CC BY
12УДК 577.21:616.72-002.77
Н.В. Савина1, Н.В. Никитченко1, Т.Д. Кужир1, Е.В. Сечко2, А.М. Чичко2, А.В. Сукало2,
Р.И. Гончарова1
ЧАСТОТЫ ГЕНОТИПОВ И АЛЛЕЛЕЙ ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНОВ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА PTPN22, TNFa И MIF У ДЕТСКОГО КОНТИНГЕНТА РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
1Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27; e-mail: N.Savina@igc.by 2УО «Белорусский государственный медицинский университет» Республика Беларусь, 220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, 83
Представлены результаты генотипирования образцов ДНК, полученных от 162-х лиц детского и подросткового возраста без аутоиммунных заболеваний по полиморфизму некоторых генов воспалительного ответа PTPN22 С1858Т, MIF -173G>C, TNFa -238G>A и -308G>A. Популяционные частоты генотипов / аллелей по указанным локусам в нашем исследовании полностью соответствуют характеру их распределения у европеоидного населения и могут быть использованы в качестве контрольных показателей при выявлении молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к развитию аутоиммунных заболеваний. Выявлены гендерные различия в распределении гетерозиготного генотипа С1858Т гена PTPN22 в группе детей и подростков без аутоиммунной патологии: частота встречаемости этого генотипа у девочек почти в 2 раза превышала его частоту у мальчиков (р = 0,053). Также показано, что среди мальчиков чаще встречаются носители комбинированного генотипа, сочетающего гомозиготные мажорные аллели трех изученных генов CCpTPN22-GGrwFa-GCMIF (42% против 28% у девочек, p = 0,07). Выявленные тенденции могут внести определенный вклад в понимание гендер-специфичности ряда аутоиммунных заболеваний.
Ключевые слова: аутоиммунные заболевания, гены воспалительного ответа, полиморфные локусы -308G>A, -238G>A гена TNFa, -173G>C гена MIF, С1858Т гена PTPN22.
Введение
Среди болезней человека насчитывают более 100 нозологических форм с аутоиммунным (им-муновоспалительным) патогенезом. Аутоиммунные заболевания (АИЗ) относятся к числу наиболее тяжелых болезней человека, их частота в популяции приближается к 10%. Проблема подобных заболеваний относительно молода -ее возраст около 50 лет, однако за этот срок она стала одной из самых сложных и актуальных для клинической медицины. Наиболее часто встречающимися среди АИЗ как взрослых, так и детей, являются аутоиммунные ревматические болезни, в первую очередь ревматоидный артрит (РА), ювенильные идиопатические артриты (ЮИА), спондилоартриты (СпА), системная красная волчанка (СКВ) и другие системные заболевания соединительной ткани [1].
Поскольку в основе патогенеза любого аутоиммунного заболевания лежат нарушения механизмов регуляции иммунной системы, то
гены, кодирующие ее основные звенья, рассматриваются как потенциальные гены-кандидаты предрасположенности к АИЗ. Среди генетических систем, вносящих свой вклад в развитие подобной патологии, около 40% приходится на комплекс генов главного комплекса гисто-совместимости / человеческого лейкоцитарного антигена (MHC, major histocompatibility complex /HLA, Human Leucocyte Antigen). В то же время в качестве генов-кандидатов предрасположенности к АИЗ изучаются более 100 "non-HLA''-генов [2].
Нами начато исследование молекулярно-генетических основ ряда аутоиммунных заболеваний на выборке белорусских пациентов. Цель работы на данном этапе - изучение распределения отдельных генотипов и аллелей генов воспалительного ответа TNFa (-308G>A и -238G>A), PTPN22 (С1858Т) и MIF (-173G>C) на представительной когорте практически здоровых лиц с целью опре-
деления популяционных частот указанных полиморфизмов для детского населения Республики Беларусь. Эти "поп-НЬД"-гены рассматриваются в числе наиболее значимых, предрасполагающих к развитию ряда АИЗ: сахарного диабета 1-го типа, ревматоидного артрита, ювенильного идиопатического артрита, системной красной волчанки, системной склеродермии и других [3]. Характеристика включенных в исследование генов
/ полиморфизмов и их функции кратко представлены в табл. 1.
В Беларуси подобные генетические исследования на выборках детей не проводились. В работах Беляевой Л.М. и соавт. методом им-муноферментного анализа продемонстрировано достоверное увеличение содержания продукта гена Т^а (фактора некроза опухолей, ФНО-а) в сыворотке крови у детей с ювениль-ным ревматоидным артритом (ЮРА) (р < 0,01);
Таблица 1
Характеристика исследуемых полиморфизмов
Ген, продукт, локализация Полиморфизм (идентификационный номер SNP в базе данных NCBI, rs) Функция кодируемых геном белков
PTPN22 протеин- тирозинфосфатаза нерецепторного типа, 22; protein tyrosine phosphatas, 22 1р13.м3-р13 1858 С>Т (Arg620Trp) (rs2476601) Замена цитозина на тимин в 620-м кодоне приводит к синтезу триптофана вместо аргинина в белке LYP, что в конечном итоге приводит к длительной активации Т-лимфоцитов. Специфическая лимфоидная тирозинфосфата-за LYP (Lymphoid protein tyrosine phosphatase) выполняет роль ингибитора активации и пролиферации Т-лимфоцитов, участвует в клеточной дифференцировке иммунокомпе-тентных клеток. Продуцируется в основном лимфоидной тканью (в Т- и В-лимфоцитах, моноцитах, нейтрофилах, дендритных клетках и естественных клетках-киллерах или NK-клетках) [4, 5].
TNFa ФНО - фактор некроза опухолей-а, tumor necrosis factor 6q21.33 -238 G>A (rs361525) -308 G>A (rs1800629) Замены гуанина на аденин в положениях промотора -238 и -308 приводят к изменению скорости транскрипции белка (к снижению экспрессии в случае замены в положении -238 и к повышению при замене в положении -308), вызывая тем самым изменение уровня продукции TNF-a (снижение и, соответственно, увеличение). Цитокин с провоспалительной активностью, играет ключевую роль в развитии воспалительного ответа: инициирует синтез интерлейкинов, гамма-интерферона, активирует макрофаги, стимулирует пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, тем самым запуская каскад воспалительных реакций. Вовлечен в регуляцию широкого спектра биологических процессов, включая клеточную диффе-ренцировку и пролиферацию, апоптоз, липидный метаболизм. Синтезируется в основном моноцитами и макрофагами, NK-клетками, нейтрофилами, кератино-цитами и астроцитами, а также рядом опухолевых клеточных линий [6, 7].
MIF MIF - фактор подавления миграции макрофагов, macrophage inhibitory factor 22q11.23 -173 G>C (rs755622) in vitro и in vivo доказано, что аллель -173C способствует увеличенной экспрессии гена MIF и повышенному уровню белка Является регулятором врожденных и адаптивных иммунных реакций и функционирует как ключевой фактор «естественной устойчивости» клетки и организма. Основные и наиболее известные функции MIF как цитокина - это способность подавлять миграцию макрофагов и активировать их in vitro, способствовать формированию воспалительного очага с повышенной концентрацией макрофагов in vivo. В отличие от индуцибельного типа экспрессии, характерного для большинства цитокинов, MIF конститутивно образуется в ряде клеток организма, прежде всего в лимфоцитах, макрофагах, а также в эндотелиальных и эпителиальных клетках, гепатоцитах и нейронах [8, 9].
в работе Аксеновой Е.А. с соавт. (2010) дана оценка встречаемости частот генотипов / аллелей полиморфизма С1858Т гена PTPN22 у взрослых этнических белорусов [10]. Наше исследование проведено на когорте детского населения г. Минска. Поскольку городское население городов-гигантов (Москва, Харьков, Минск и др.) представляет собой популяцию смешанного происхождения относительно генетических аспектов [11], то полученные в ходе работы данные распределения генотипов / аллелей указанных полиморфных ло-кусов генов воспалительного ответа TNFa, PTPN22 и MIF характеризуют популяцион-ные частоты изученных SNPs у детского населения Республики Беларусь. Эти значения будут использованы в качестве контрольных показателей при оценке их значимости в качестве молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к развитию отдельных аутоиммунных заболеваний у детей и подростков.
Материалы и методы
Биологический материал
Работа по сбору биологического материала проведена сотрудниками 1-ой кафедры детских болезней на базе кардиологического отделения УЗ «2-я городская детская клиническая больница г. Минска» в соответствии с законодательством Республики Беларусь и международными нормами, закрепленными в Хельсинской декларации [12].
Объект исследования — геномная ДНК, выделенная из образцов крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции [13].
Метод исследования
Для определения аллельных вариантов генов TNFa -308G>A (rs1800629) и -238G>A (rs361525), PTPN22 С1858Т (rs2476601),MIF -173G>C (rs755622) использован стандартный метод ПЦР-ПДРФ (полимеразной цепной реакции с последующим рестрикцион-ным анализом образующихся фрагментов) с разделением фрагментов либо в 2%-ном ага-розном геле для SNPs PTPN22 С1858Т иMIF -173G>C, либо в 8%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в случае исследования локусов гена TNFa.
Праймеры, условия проведения ПЦР, ре-стриктазы и продукты рестрикции, соответствующие гомозиготному / гетерозиготному состоянию полиморфных вариантов изученных генов в сравнении с диким типом, описаны ранее [14-17] и адаптированы к конкретным условиям.
Статистическая обработка
Для статистической обработки данных использован пакет стандартных программ Excel 2000. Данные по распределению частот генотипов в изученных выборках проверены на соответствие закону Харди-Вайнберга. Для выявления различий между частотами генотипов / аллелей в различных группах использовали критерий х2 или точный тест Фишера.
Результаты и обсуждение
В рамках данной работы нами обследована выборка из 162 человек детского и подросткового возраста. В нее вошли пациенты 2-ой ГКДБ г. Минска, имеющие в 82% случаев (73% мальчиков и 96% девочек) диагноз «вегетативная дисфункция» (нейроциркуляторная, вегетососудистая дистония). Вегетативная дисфункция - довольно распространенное состояние, характерное для любого возраста; но наиболее часто диагностируется у школьников [18]. У остальных 18% обследованных лиц отмечены изменения: 1) со стороны сердечнососудистой системы (малые аномалии развития сердца у детей; пролапс митрального клапана, дополнительная хорда левого желудочка); 2) варикоцеле у мальчиков и некоторые другие заболевания, не имеющие отношения к аутоиммунным и воспалительным. Половозрастная характеристика этой группы представлена в табл. 2.
Как видно из таблицы, соотношение по полу (ж / м) в обследованной группе составляет 41% / 59%; средний возраст - 14,02 ± 2,68 лет без существенных различий по возрасту между мальчиками и девочками.
Популяционные частоты полиморфных вариантов PTPN22 С1858Т, MIF-173G>C, TNFa -238G>A и -308G>A
Для всей группы выполнено генотипирование по полиморфным локусам генов TNFa (-238G>A, -308G>A), PTPN22 С1858Т и MIF -173G>C.
Результаты, представляющие в данном случае популяционные частоты аллельных вариантов изученных генов у детского населения Беларуси, приведены в табл. 3. Отклонения частот генотипов изученных полиморфизмов от равновесия Харди-Вайнберга ни в одном случае не выявлено: по локусу С1858Т PTPN22 p = 0,55; по локусу -173G>C MIF p = 0,328; для гена TNFa -308G>A и -238G>Ap = 0,31 и 0,59, соответственно.
При анализе частот генотипов / аллелей -23 8А гена TNFa обращает на себя внимание низкая частота полиморфного (низкопродуктивного) аллеля -238А в общей когорте белорусских детей (4,1%) и, соответственно, низкая частота его гетерозиготного носи-тельства (8,1%). По данным National Center for Biotechnology Information (NCBI), частота этого аллеля в исследованиях европейских авторов действительно невысокая - в среднем 7,7% (для европеоидов - в диапазоне 3,3-10,9%), частота гетерозигот - в среднем 15% (значения для европеоидов в разных исследованиях составляют 7, 13, 15, 19, 21
*m - среднее значение; **SD - стандартное отклонение.
и 29%) [19]. Для нашей выборки характерно преобладание носителей дикого гомозиготного генотипа -238GG - почти 92%. Гомозиготный мутантный генотип -238АА нами не выявлен вовсе.
Частота мутантного аллеля -308А гена TNFa в различных популяциях варьирует от 3 до 27%: для азиатов она находится в пределах от 3 до 11%, для представителей Африки - от 6 до 20%, для афроамериканцев - 12-21% и достигает 24% для жителей Австралии [20].
Что касается полиморфизма MIF -173G>C, то, в соответствии с опубликованными данными, частоты минорного аллеля -173C варьируют в пределах 10-20% для стран Европы [21], для метисов Южной Америки характерны значения 25-26% [22]. Для азиатской популяции данные весьма неоднозначны: для японцев - 19-22% [20], для китайцев - от 11% [17] до 28% [23]. Частоты генотипов и аллелей в локусах TNFa -308G>A и MIF -173G>C, характерные для европейских популяций, представлены в табл. 4.
Таблица 2
Половозрастная характеристика группы контроля
Исследуемые параметры Контроль(n = 162)
Соотношение по полу, % (девочки / мальчики) 41 / 59
Средний возраст, лет (m* ± SD**) Выборка 14,02 ± 2,68
Девочки 13,72 ± 3,13
Мальчики 14,24 ± 2,29
Полиморфизм Частота генотипов/аллелей
Гетерозигота/% Гомозигота по полиморфному аллелю / % Мутантный аллель / %
TNFa-238G>A GA / 8,1 AA / 0 A / 4,1
TNFa -308G>A GA / 21,0 АА / 0 А / 10,5
MIF -173G>C GC / 27,3 CC / 4,4 C / 18,0
PTPN22 C1858T CT / 21,0 TT / 2,5 Т / 13,0
Таблица 3
Популяционные частоты аллельных вариантов генов воспалительного ответа PTPN22, TNFа
и ЫШ у детского населения Беларуси
Таблица 4
Частоты генотипов и аллелей генов Т^а -308G>A и МШ -173G>C в европеоидных
популяциях
Страна Расово-этническая принадлежность AA / Aa / aa, n (%) * MAF** Ссылка
TNFa -308G>A
Турция Европеоиды 26(60) /14(33) / 3(7) 23 [24]
Сербия Европеоиды 37(57) / 22(34) / 6(9) 26 [25]
Германия Европеоиды 51(63) / 28(35) / 2(2) 21 [26]
Германия Европеоиды 132(67) /61(31) / 3(2) 16 [27]
Португалия Европеоиды 91(78) / 26(22) / 0 13 [28]
Италия Европеоиды 109 (79) / 29(21) / 0 11 [29]
Чехия Европеоиды 121(81) / 29(19) / 0 11 [30]
Россия Европеоиды 134(71) / 48(25) / 7(4) 16 [31]
Россия Европеоиды 220(73) / 78(26) / 3(1) 14 [32]
Беларусь Европеоиды (возраст 14,02 ± 2,68 лет) 128 (79)/ 34 (21)/ 0 10 Данное исследование
MIF-173G>C
Германия Европеоиды 108 (68)/ 45 (28)/ 6(4) 18 [33]
Германия Европеоиды 318 (65)/ 156 (32)/ 15(3) 19 [34]
Испания Европеоиды 406 (77)/ 107 (20)/ 13(2) 13 [35]
Италия Европеоиды 278 (78)/ 75 (21)/ 29 (1) 11 [36]
Польша Европеоиды 99 (80)/ 23(19)/ 1(1) 10 [37]
Беларусь Европеоиды (возраст 14,02 ± 2,68 лет) 111 (69) /44 (27) / 7(4) 18 Данное исследование
*AA - гомозигота дикого типа, Aa - гетерозигота, aa - мутантная гомозигота; **MAF (minor allele frequency) - частота минорного аллеля, %
Как видно из таблицы, частоты встречаемости нормального (-308G) и мутантного (-308А) аллелей гена TNFа у европейцев находятся в пределах от 11 до 26% для мутантного аллеля А, и соответственно, от 74 до 89% для аллеля G; частота встречаемости гетерозигот -308GA - от 21 до 35%. Полученные нами результаты не отличаются от представленных: генотип TNFа -308GG определялся с частотой 79%, гетерозиготный генотип - 21%; а частоты встречаемости аллелей -308G и -308А составляли 90 и 10%, соответственно.
Для локуса МШ -173G>C частоты гетерозиготного генотипа варьируют от 19% в работе польских авторов [37] до 28-32% в исследованиях из Германии [33, 34]. У обследован-
ных белорусских детей как частота гетерозиготного носительства -173GС МШ (27%), так и частота минорного аллеля -173С МШ (4%) выше значений, установленных для близких по этническому происхождению восточных славян Польши [37], однако наши данные не отличаются от частот, известных для ряда европейских стран.
Частота встречаемости минорного аллеля 1858Т гена РТРШ2 существенно зависит от этнической принадлежности обследуемых лиц. Даже в пределах одной этнической группы частота генотипов/аллелей может варьировать. Так, в работе Аксеновой Е.А. с соавт. (2010) на выборке этнических белорусов (740 человек) показано, что частота гомозигот по
этому аллелю 1858ТТ для общей выборки равна 4,1%, тогда как с учетом регионов проживания она колеблется в пределах от 2,1% до 6,5% [10]. Частота гетерозигот РТРШ2 1858СТ в исследовании этих же авторов в общей выборке составляла 26,1%, а с учетом региона проживания варьировала от 20,6 до 32,5%. Частота рискового аллеля 1858Т находилась в диапазоне 12,6-20,2% [10]. В работе российских исследователей О.Н. Ивановой и др. (2013) показано, что для представителей московской популяции частота аллеля 1858Т достигает 13% [38]. В работе Гусевой И.А. и соавт. (2016) частота аллеля 1858Т в русской популяции г. Москвы и области (314 чел.) составляла 12%, гетерозиготного генотипа СТ - 20% [39]. Таким образом, установленные нами частоты генотипов/аллелей С1858Т гена PTPN22 у детского и подросткового контингента соответствуют данным для взрослого населения Беларуси и результатам, полученным другими авторами для популяций восточных славян.
Результаты генотипирования ДНК детей и подростков по изученным полиморфным локу-сам в зависимости от пола
Аутоиммунные болезни затрагивают до 10% населения в мире и среди пациентов до 80% -женщины. Механизмы подобного диморфизма не совсем понятны. Для аутоиммунных болезней взрослых одной из причин преобладания женщин среди пациентов с АИЗ является очевидное физиологическое различие уровней
половых гормонов, чье влияние на иммунную систему доказано [40]. Некоторые детские аутоиммунные болезни также проявляют заметную зависимость от пола. Так, ЮИА по олиго-артритному типу преимущественно возникает у девочек, при этом задолго до начала половой зрелости, когда уровни андрогена и эстрогена у обоих полов одинаково низкие. Ювенильная системная склеродермия (Juvenile systemic sclerosis) развивается у девочек/мальчиков в соотношении 3,6:1, миастенический бульбарный паралич (Myasthenia gravis) в постпубертатном периоде - в соотношении 4,5:1, системная красная волчанка (Juvenile systemic lupus erythematosus) с дебютом в возрасте старше 10 лет в 4 раза чаще наблюдается у девочек. В то же время анкилозирующий спондилоартрит (Ankylosing spondylitis) и эозинофильный эзо-фагит (Eosinophilic esophagitis) в 3 раза чаще развиваются у мальчиков. Поэтому объективные причины и механизмы, лежащие в основе развития педиатрических аутоиммунных заболеваний, скорее всего, лежат за пределами различий в уровнях половых гормонов [41].
Поскольку многие аутоиммунные заболевания, включая ЮИА, проявляют гендерную специфичность (или своеобразный половой диморфизм) и в большей степени присущи девочкам, нам представлялось интересным проанализировать частоты встречаемости генотипов и аллелей трех изученных полиморфных локусов в соответствии с распределением обследуемых лиц по полу (табл. 5).
Таблица 5
Результаты генотипирования ДНК по изученным локусам в зависимости от пола
Полиморфизм Генотип Девочки Мальчики
n Частота, % n Частота, %
С1858Т (ген PTPN22) СС 47 70 77 81
СТ 19 28 15 16
ТТ 1 2 3 3
Аллель C 113 84 169 89
Аллель Т 21 16 21 11
-308 G>A (ген TNFa) GG 53 78 76 80
GA 15 22 19 20
Аллель G 121 89 171 90
Аллель А 15 11 19 10
Продолжение табл. 5
Полиморфизм Генотип Девочки Мальчики
п Частота, % п Частота, %
-1730>С (ген М1Щ) 00 40 65 66 70
0С 18 29 26 27
СС 4 6 3 3
Аллель 0 98 79 158 83
Аллель С 26 21 32 17
В нашем исследовании участвовало 41% девочек и 59% мальчиков. Напомним, что существенных гендерных различий по возрасту в группе нет (табл. 1). При сравнении результатов геноти-пирования по полу не обнаружено существенных различий между частотами генотипов/аллелей трех изученных полиморфных локусов, за исключением частоты встречаемости гетерозигот С1858Т РТРИ22, которая у девочек (28%) оказалась выше, чем у мальчиков (16%) (р = 0,053).
Таким образом, выявлена четкая тенденция к увеличению гетерозиготного носительства С1858Т гена РТРИ22 среди девочек без аутоиммунной патологии по сравнению с мальчиками, что указывает на гендер-специфическое распределение данного гетерозиготного генотипа в исследуемой группе детского и подросткового населения Беларуси, которое, однако, нуждается в подтверждении на расширенной выборке.
Сравнение частот встречаемости комбинированных генотипов изученных полиморфизмов в обследуемой группе
Основная часть обследованной группы представлена гомозиготными носителями мажорных аллелей трех изученных генов: 77% имеют генотип РТРИ22 С1858С, 79% - генотип ТШа -30800 и 68% - генотип МШ -17300. Гомозиготные генотипы по минорным рисковым аллелям РТРИ22 1858ТТ и МШ -17300 в общей выборке выявлены соответственно в 2-х и 4-х% случаев, тогда как гомозиготный генотип ТИГа -308АА не определялся вообще. На примере исследованной выборки показано, что минорные аллели генов РТРИ22 1858Т, М1Г -173С и -308А встречаются у детского населения Беларуси с частотой 13%, 18% и 11%, а гетерозиготное носительство указанных аллелей зарегистрировано в 21, 27 и 21% случаев соответственно. Именно наличие минорных аллелей этих генов воспалительного ответа связывают с риском развития аутоиммунных заболеваний.
Для всей выборки детей и подростков также установлены частоты комбинированных полиморфных генотипов / аллелей трех изученных генов и проведено сравнение их встречаемости в зависимости от пола (рис. 1).
Рис. 1. Распределение комбинированных генотипов изученных полиморфных локусов в исследованных выборках * - генотипы указаны в порядке следования полиморфных локусов генов РТРИ22 1858, -ТЫЩа 308, -М1Г 173; ** - генотипы ТТ-00-СС, ТТ-00-00, СТ-0А-0С, СТ-0А-00, СТ-00-0С, СТ-00-СС, СС-00-СС, СС-0А-0С
Среди обследованных лиц 36% (59 человек) имели генотип, сочетающий гомозиготные мажорные аллели трех генов CСPTPN22-GGmp-GGMIF, который определялся чаще всего и в подгруппах девочек / мальчиков (28% / 42%). Несмотря на заметное преобладание мальчиков с подобным генотипом, частоты комбинаций между группами достоверно не различались (р = 0,073).
Комбинированный генотип CСpтш22-GGmFa-GСMIF встречался у 20% детей независимо от пола. Отсутствие различий между полами наблюдалось также и при анализе распределения комбинированных генотипов ССр 22-ОАТЪ№,-
^МШ и СТРТРМ22^^а-^МШ: част°™ их
встречаемости (от 11 до 17%) одинаковы как в общей группе, так и в подгруппах девочек / мальчиков. В группу «другие» включены 8 комбинированных генотипов, частота встречаемости которых незначительна - во всей выборке они выявлены у одного-двух, максимум у пяти-шести человек. Как видно из рисунка, в таких генотипах присутствуют минорные аллели по изученным локусам, что и обуславливает их «редкость» у практически здоровых лиц.
Таким образом, данные, полученные нами на выборке детей и подростков, показывают, что среди мальчиков чаще встречаются носители комбинированного генотипа, сочетающего гомозиготные мажорные аллели трех изученных генов воспалительного ответа: ССртт22-
Заключение
В качестве популяционного контроля обследована выборка детского контингента Республики Беларусь без аутоиммунных заболеваний, состоящая из 162 человек, среди которых девочки составляли 41% и мальчики - 59%. Средний возраст обследованных составил 14,02 ± 2,68 лет без существенных различий между мальчиками и девочками.
Определены популяционные частоты генотипов/аллелей по локусам С1858Т PTPN22, -173G>C МШ, -238G>A и -308G>A ТШа, контролирующим воспалительный ответ. Полученные значения полностью соответствуют характеру их распределения у европеоидного населения. Основная часть обследованной группы в нашей работе представлена гомози-
готными носителями мажорных аллелей трех изученных генов: 77% имеют генотип PTPN22 С1858С, 79% - генотип TNFa -308GG и 68% -генотип MIF -173GG. Выявлены гендерные различия в распределении гетерозиготного генотипа С1858Т гена PTPN22 в группе детей и подростков без аутоиммунной патологии: частота встречаемости этого генотипа у девочек почти в 2 раза превышала его частоту у мальчиков (р = 0,053). Также показано, что среди мальчиков чаще встречаются носители комбинированного генотипа, сочетающего гомозиготные мажорные аллели трех изученных генов СС -GG^^-ССМ1Ш (42% против 28% у девочек, p = 0,073"). Выявленные тенденции нуждаются в дальнейшем изучении, так как могут внести определенный вклад в понимание гендер-специфичности ряда аутоиммунных заболеваний.
Выполненное исследование имеет самостоятельную значимость, поскольку характеризует частоты аллельных вариантов генов воспалительного ответа TNFa, PTPN22 и MIF, а также некоторые особенности распределения отдельных генотипов с учетом гендерных различий у детей из белорусской популяции. Кроме того, полученные результаты будут использованы в качестве контрольных показателей при выявлении молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к развитию аутоиммунных заболеваний, представляющих одну из актуальнейших проблем педиатрии в связи с их высокой распространенностью, трудностями ранней диагностики, быстрой инвалидизацией и существенным снижением качества жизни пациентов.
Список использованных источников
1. Насонов, Е.Л. Достижения ревматологии в XXI в. / Е.Л. Насонов // Научно-практическая ревматология. - 2014. - Т. 52, № 2. - С. 133-140. DOI: http://dx.doi.org/ 10.14412/1995-4484-2014-133-140.
2. Hersh, A.O. Immunogenetics of juvenile idiopathic arthritis: A comprehensive review / A.O. Hersh, S. Prahalad // Journal of Autoimmunity. - 2015. - http://dx.doi.org/10.1016/j. jaut.2015.08.002.
3. PTPN22 Genetic Variation: Evidence for Multiple Variants Associated with Rheumatoid Arthritis / V.E.H. Carlton [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 2005. - Vol. 77. - P. 567-581. - doi: 10.1086/468189.
4. A functional variant of lymphoid tyrosine phosphatase is associated with type I diabetes / N. Bottini [et al.] // Nature Genetics. - 2004. -Vol. 36. - P. 337-338. - doi:10.1038/ng1323.
5. The tyrosine phosphatase PTPN22 discriminates weak self peptides from strong agonist TCR signals / R.J. Salmond [et al.] // Nat. Immunol. - 2014. - N 15. - P. 875-883.
6. Investigation of promoter polymorphisms in the tumor necrosis factor-alpha and inter-leukin-10 genes in liver transplantant petients / H. Fernandes [et al.] // Transplantation. - 2002. -Vol. 73. - P. 1886-1891.
7. Qidwai, T. Tumour necrosis factor gene polymorphism and disease prevalence / T. Qid-wai, F. Khan // Scandinavian Journal of Immunology. - 2011. - Vol. 74. - P. 522-547.
8. Mutation screening of the macrophage migration inhibitory factor gene: positive association of a functional polymorphism of macrophage migration inhibitory factor with juvenile idiopathic arthritis / R. Donn [et al.] // Arthritis Rheum. - 2002. - Vol. 46. - P. 2402-2409.
9. Суслов, А.П. Фундаментальная иммунобиология провоспалительных цитокинов и MIF / А.П. Суслов, М.В. Коноплева, О.Ю. Третьяков // Медицинская Иммунология. -2006. - Т. 8, № 1. - С. 5-22.
10. Частоты аллелей риска некоторых генов, контролирующих развитие аутоиммунных патологий, в белорусской популяции / Е.А. Аксенова [и др.] // Экологическая генетика человека. - 2010. -Т. VIII, № 1. - С. 50-58.
11. Особенности генетико-демографичес-ких процессов в населении трех мегаполисов в связи с проблемой создания генетических баз данных / О.Л. Курбатова [и др.] // Генетика. - 2013. - Т. 49, № 1. - С. 513-522.
12. Declaration of Helsinki (Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects) [Electronic resource] // World Medical Association. - 59th WMA General Assembly, Seoul, October 2008 - Mode of access: http:// www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/ index.html.
13. Sambrook, J. Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells / J. Sam-brook, E.F. Fritsch, T. Maniatis // Molecular Cloning: A Laboratory Manual. - 2nd ed. - Pla-inview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - P. 9.14-9.23.
14. Single base polymorphism in the human tumour necrosis factor alpha (TNF alpha) gene detectable by NcoI restriction of PCR product / A G. Wilson [et al.] // Hum. Mol. Genet. -1992. - Vol. 1, № 5. - P. 353.
15. Association of-238G/A and -857C/T Polymorphisms of Tumor Necrosis Factor-Alpha Gene Promoter Region With Outcomes of Hepatitis B Virus Infection / H-Q. Li [et al.]. // Biomedical and environmental sciences. - 2006. -Vol. 19. - P. 133-136.
16. Zheng, W. Genetic Association Between a Lymphoid Tyrosine Phosphatase (PTPN22) and Type 1 Diabetes / W. Zheng, J-X. She // Diabetes. - 2005. -Vol. 54. - P. 906-908.
17. A genetic role for macrophage migration inhibitory factor (MIF) in adult-onset Still's disease / F.-F. Wang [et al.] // Arthritis Research & Therapy. - 2013. - Vol. 15, R65. - P. 2-8. -doi:10.1186/ar4239.
18. Заваденко, Н.Н. Клинические проявления и лечение синдрома вегетативной дисфункции у детей и подростков / Н.Н. Заваденко, Ю.Е. Нестеровский // Педиатрия. - 2012. -Т. 91, № 2.
19. The Single Nucleotide Polymorphism database (dbSNP), TNF-a at -238 (rs361525). (Homo sapiens). [Electronic resource] / National Center for Biotechnology Information. -Bethesda M.D., USA. - Mode of access: https:// www. ncbi.nlm.nih. gov/proj ects/SNP/snp_ref. cgi?rs=361525.
20. Meta-analysis of TNF 308 G/A polymorphism and type 2 diabetes mellitus / R.N. Feng [et al.] // PLoS One. - 2011. - e18480. doi: 10.1371/journal.pone.0018480.
21. The -173 G/C Polymorphism of the MIF Gene and Inflammatory Bowel Disease Risk: A Meta-Analysis / Y. Shen [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - Vol. 14. - P. 11 392-11 401. -doi:10.3390/ijms140611392.
22. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promoter polymorphisms (-794 CATT and -173 G>C): association with MIF and TNFa in psoriatic arthritis / R. Morales-Zambrano [et al.] // Int. J. Clin. Exp. Med. - 2014. - Vol. 7, № 9. - P. 2605-2614.
23. Macrophage migration inhibitory factor gene -173G>C polymorphism and risk of bladder cancer in southeast China: a case-control analysis / Q. Yuan [et al.] // Mol. Biol. Rep. -
2012. - Vol. 39. - P. 3109-3115. - doi 10.1007/ s11033-011-1075-9.
24. Tumor necrosis factor-alpha gene promoter polymorphism in patients with familial Mediterranean fever / A. Celebi Kobak [et al.] // Clin Rheumatol. - 2007. - Vol. 26. - P. 908-910.
25. Etanercept reduces matrix metalloprotein-ase-9 level in children with polyarticular juvenile idiopathic arthritis and TNF-alpha-308GG genotype / J. Basic [et al.] // J. Physiol. Biochem. -2010. - Vol 66. - P. 173-180. - doi: 10.1007/ s13105-010-0022-x.
26. Rapid genotyping for tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha)-863C/A promoter polymorphism that determines TNF-alpha response / M. Heesen [et al.] // Clin. Chem. - 2004. -Vol. 50. - P. 226-228.
27. Tumor necrosis factor alpha promoter polymorphisms in patients with juvenile idio-pathicarthritis / H. Schmeling [et al.] // Clin. Exp. Rheumatol. - 2006. - Vol. 24. - P. 103-108.
28. Tumor necrosis factor-alpha -308 genotypes influence inflammatory activity and TNF-alpha serum concentrations in children with juvenile idiopathic arthritis / A.F. Mourao [et al.] // J. Rheumatol. - 2009. - Vol. 36. -P. 837-842.
29. Association between -G308A tumor necrosis factor alpha gene polymorphism and schizophrenia / F. Boin [et al.] // Molecular Psychiatry. - 2001. - Vol. 6. - P. 79-82.
30. Polymorphism in the tumor necrosis factor-alpha gene promoter is associated with severity of rheumatoid arthritis in the Czech population / P. Nemec [et al.] // Clin. Rheumatol. - 2008. -Vol. 27. - P. 59-65.
31. Роль полиморфизма в промоторной области гена TNF в развитии хронической обструктивной болезни легких / Г.Н. Сеитова [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. -2004. - С. 29-34.
32. Ассоциативная взаимосвязь генетических маркеров с эффективностью лечения ревматоидного артрита тоцилизумабом / И.А. Гусева [и др.] // Научно-практическая ревматология. - 2013. - Т. 51, № 4. - Р. 377-382.
33. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) -173G/C promoter polymorphism influences upper gastrointestinal tract involvement and disease activity in patients with Crohn's disease / J. Dambacher [et al.] // Inflamm. Bowel. Dis. - 2007. - Vol. 13. - P. 71-82.
34. A polymorphism in the macrophage migration inhibitory factor gene is involved in the genetic predisposition of Crohn's disease and associated with cumulative steroid doses / T. Gri-ga [et al.] // Hepatogastroenterology. - 2007. -Vol. 54. - P. 784-786.
35. Association of the macrophage migration inhibitory factor gene polymorphisms with inflammatory bowel disease / J. Oliver [et al.] // Gut. - 2007. - Vol. 56. - P. 150-151.
36. Association of the macrophage migration inhibitory factor -173*C allele with childhood nephrotic syndrome / A. Berdeli [et al.] // Pedi-atr. Nephrol. - 2008. - Vol. 23. - P. 743-748. -doi 10.1007/s00467-007-0729-2.
37. Contribution of the -173 G/C polymorphism of macrophage migration inhibitory factor gene to the risk of inflammatory bowel diseases / K. Przybylowska [et al.] // Pol. Przegl. Chir. -2011. - Vol. 83. - P. 76-80.
38. Ассоциация полиморфизма гена PTPN22 с сахарным диабетом 1 типа в различных популяциях РФ / О.Н. Иванова [и др.] // Сахарный диабет (Diabetes melli-tus). - 2013. - № 2 (59). - С. 4-10.
39. Исследование полиморфизмов генов-кандидатов иммунного ответа как маркеров риска развития ревматоидного артрита и продукции аутоантител / И.А. Гусева [и др.] // Научно-практическая ревматология. - 2016. -Т. 54, № 1. - С. 21-30.
40. Whitacre, C.C. Sex differences in autoimmune disease. -onset juvenile idiopathic arthritis / C.C. Whitacre // Nat. Immunol. - 2001. -Vol. 2, № 9. - P. 777-780.
41. Chiaroni-Clarke, R.C. Sex bias in paedi-atric autoimmune disease - Not just about sex hormones? / R.C. Chiaroni-Clarke, J.E. Munro, J.A. Ellis // J. Autoimmun. - 2016. - Vol. 69. -P. 12-23. - doi: 10.1016/j.jaut.2016.02.011.
N.V. Savina1, N.V. Nikitchenko1, T.D. Kuzhir1, E.V. Sechko2, A.M. Chichko2, A.V. Sukalo2, RI. Goncharova1
FREQUENCIES OF GENOTYPES AND ALLELES OF POLYMORPHIC LOCI OF INFLAMMATORY RESPONSE GENES PTPN22, TNFa AND MIF IN CHILDREN AND ADOLESCENTS IN THE REPUBLIC OF BELARUS
institute of Genetics and Cytology, NAS of Belarus Minsk BY-220072, the Republic of Belarus 2Belarusian State Medical University Dzerzhinski Ave., 83, Minsk, the Republic of Belarus, 220116
PTPN22 C1858T, MIF -173G>C, TNFa -238G>A and -308G>A loci associated with the inflammatory response were identified in 162 individuals (children and adolescents) from the Belarusian population. In our study, frequencies of genotypes/alleles in these loci were similar to those in other Caucasian populations and can be used as control indices when revealing genetic markers of predisposition to some autoimmune diseases. Gender specific differences were found in the distribution of heterozygous PTPN22 C1858T genotype in a group of children and adolescents with no autoimmune and inflammatory pathology: namely, the frequency of this genotype in females exceeded almost twice that in males (p = 0.053). Besides, carriers of the complex genotype, combining major alleles of the genes studied (CCPTPN22-GGTNFa-GCMIF), occurred more often among males than females (42% vs. 28% respectively, p = 0.07). These trends confirmed in larger samples could contribute to the comprehension of gender specificity of a set of autoimmune diseases.
Key words: autoimmune diseases, genes of the inflammatory response, polymorphic loci TNFa 308G>A and -238G>A, MIF-173G>C and PTPN22 C1858T
Дата поступления статьи 10января 2017 г.
