
В
Д
Д
140 120 100 80 60 40 20 0
Г±1
I
rin
ill
i
rfn
L
Почва Д 0,5 Д Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
rfi
Почва
I Hi ПИ
Д 0,5
Д Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
Г±1
111 III
Почва Д 0,5
Д 2
140 120 100 80 60 40 20 0
rfi
Uli
Почва Д 0,5
I I без нефти | | с нефтью
I I'll
Д 2
Рис. 5. Интегральный показатель численности бактерий в нефтезагрязненном черноземе после внесения
ремедиантов, % от контроля: А) биочар; Б) нитроаммофоска; В) гумат натрия; Г) «Байкал ЭМ-1»
При внесении удобрения «Байкал ЭМ-1» в не-фтезагрязненный чернозем информативность микробиологических показателей представляет ряд:
амилолитические бактерии > актиномицеты = общая численность бактерий > аммонифицирующие бактерии
Наибольшая информативность, оцененная по микробиологическим показателям при внесении удобрения «Байкал ЭМ-1», установлена для численности амилолитических бактерий, а наименьшая — для численности аммонифицирующих бактерий.
Изменение интегрального показателя численности бактерий чернозема. Результат расчета ИПЧБ по микробиологическим показателям представлен на рис. 5. Внесение ремедиантов в чистую почву без нефти способствовало снижению численности бактерий. Однако при внесении ремедиантов в нефтезагрязненную почву установлено увеличение численности бактерий и актиномицетов на 20-57% относительно контроля.
Внесение биочара Д05 увеличивает ИПЧБ на 32%, с ростом дозы Д и Д2 на 10 и 16% относительно нефтезагрязненного фона. При минимальной дозе Д05 установлено увеличение ИПЧБ после внесения нитроаммофоски и удобрения «Байкал ЭМ-1» на 17 и 42% соответственно. При рекомендуемой дозе (Д) увеличение ИПБЧ установлено после внесения нитроаммофоски, гумата натрия и удобрения «Байкал
ЭМ-1» на 10, 14 и 15% относительно нефтезагряз-ненного фона.
Таким образом, согласно ИПЧБ, в нефтезагрязненном черноземе при ремедиации нитроаммофоской, биочаром и удобрением «Байкал ЭМ-1» выбрана наиболее эффективная доза — Д05, а при ремедиации гуматом натрия — Д2.
Обсуждение
Согласно нашему исследованию, загрязнение почвы нефтью привело к снижению в % от контроля численности всех проанализированных видов бактерий в следующем порядке: аммонифицирующие бактерии > актиномицеты > амилолитические бактерии = общая численность бактерий. Загрязнение почвы нефтью снижает численность большинства микроорганизмов в почве, в частности приводит к сокращению численности доминирующих видов: Thiothrix, Sphingomonas, Gemmatimonas, Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter [Liang et al., 2016; Xu et al., 2021; Shi et al., 2022]. Причиной снижения численности является изменение содержания общего органического углерода, серы и значения рН, которые являются лимитирующими факторами для роста доминирующих родов Sphingomonas, Thiothrix и Pseudomonas. Р.Р. Каби-ровым с соавторами [2012] был ранее предложен список показателей биологической активности и восстановления нефтезагрязненного чернозема (1, 4
Б
А
Г
В
Д
Д
и 8% нефти от массы почвы) после внесения микробиологических препаратов, включающий, помимо активности каталазы, еще численность углеродо-кисляющих микроорганизмов, гетеротрофных микроорганизмов и микроскопических грибов. Численность гетеротрофов и микроскопических грибов увеличивалась при внесении Белвитамила при загрязнении почвы нефтью в концентрации 8% от массы почвы. Общая численность гетеротрофов при внесении биопрепарата «Метаболит» в нефте-загрязненную почву под посевы сахарной свеклы была простимулирована в 10 и 4 раз в ризосфере и эдафосфере свеклы соответственно [Киреева и др., 2011]. Целлюлозоразрушающие бактерии при внесении биопрепарата были простимулированы в эдафосфере в 3 раза по сравнению с загрязнением. Такой эффект обусловлен интенсификацией процессов разложения клетчатки и улучшения углеводного питания растений под влиянием метаболитов эндомикоризного гриба, входящего в состав биопрепарата.
Численность актиномицетов тесно связана с содержанием углерода в почве, при небольшом уровне загрязнения нефтью даже может быть обусловлена их ростом за счет дополнительного источника питания, каким являются отдельные углеводороды нефти [Леднев, Скворцова, 2017]. При высоком уровне загрязнения почвы нефтью (более 50 г-кг-1) численность актиномицетов снижается. В настоящем исследовании численность актиномицетов имела тенденцию к увеличению после добавления гумата натрия во всех дозах, удобрения «Байкал ЭМ-1» — в Д05 и Д и биочара — в Д05. Это обусловлено тесной связью между содержанием антропогенно внесенного углерода в почве и численностью актиноми-цетов [Виноградова, Кожевин, 2011; Поляк, Сухаре-вич, 2021]. Однако численность актиномицетов по сравнению с численностью аммоницифицирующих и амилолитических бактерий — это менее чувствительный показатель. В нашем исследовании установлено снижение численности аммонифицирующих и амилолитических бактерий в нефтезагрязненном черноземе на 75-98% относительно контроля. При загрязнении нефтью установлено наибольшее снижение численности аммонифицирующих бактерий (98%), что обусловлено нарушением равновесия между С^ в результате привноса углерода нефти [Исмаилов, 1983; Колесников и др., 2007; Коршунова, 2019]. Значительное снижение численности аммонифицирующих бактерий при нефтезагряз-нении связано с поступлением в почву не только дополнительного количества доступного микроорганизмам органического вещества, но и толуола, бензола, ксилола, нафталина, тяжелых металлов и ряда других токсичных для бактерий соединений, как установлено ранее в исследованиях [Исмаилов, 1983; Пиковский, 1993; Звягинцев и др., 2002; Шар-кова и др., 2011].
Как отдельные группы микроорганизмов, так и общая численность бактерий непосредственно зависит от остаточного содержания нефти в почве после ремедиации. Как видно из ряда чувствительности микробиологических показателей, полученного в нашем исследовании, после внесения биочара в не-фтезагрязненный чернозем наибольшей чувствительностью обладает именно общая численность бактерий. Ранее было установлено, что после внесения двух концентраций биочара (10 и 20% от массы почвы) в нефтезагрязненный чернозем обыкновенный обнаружен рост численности бактерий при снижении содержания нефти и увеличение интенсивности дыхания почвенной биоты (г= -0,60-1,00) [Мтшкоуа е! а1., 2022]. Увеличение или снижение численности микроорганизмов зависит от концентрации и вида ремедианта. Так, при ремедиации нефтезагрязнения биочаром, удобрением «Байкал ЭМ-1» и нитроаммофоской рекомендуется Д05, а при ремедиации гуматом натрия — Д2. Наибольшее повышение численности бактерий, в том числе амилолитических и аммонифицирующих бактерий, наблюдали после внесения биочара и удобрения «Байкал ЭМ-1». Остальные ремедианты были менее эффективны. Внесение нитроаммофоски способствует восстановлению численности амилолитиче-ских и аммонифицирующих бактерий, а применение гумата натрия — актиномицетов и аммонифицирующих бактерий. Общая численность бактерий была увеличена только при внесении биочара в нефтеза-грязненный чернозем. Большая эффективность нитроаммофоски как источника минерального азота при восстановлении численности амилолитических и аммонифицирующих бактерий нефтезагрязнен-ного чернозема связана с потребностью в азоте, содержание которого резко снизилось при внесении большого количества углерода нефти. Увеличение численности актиномицетов после внесения гумата натрия в нефтезагрязненном черноземе обусловлена увеличением потребления биотой органических и минеральных субстратов, содержащихся в гумате [Кузнецова и др., 1989; Безуглова и др., 2016].
Полученные результаты позволяют использовать численность микроорганизмов в качестве диагностического критерия состояния нефтезагряз-ненной почвы после использования ремедиантов с различным механизмом воздействия на содержание нефти в почве: за счет привноса питательных элементов (гумат натрия, биочар) и оптимизации соотношения между С^ (нитроаммофоска), так и внесения других микроорганизмов, как потенциальных нефтедеструкторов (удобрение «Байкал ЭМ-1»).
Заключение
Применение исследуемых ремедиантов при не-фтезагрязнении оказывает влияние на численность бактерий в почве. Для оценки экологического состояния почв по численности бактерий при внесении
биочара возможно использовать общую численность бактерий, нитроаммофоски — численность аммонифицирующих бактерий, гумата натрия — численность актиномицетов, удобрения «Байкал ЭМ-1» — амилолитических бактерий. Согласно ИПЧБ почв при ремедиации нитроаммофоской, биочаром и удобрением «Байкал ЭМ-1» наиболее эффективна доза Д05, а при ремедиации гуматом натрия — Д2. Результаты исследования целесообразно использовать при биодиагностике и мониторинге экологического состояния нефтезагрязненного чернозема после ремедиации.
Информация о финансировании работы
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Президента РФ (МК-175.2022.5) и проекта Министерства науки и высшего образования РФ по поддержке молодежной лаборатории «Агробиотехнологии для повышения плодородия почв и качества сельскохозяйственной продукции» в рамках программы развития межрегионального научно-образовательного центра Юга России (ЛабНОЦ-21-01АБ, FENW-2021-0014).
Вклад авторов
Минникова Т.В., Колесников С.И. — планирование эксперимента, общее руководство, Русева А.С., Труфанов Д.А. — проведение опытов, интерпретация результатов, подготовка рукописи, Мин-никова Т.В. — редактирование текста, подготовка рисунков и таблиц.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И. и др. Экологические последствия загрязнения почв антибиотиками // Известия Самарского научн. центра РАН. 2013. Т. 15, № 3-4.
2. Безуглова О.С., Полиенко Е.А., Горовцов А.В. Гу-миновые препараты как стимуляторы роста растений и микроорганизмов (обзор) // Известия Оренбургского гос. аграрного ун-та. 2016. № 4 (60).
3. Виноградова К.А., Кожевин П.А. Взаимоотношения актиномицетов с почвенными грибами и их использование для биологического контроля фитопатогенов // Микология и фитопатология. 2011. Т. 45, № 4.
4. Водопьянов В.В., Киреева Н.А., Григориади А.С. и др. Влияние нефтяного загрязнения почвы на ризо-сферную микробиоту и моделирование процессов биодеградации углеводородов // Вестн. Оренбургского гос. ун-та. 2009. № 6 (100).
5. Водяницкий Ю.Н., Трофимов С.Я., Шоба С.А. Перспективные подходы к очистке почв и почвенно-грунто-вых вод от углеводородов (обзор) // Почвоведение. 2016. № 6. https://doi.org/10.7868/S0032180X16040158
6. Галеева Л.П. Почвоведение: Учебное пособие. Новосибирск, 2012.
7. Дегтярева Е.А., Виноградова К.А., Александрова А.В. и др. Почвенные актиномицеты как потенциальные биофунгициды // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2009. № 2.
8. Звягинцев Д.Г., Умаров М.М., Чернов И.Ю. Микробные сообщества и их функционирование в процессах деградации и самовосстановления почв // Деградация и охрана почв. М., 2002.
9. Исмаилов Н.М. Влияние нефтяного загрязнения на круговорот азота в почве // Микробиология. 1983. Т. 52, № 6.
10. Исмаилов Н.М., Наджафова С.И. Оценка экологических рисков эксплуатации магистральных нефтепроводов на территории Азербайджана с точки зрения био-геоустойчивости почв к загрязнению сырой нефтью // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2022. № 3.
11. Казеев К.Ш., Колесников С.И., Акименко Ю.В. и др. Методы биодиагностики наземных экосистем. Ростов-на-Дону, 2016.
12. Киреева Н.А., Баширова Р.М., Багаутдинова Г.Г. и др. Детоксицирующий и стресспротекторный эффект биопрепарата «Метаболит» при загрязнении нефтью посевов сахарной свеклы // Агрохимия. 2011. № 6.
13. Ковалева Е.И., Трофимов С.Я., Шоба С.А. Реакция высших растений на уровень нефтезагрязнения почв в вегетационном опыте // Вест. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2022. № 3.
14. Кузнецова И.А., Томащук А.Ю., Вожик Т.Л. и др. Трансформация гумата натрия и гумат-симазиново-го комплекса в культуре почвенных актиномицетов // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии: Научно-теоретический журнал Российского государственного аграрного университета — МСХА имени К.А. Тимирязева. 1989. Вып. 2.
15. Минникова Т.В., Денисова Т.В., Колесников С.И. и др. Оценка агроэкологических показателей нефтеза-грязненного чернозема Ростовской области при ремеди-ации мочевиной и гуматом калия // Российская сельскохозяйственная наука. 2018. № 1.
16. Минникова Т.В., Колесников С.И., Денисова Т.В. Влияние азотных и гуминовых удобрений на биохимическое состояние нефтезагрязненного чернозема // Юг России: Экология, развитие. 2019. Т. 14, № 2. Ы1р8:/Мо1. о^/10.18470/1992-1098-2019-2-189-201
17. Миронов О.А., Миронов О.Г. Современные данные по загрязнению прибрежной акватории Азово-Черноморского региона России нефтяными углеводородами // Юг России: экология, развитие. 2020. Т. 15, № 3 (56). https://doi.org/10.18470/1992-1098-2020-3-77-85
18. Наджафова С.И., Багирова Ч.З. Пути повышения биогенности, ассимиляционного потенциала и плодородия почвенного покрова городских ландшафтов города Сумгаита // Юг России: экология, развитие. 2021. Т. 16, № 3 (60). https://doi.org/10.18470/1992-1098-2021-3-88-94
19. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде. М., 1993.
20. Поляк Ю.М., Сухаревич В.И. Выявление и регуляция антагонистических свойств почвенного актино-мицета Streptomyces sp. 89 // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2021. № 5. https://doi. org/10.31857/S1026347021050127
21. Смагин А.В., Садовникова Н.Б., Смагина М.В. и др. Оценка биоремедиационной способности и экологическое нормирование городских почв по загрязнению
бенз(а)пиреном // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2021. № 4.
22. Тюрин И.В. Новое видоизменение объемного метода определения гумуса с помощью хромовой кислоты // Почвоведение. 1931. № 5-6.
23. Ховард Ч., Прейгер Д., Малярчук И. и др. Каспийская нефть и газ: экспортные маршруты и транспортировка // Центральная Азия в современном мире: внешнеполитические и геоэкономические аспекты развития. 2007.
24. Шаркова С.Ю., Полянскова Е.А., Парфенова Е.А. Состояние микробного комплекса почв при нефтеза-грязнении // Известия Пензенского гос. педагогического ун-та им. В.Г. Белинского. 2011. № 25.
25. Akimenko Y.V., Kazeev K.S., Kolesnikov S.I. The impact of antibiotics (benzylpenicillin, and nystatin) on the biological properties of ordinary chernozems // Eurasian Soil Science. 2014. Vol. 47, № 9. https://doi.org/10.1134/ S1064229314070023
26. Dobrovolskaya T.G., ZvyagintsevD.G., ChernovI.Y. et al. The role of microorganisms in the ecological functions of soils // Eurasian Soil Science. 2015. Vol. 48, № 9. https://doi. org/10.1134/S1064229315090033
27. Kabirov R.R., Safiullina L.M., Kireeva N.A. et al. Evaluating the biological activity of oil-polluted soils using a complex index // Eurasian Soil Science. 2012. Vol. 45, № 2. https://doi.org/10.1134/S1064229312020123
28. Kolesnikov S.I., Gaivoronskii V.G., Rotina E.N. et al. Assessment of soil tolerance toward contamination with black oil in the south of Russia on the basis of soil biological indices:
A model experiment // Eurasian Soil Science. 2010. Vol. 43, № 8.
29. Kolesnikov S.I., Kazeev K.S., Akimenko Y.V. Development of regional standards for pollutants in the soil using biological parameters // Environmental Monitoring and Assessment. 2019. № 191. https://doi.org/10.1007/s10661-019-7718-3
30. Minnikova T., Kolesnikov S., Minkina T. et al. Assessment of Ecological Condition of Haplic Chernozem Calcic Contaminated with Petroleum Hydrocarbons during Application of Bioremediation Agents of Various Natures // Land. 2021. № 10. https://doi.org/10.3390/ land10020169
31. Minnikova T., Kolesnikov S., Ruseva A. et al. Influence of the Biochar on Petroleum Hydrocarbon Degradation Intensity and Ecological Condition of Haplic Chernozem // Eurasian Journal of Soil Science. 2022. № 11 (2). https://doi. org/10.18393/ejss.1037798
32. Minnikova T.V., KolesnikovS.I., KazeevK.Sh. Impact of ameliorants on the biological condition of oil-contaminated black soil // Soil and Environment. 2019. Vol. 38 (2). https:// doi.org/10.25252/SE/19/101872
33. Sozina I.D., Danilov A.S. Microbiological remediation of oil-contaminated soils // Journal of Mining Institute. 2023. https://doi.org/10.31897/PMI.2023.8
34. https://www.kommersant.ru/doc/4110326
35. https://yfo.spr.ru/all/neftepererabativayuschie-za-vodi/
Поступила в редакцию 10.02.2023 После доработки 18.04.2023 Принята к публикации 04.05.2023
ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 17. ПОЧВОВЕДЕНИЕ. 2023. Т. 78. № 3 LOMONOSOV SOIL SCIENCE JOURNAL. 2023. Vol. 78. No. 3
NUMBER OF BACTERIA IN HAPLIC CHERNOZEM CONTAMINATED BY PETROLEUM HYDROCARBONS AFTER AMELIORATION
T. V. Minnikova, A. S. Ruseva, S. I. Kolesnikov, D. A. Trufanov
Bacteria are a sensitive indicator of the state of the soil contaminated with oil and oil products. After the introduction of ameliorants, the oil content in the soil changes, which affects the number of bacteria. The aim is to estimate the number of bacteria in petroleum hydrocarbons contaminated Haplic Chernozem after amelioration. Biochar, sodium humate, nitroammophos, and microbiological fertilizer «Baikal EM-1» were added to petroleum hydrocarbons-contaminated Haplic Chernozem (5% petroleum hydrocarbons by weight of soil). After 90 days of the experiment, the number of bacteria in the soil was estimated by the total number of bacteria, determined by the method of luminescent microscopy, the number of actinomycetes, amylolytic and ammonifying bacteria, determined by the method of inoculation on solid nutrient media. The integral indicator of the number of bacteria (IINB) of the soil was calculated before and after the application of ameliorants. When introducing biochar, it is possible to use the total number of bacteria to assess the ecological state of the soil, with nitroammophoska — the number of ammonifying bacteria, sodium humate — the number of actinomycetes, «Baikal EM-1» — the number of amylolytic bacteria. According to the IINB of soils, the most effective dose for remediation with nitroammophoska, biochar, and Baikal EM-1 is D05, and for remediation with sodium humate, D2. It is advisable to use the results of the study in biodiagnostics and monitoring the state of petroleum hydrocarbons contaminated Haplic Chernozem after amelioration.
Key words: soil, ecotoxicity, biochar, sodium humate, nitroammophoska, «Baikal EM-1», biodiagnostics.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Минникова Татьяна Владимировна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории «Агробиотехнологии для повышения плодородия почв и качества сельскохозяйственной продукции» Академии биологии и биотехнологии имени Д.И. Ивановского Южного федерального университета, e-mail: [email protected]
Русева Анна Степановна, аспирант кафедры экологии и природопользования Академии биологии и биотехнологии имени Д.И. Ивановского Южного федерального университета, e-mail: [email protected]
Колесников Сергей Ильич, докт. с.-х. наук, проф., заведующий кафедрой экологии и природопользования Академии биологии и биотехнологии имени Д.И. Ивановского Южного федерального университета, e-mail: [email protected]
Труфанов Дмитрий Александрович, аспирант кафедры экологии и природопользования Академии биологии и биотехнологии имени Д.И. Ивановского Южного федерального университета, e-mail: [email protected]
© Minnikova T.V., Ruseva A.S., Kolesnikov S.I., Trufanov D.A., 2023
