CC BY
10УДК 61:575
Н.С. Сихаева12, Ж.М. Джармуханов1, Е.В. Жолдыбаева1, Е.М. Раманкулов123
ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ АЛЛЕЛЬНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ АВЯВ2, ЕАВР2, РРАЯв, ЕТО, АОЯВЗ И АРОА2 СРЕДИ КОРЕННОГО НАСЕЛЕНИЯ КАЗАХСТАНА
1РГП «Национальный центр биотехнологии» Казахстан, 000001, г. Астана, ул. Валиханова, 13/1 2Евразийский национальный университет имени Л.Н. Гумилева Казахстан, 000001, г. Астана, ул. К. Мунайтпасова, 5 3Школа наук и технологий, Назарбаев Университет Казахстан, 000001, г. Астана, пр-т Кабанбай Батыра, 53
Введение
Растущая во всем мире распространенность ожирения во многом зависит от образа жизни, который характеризуется чрезмерным потреблением энергии, а также ее низким расходом. Ежегодно по меньшей мере 2,8 миллиона взрослых умирают по причине избыточного веса или ожирения. Кроме того, 44% случаев диабета, 23% случаев ишемической болезни сердца и от 7 до 41% случаев онкологических заболеваний обусловлены избыточным весом и ожирением [1]. Исследования показывают, что от 20% до 80% отклонений индекса массы тела (ИМТ) у населения объясняется генетическими особенностями, то есть наследственностью [2].
На сегодняшний день известно более 50 ло-кусов, связанных с различными показателями ожирения [3], в том числе ИМТ, соотношение объема талии к бедрам, процента жиров в организме, в том числе подкожного жира и висцерального жира. Эти ассоциации были впервые обнаружены у европейцев. В последнее время повышенный интерес вызывает вопрос, могут ли генетические вариации в генах, чувствительных к питанию, менять реакцию организма в зависимости от режима питания [4, 5]. Для оценки взаимодействия генетики и режима питания необходимы долгосрочные исследования. Первым этапом таких исследований является изучение частот встречаемости в популяции различных аллелей генов-кандидатов, ассоциированных с нарушением метаболизма и диетическими параметрами.
Ген ADRB2 (adrenoceptor beta 2) кодирует бета 2 адренергический рецептор, имеющий высокую степень сродства к адреналину и
обеспечивающий повышение или понижение активности иннервируемой ткани или органа. В геноме человека ген ADRB2 локализован на участке q31.32 хромосомы 5. Различные полиморфные формы, точечные мутации и/ или подавление этого гена связаны с предрасположенностью к метаболическому синдрому, ожирению, бронхиальной астме, в том числе ночной формы, риску развития сахарного диабета 2 типа (СД2) [6].
Ген ADRB3 (adrenoceptor beta 3) кодирует бе-та-3 адренорецепторы. В геноме человека ген ADRB3 локализован на участке 8p12. ADRB3 расположен, главным образом, в жировых клетках, а также в сосудах, в гладких мышцах пищеварительного тракта и скелетных мышцах. Реакции этих рецепторов стимулируют расщепление жиров и повышение температуры. Их действие основано на активации ката-болических процессов в клетках, при которых жирные кислоты активно используются для получения энергии [7].
Ген FABP2 (fatty-acid-bindingproteins) кодирует белок, связывающий и транспортирующий жирные кислоты в кишечнике. В геноме человека локализован на участке q28-q31 хромосомы 4. FABP2 обладает высоким сродством к насыщенным жирам и обеспечивает захват, внутриклеточный транспорт и метаболизм длинноцепочечных жирных кислот, действуя в основном в кишечнике [8].
Ген PPARG (peroxisome proliferator-activat-ed receptor gamma) кодирует белок-рецептор, активируемый пролифераторами пероксисом гамма. Ген локализован на хромосоме 3p25.2. Кодируемый ядерный рецептор регулирует экспрессию генов, участвующих в дифферен-
цировке клеток, в метаболизме мышечных тканей и определяющих обмен жиров и углеводов. Ген PPARG также влияет на потребность мышечной ткани в глюкозе и ее чувствительность к инсулину. Таким образом, ген PPARG вовлечен в патогенез многих заболеваний, включая ожирение, диабет, атеросклероз и рак [9].
Ген FTO (fat mass and obesity associated) кодирует ядерный белок, вовлеченный в энергетический обмен и влияющий на метаболизм в целом, однако точные физиологические функции этого гена полностью не изучены. Локализован на 16 хромосоме (16q12.2). Ген FTO экспрессируется в человеческих тканях, в частности, высокий уровень экспрессии наблюдается в мозге, особенно в гипоталамусе, ответственном за энергетический обмен. Уровень экспрессии гена FTO в аркообразном ядре регулируется посредством процессов, ответственных за чувства насыщения и голода.
Полиморфизмы этого гена связаны с накоплением жировой ткани. Многие исследования также показали ассоциацию полиморфизмов этого гена с ИМТ, с риском развития ожирения и сахарного диабета 2 типа [10].
Ген APOA2 (apolipoprotein A-II) кодирует аполипопротеин (апо-) A-II, который является второй наиболее распространенной белковой частицей липопротеинов высокой плотности. Ген локализован на хромосоме 1q23.3. Белок находится в плазме в качестве мономера, го-модимера, гетеродимера аполипопротеина D. Нарушения в этом гене могут привести к ги-перхолестеринемии [11].
Целью данного исследования является изучение частот встречаемости аллельных вариантов полиморфизмов генов ADRB2, FABP2, PPARG, FTO, ADRB3 и APOA2 среди коренного населения Казахстана.
Материалы и методы
В исследование был включен 501 условно здоровый человек казахской национальности. Информированное согласие было получено от всех участников исследования. Возраст участников колебался от 19 до 60 лет (32,28±9,76, n = 360). 83,3% участников были мужского пола, и остальные 16,2% были женского пола (n = 365).
ДНК из крови выделяли согласно классическому методу высаливания [12]. Качество геномной ДНК контролировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Количественный анализ ДНК проводили с использованием спектрофотометра NanoDrop ND 1000.
Генотипирование полиморфизмов (табл. 1) проводили с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием технологии TaqMan® OpenArray®. Амплификацию проводили на амплификаторе QuantStudio 12K Flex (Life technologies, USA). ПЦР-смеси имели следующий состав: OpenArray Genotyping Master Mix (2,5 мкл/образец) и образец ДНК 50 нг/ мкл (2,5 мкл/образец). Реакционный объем составлял 5 мкл. Каждая реакционная смесь была покрыта иммерсионным маслом. Температурный режим: 10 мин при 93 °С; циклирование: 45 с при 93 °С, 13 с при 94 °С, 2,14 мин при 53,5 °С - 50 циклов; инкубация при 25 °С 2 мин.
Таблица 1
Характеристика исследуемых полиморфизмов
SNP Название гена Хромосома Аллели (основной> минорный) Позиция в гене Изменение аминокислоты
rs1042713 ADRB2 (adrenoceptor beta 2) 5 G>A exon 1 Arg16Gly
rs1799883 FABP2 (fatty-acid-binding proteins) 4 C>T exon 2 Ala54Thr
rs1801282 PPARG (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 3 C>G exon 4 Pro12Ala
rs3751812 FTO (fat mass and obesity associated) 16 G>T intron
rs4994 ADRB3 (adrenoceptorbeta 3) 8 A>G exon 1 Trp64Arg
rs5082 APOA2 (apolipoprotein II) 1 A>G nearGene-5
Обработка данных проводилась с помощью программы TaqMan Genotyper Software v. 1.3.
Статистический анализ был проведен с использованием программы SPSSv.16.0. С помощью критерия х2 было определено соответствие частот встречаемости аллелей закону Харди-Вайнберга.
Результаты и обсуждение
Были получены частоты встречаемости аллелей и генотипов 6 SNP среди кореных жителей Казахстана. Распределение частот аллелей и генотипов приведено в табл. 2. Частоты аллелей (MAF - Minor Allele Frequency) у казахов были следующими: rs1042713 (G>A) 0,425; rs1799883 (C>T) 0,618; rs1801282 (C>G) 0,849; rs1801282 (C>G) 0,849; rs3751812 (G>T) 0,615; rs4994 (A>G) 0,834 (табл. 2).
Из изучаемых 6 SNP частоты встречаемости 5 SNP (rs1042713, rs1799883, rs1801282, rs3751812, rs4994) соответствовали равновесию Харди-Вайнберга (p > 0,0008, коррекция по Бонферрони) (табл. 2).
Полиморфизм rs1042713 находится в 1 экзоне гена ADRB2, и его GG генотип является несинонимичным генотипом, где происходит замена нуклеотида аденина на гуанин, приводящая к замене аминокислоты аргинина на глицин в белке (Arg16Gly). Среди населения Казахстана, по полученным данным, распределение генотипов GG, AG и AA составляет 0,299, 0,552 и 0,149 (n =
368), соответственно. ADRB2 участвует в регулировании энергетического баланса посредством стимуляции как термогенеза, так и мобилизации липидов в жировой ткани и катехоламин-индуцированного липолиза в мышечной ткани [13]. Многочисленные исследования выявили ассоциацию между полиморфизмом rs1042713 (Arg16Gly) и риском ожирения, а также с признаками, связанными с этим заболеванием [14, 15].
Полиморфизм rs1799883 находится во 2 экзоне гена FABP2, и замена гуанина на аденин в кодоне 54 приводит к замене аланина на треонин в белке (Ala54Thr). В исследуемой выборке данные по частотам встречаемости генотипов полиморфизма rs1799883 (G>A) выглядят следующим образом: 0,345 (СС), 0,546 (СТ) и 0,109 (ТТ). По литературным данным, треонин-содержащий белок обладает в 2 раза большей аффинностью к длинноцепочечным жирным кислотам, чем аланин-содержащий вариант [16]. Многие исследования выявили ассоциацию между этим полиморфизмом и риском развития сахарного диабета 2 типа. Мета-анализ группы ученых Qui et al. (2014) показал, что полиморфизм rs1799883 ассоциирован с риском развития сахарного диабета 2 типа в азиатских популяциях, однако в европейских популяциях эти данные не подтвердились [17]. Также при варианте А полиморфизма rs1799883 (FABP2) наблюдаются повышенные уровни холестерина и триглицеридов, а также инсулина и сахара в крови [16].
Таблица 2
Исследуемый полиморфизм Количество протипированных образцов Соответствие равновесию Харди-Вайнберга (p-value) Аллель (о сновной>минорный) Аллель 1 Аллель 2 Частота аллеля 1 Частота аллеля 2 Частота генотипа 1/1 Частота генотипа 1/2 Частота генотипа 2/2
rs1042713 368 0,014 G>A A G 0,425 0,575 0,149 0,552 0,299
rs1799883 313 0,005 G>A С T 0,618 0,382 0,345 0,546 0,109
rs1801282 407 0,152 C>G С G 0,849 0,151 0,730 0,238 0,032
rs3751812 368 0,003 G>T G T 0,615 0,385 0,415 0,401 0,184
rs4994 433 0,303 A>G A G 0,834 0,166 0,688 0,291 0,021
rs5082 383 0,000 A>G A G 0,462 0,538 0,010 0,903 0,086
Частота аллелей и распределение генотипов среди коренного населения Казастана
Полиморфизм ге1801282 находится в 4 эк-зоне гена PPARG, и в результате однонуклео-тидной замены цитозина на гуанин в 12 ко-доне происходит замена пролина на аланин (Рго12А1а) в белке. Согласно полученным результатам, распределение генотипов (СС, GС, GG) полиморфизма ге1801282 (C>G) в исследованной нами выборке было неравномерным: 0,730, 0,238 и 0,032, соответственно. Несколько исследований показали, что ге1801282 влияет на индивидуальную пользу от диеты с высоким содержанием мононенасыщенных жиров. У людей европейского происхождения, имеющих, по меньшей мере, одну копию аллеля G полиморфизма ге1801282, наблюдалось увеличенное потребление мононенасыщенных жиров, что было связано с сокращением индекса массы тела. Кроме того, диета с низким содержанием жира привела к увеличению окружности талии у носителей аллеля G, однако диета с высоким содержанием мононенасыщенных жиров имела протективный эффект у тех же носителей аллеля G [4]. Также исследования показали, что полиморфизм ^1801282 гена PPARG связан с риском развития сахарного диабета 2 типа [18].
Полиморфизм ге3751812 находится в не-кодирующей области гена FTO. Многие исследования показали ассоциацию этого полиморфизма с ИМТ и ожирением. При изучении групп с сахарным диабетом 2 типа минорный аллель Т был связан с СД2 [10]. В нашей выборке распределение генотипов GG, GT и ТТ выглядит следующим образом: 0,415, 0,401 и 0,184, соответственно.
Полиморфизм ге4994 находится в 1 экзоне гена ADRB3. Ген ADRB3 играет важную роль в регуляции величины жировой массы. Мутация в кодоне 64 приводит к замене триптофана на аргинин (Тгр64А^) в белке рецептора и ассоциируется с повышенной массой тела. Результаты показывают, что гомозиготный генотип АА (0,688) полиморфизма ге4994 является преобладающим в исследуемой группе. Частоты распределения генотипов AG и GG равны 0,291 и 0,021 соответственно (п = 433). Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о том, что ге4994 связан с увеличением массы тела, висцеральным ожирением, резистентностью к инсулину и развитием сахарного диабета 2 типа [19, 20].
Полиморфизм rs5082 находится в пределах 5' области гена APOA2. Распределение аллельных вариантов GG, AG и AA в исследуемом полиморфизме было неодинаково: 0,086, 0,903 и 0,010, соответственно (n = 383). Следует отметить, что распределение аллелей этого полиморфизма не соответствует равновесию Харди-Вайнберга, и в связи с этим необходимо увеличить исследуемую выборку. По литературным данным, исследуемый полиморфизм связан с увеличением индекса массы тела и потреблением пищи [21].
Заключение
В заключение необходимо отметить, что частоты встречаемости генов предрасположенности к развитию метаболических заболеваний хорошо изучены у европейцев, а у жителей Средней Азии они изучены слабо. Следует отметить, что частоты встречаемости аллельных вариантов гена могут зависеть от расовой и этнической принадлежности. Определение частот встречаемости аллелей генов-кандидатов позволило выбрать значимые для коренного населения Казахстана полиморфизмы для их дальнейшего "case-control" исследования. Таким образом, были определены частоты встречаемости минорных аллелей 6 полиморфизмов (rs1042713, rs1799883, rs1801282, rs3751812, rs4994, rs5082). Исследования в данном направлении продолжаются, проводится генотипирование данных полиморфизмов на большем количестве образцов.
Финансирование работы осуществлено в рамках проекта «Использование генетического тестирования для разработки антивозрастных программ» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан по бюджетной программе 055 «Научная и/или научно-техническая деятельность» подпрограмме 101 «Гранто-вое финансирование научных исследований», по договору № 152 от 14.02.2014.
Список использованных источников
1. Избыточная масса тела и ожирение в Казахстане [Электронный ресурс] / Zdrav.kz. Все оздоровье, лечении болезней и качественном долголетии. - Режим доступа: http://www.zdmv. kz/sites/default/files/медиа_рус.pdf .
2. Maes, H.H. Genetic and environmental factors in relative body weight and human adiposity / H.H. Maes, M.C. Neale, L.J. Eaves // Behavior genetics. - 1997. - № 27(4). - Р. 325-531.
3. Fall, T. Genome-wide association studies of obesity and metabolic syndrome / T. Fall, E. Ingelsson // Molecular and cellular endocrinology. - 2014. - № 382(1). - P. 740-757.
4. The Mediterranean diet protects against waist circumference enlargement in 12Ala carriers for the PPARgamma gene: 2 years' follow-up of 774 subjects at high cardiovascular risk / C. Razquin [et al.] // The British journal of nutrition. - 2009. - № 102(5). - Р. 672-679.
5. Genome-wide meta-analysis of observational studies shows common genetic variants associated with macronutrient intake / T. Tanaka [et al.] // The American journal of clinical nutrition. - 2013. -№ 97(6). - Р. 1395-1402.
6. Contopoulos-Ioannidis, D.G. Meta-ana-lysis of the association of beta 2 adrenergic receptor polymorphisms with asthma phenotypes / D.G. Contopoulos-Ioannidis, E.N. Manoli, J.P. Ioannidis // J Allergy Clin Immunol. -2005. - № 115(5). - Р. 963-972.
7. Physical activity and the association of common FTO gene variants with body mass index and obesity / E. Rampersaud [et al.] // Arch Intern Med.- 2008. - № 168(16). - Р. 1791-1797.
8. Inhibitory effect of a proline-to-alanine substitution at codon 12 of peroxisome prolife-rator-activated receptor-gamma 2 on thiazolidin-edione-induced adipogenesis / J. Masugi [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. - 2000. -№ 268(1). - Р. 178-182.
9. Ala12Ala genotype of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma-2 protects against atherosclerosis / T. Temelkova-Kurktschiev [et al.] // J. Clin. Endocr. Metab. -2004. - № 89. - Р. 4238-4242.
10. Ассоциация полиморфизма гена FTO с избыточной массой тела в российской популяции / Э.С. Насибулина [и др.] // Казанский медицинский журнал. - 2012.-№ 5(93). - С. 1-4.
11. Expression and purification of recombinant human apolipoprotein A-II in Pichia pastoris / M. Su [et al.] // Assay Drug DevTechnol. -2013. - № 11(8). - Р. 501-507.
12. Miller, S.A. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S.A. Miller, D.D. Dykes, H.F. Polesky // Nucleic Acids Research. - 1988. - № 16(3). - Р. 1215.
13. Jocken, J.W. Catecholamine-induced li-polysis in adipose tissue and skeletal muscle in obesity / J.W. Jocken, E.E. Blaak // Physiol Behav. - 2008. - № 94. - Р. 219-230.
14. Studies of the associations between functional beta2-adrenergic receptor variants and obesity, hypertension and type 2 diabetes in 7,808 white subjects / A.P. Gjesing [et al.] // Dia-betologia. - 2007. - № 50. - Р. 563-568.
15. Role of ß2-Adrenergic Receptor Polymorphisms on Body Weight and Body Composition Response to Energy Restriction in Obese Women: Preliminary Results / J.R. Ruiz [et al.] // Obesity. - 2011. - № 19. - Р. 212-215.
16. Association of the A/T54 polymorphism in the intestinal fatty acid binding protein with variations in plasma lipids in The Framingham Offspring Study / J.R. Galluzzi [et al.] // Atherosclerosis. - 2001. - № 159(2). - Р. 417-424.
17. Association between FABP2 Ala54Thr polymorphisms and type 2 diabetes mellitus risk: a HuGE Review and Meta-Analysis / С. Qiu [et al.] // Journal of Cellular and Molecular Medicine. - 2014. - № 18(12). - Р. 2530-2535.
18. Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls // Nature. - 2007. - № 447(7145). - Р. 661-678.
19. Influence of the Trp64Arg polymorphism in the beta 3 adrenoreceptor gene on insulin resistance, adipocytokine response, and weight loss secondary to lifestyle modification in obese patients / D. de Luis [et al.] // European J. of Internal Medicine. - 2007. - № 18. - Р. 587-592.
20. The Trp64Arg polymorphism of the beta 3 adrenergic receptor gene and obesity in Chinese subjects with components of the metabolic syndrome / G. Thomas [et al.] // Int. J.Obes. Relat. Metab. Disord. - 2000. - № 25. - Р. 545-551.
21. The -256T>C polymorphism in the apoli-poprotein A-II gene promoter is associated with body mass index and food intake in the genetics of lipid lowering drugs and diet network study / D. Corella [et al.] // Clin Chem. - 2007. -№ 53(6). - Р. 1144-1152.
Дата поступления статьи 4 июня 2015 г.
