CC BY
71
УДК 57 DOI 10.14526/25_2015_25
ББК 28.4
ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ ПРИ СОКУЛЬТИВИРОВАНИИ ESCHERICHIA COLI С ПРОСТЕЙШИМИ
BLASTOCYSTIS HOMINIS
Е. А. Карпеева - кандидат биологических наук, доцент Н. А. Ильина - доктор биологических наук, профессор Ю.Ю. Красноперова - доктор биологических наук, доцент Ульяновский государственный педагогический университет
имени И.Н. Ульянова, Ульяновск
FREQUENCY OF OCCURRENCE OF PATHOGENICITY GENES IN CASE
OF COCULTURE OF ESCHERICHIA COLI WITH PROTOZOANS
BLASTOCYSTIS HOMINIS
E.A. Karpeeva - candidate of Biological Sciences, an associate professor, N.A. Ilina - doctor of Biological Sciences, professor, Ju.Ju.Krasnoperova - doctor of Biological Sciences, an associate professor, Ulyanovsk State Pedagogical University named after I.N. Ulyanov,
Ulyanovsk
e-mail: karpeeva30@mail. ru
Ключевые слова: гены патогенности, вирулентность, Blastocystis hominis, совместное культивирование, E.coli.
Аннотация. В статье рассмотрена частота встречаемости генов патогенности при сокультивировании Escherichia coli с простейшими Blastocystis hominis. Наиболее существенными для изменения патогенности условно-патогенных энтеробактерий ввиду "скачкообразного" характера и кардинальности происходящих превращений микроорганизма рассматривают генетические рекомбинации, которые определяют геномную пластичность микробов, реализуемую через несколько конкретных механизмов, связанных, в частности, с "островами" и "островками" патогенности. Относительно недавно "острова" и "островки" патогенности были обнаружены у традиционно условно-патогенных E.coli. Однако вклад данных механизмов в формировании новых фенотипических вариантов микроорганизмов остается неизученным.
Методы: метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), микроскопический, культуральный, статистическая обработка данных.
Материалы: Штаммы микроорганизмов бактерии E.coli и простейших Blastocystis hominis получали из фекалий 388 взрослых пациентов в возрасте от 20 до 60 лет, находящихся на лечении в условиях дневного гастроэнтерологического стационара Муниципального учреждения здравоохранения Городской поликлиники №5 г. Ульяновска, с заболеваниями желудочно-кишечного тракта.
Результаты. Экспериментальные исследования показали, что после сокультивирования бактерий с бластоцистами различной вирулентности возрастает частота встречаемости генов, определяющих способность к образованию фимбрий S, Р и 1 типа, бактериального адгезина интимина, цитотоксического некротизирующего фактора, продукции энтерогемолизина, а-гемолизина и шигоподобных токсинов, по сравнению с показателями до сокультивирования и в монокультурах. Это свидетельствовало об их адаптивном значении в изменившихся условиях и дало представление о механизмах формирования вирулентных вариантов Escherichia coli.
Заключение. Проведенные тестирования показали, что после сокультивирования бактерий с простейшими бластоцистами различной вирулентности возрастает частота встречаемости изучаемых пар праймеров по сравнению с показателями до сокультивирования и в монокультурах. Резкая мобилизация защитных механизмов в ответ на "хищничество" простейших B.hominis сопровождалась увеличением числа особей, содержащих в своем генотипе фрагменты eаe А, cnf1, ehx, stxl и stx2 генов и их фенотипической экспрессии. Ген hlyB, контролирующий выработку а-гемолизина, создает преимущества в алгоритме совместного выживания изучаемых симбионтов только в условиях макроорганизма, тогда как на искусственных питательных средах в системе "хищник-жертва" данный признак не влияет на сохранение популяционной численности организма- "жертвы ".
Keywords: pathogenicity genes, virulence, B hominis, co-culture, E coli.
Annotation: The article has examined frequency ofpathogenicity genes occurrence in case of coculture of Escherichia coli with protozoan Blastocystis hominies. The most essential for changing of pathogenicity opportunistic enter bacteria because of abrupt nature and cardinal property of microorganism genetic recombination's transformation are examined which define genetic flexibility of microorganism, which is realized through several specific mechanisms related particularly to pathogenicity «islands» and «islets». Relatively recently pathogenicity «islands» and «islets» were discovered at traditionally opportunistic pathogenic E coli. However contribution of these mechanisms to formation of new phenotypic variants of microorganisms is still unexplored. Research methods: polymerase chain reaction method (PCR), microscopical method, culture technique, statistical data processing.
Materials: strains of microorganisms of E coli bacteria and protozoans Blastocystis hominis were received from fecal matter of 388 adult patients aged from 20 to 60 with gastrointestinal disease who are under medical treatment in daytime gastroenterological hospital of Municipal health care institution of Municipal Polyclinic № 5 of Ulyanovsk city.
Results. Experimental study showed that after coculture of bacteria with blastocysts of different virulence frequency of genes occurrence rises, which defines capability to formation ofpili S, P and 1 type, bacterial adhesion intimin, cytotoxic necrotizing factor, enterohymolysin products, а-hemolysine and shiga like toxins comparing with indexes before coculture and in pure cultures. This gave evidence to their adaptive value in changed conditions and gave idea of Escherichia coli virulent variants formation mechanisms.
Conclusion. Performed tests showed that after coculture of bacteria with protozoans blastocysts of different virulence frequency of studied primers pairs occurrence rises comparing with indexes before co-culture and in pure cultures. Abrupt mobilization of defense mechanisms in reply to "predation" ofprototozoans B.hominis was accompanied by increasing number of species containing in their genotype fragments of eаe А, cnf1, ehx, stx1 and stx2 genes and their phenotypic expressions. Gene hlyB controls production of а-hemolysine creates advantages in algorithm of mutual survival of examined symbionts only under the conditions of microorganisms whereas at the artificial nutrient in the system of 'invader-victim' this characteristic doesn't influence on preservation of population number of organism - 'victim'.
Актуальность. Литературные данные и результаты собственных исследований показывают высокую частоту
встречаемости простейших Blastocystis hominis как среди людей, так и среди животных. Нарушая баланс
микроорганизмов, данные возбудители способствуют созданию благоприятных условий для развития патологических процессов. Следует отметить, что изменения патогенности у бактерий реализуется на генетическом уровне через мутации и генетические рекомбинации. Полагают, что мутационный механизм эволюционно менее значим, поскольку ассоциируется с медленными и постепенными адаптационными
изменениями. Наиболее существенными для изменения патогенности условно-патогенных энтеробактерий [5,6], ввиду "скачкообразного" характера и кардинальности происходящих
превращений микроорганизма,
рассматривают генетические
рекомбинации, которые определяют геномную пластичность микробов, реализуемую через несколько конкретных механизмов, связанных, в частности, с "островами" и "островками" патогенности
[7].
Относительно недавно "острова" и "островки" патогенности были
обнаружены у традиционно условно-патогенных E.coli. Однако вклад данных механизмов в формирование новых фенотипических вариантов
микроорганизмов остается неизученным. Материалы. В работе мы использовали праймеры к нескольким генам, обнаруженным в составе "островов" патогенности E.coli, определяющие их способность к образованию фимбрий 1-го типа, фимбрий
S и Р типа, бактериального адгезина интимина, цитотоксического
некротизирующего фактора, продукции энтерогемолизина, гемолизина и
шигаподобных токсинов. Основным методом для исследования нуклеотидных последовательностей генов,
определяющих продукцию факторов патогенности, использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) Результаты и их обсуждение. Штаммы микроорганизмов получали из фекалий 388 взрослых пациентов в возрасте от 20 до 60 лет с заболеваниями желудочно-кишечного тракта, находящихся на лечении в условиях дневного гастроэнтерологического стационара Муниципального учреждения
здравоохранения Городской поликлиники № 5 г. Ульяновска. Исследования по выделению и первичной идентификации микробов из биологического материала проводили на базе клинической лаборатории городской больницы №1 г. Ульяновска.
Степень вирулентности простейших бластоцист определяли путем
внутрибрюшинного введения белым мышам (массой 17,4+1,5 г) 0,5 мл взвеси культуры изучаемых микроорганизмов, выращенной на среде Suresh [8]. Культивирование с целью изучения взаимного влияния микробов-ассоциантов проводили в жидкой питательной среде Suresh. Исходная концентрация бактерий E.coli составляла 105 КОЕ/мл, простейших B.hominis - 10 КОЕ/мл. Культуры бактерий при сокультивировании с простейшими отбирались в период увеличения их численности и проявления цитопатогенного действия на клетки бластоцист.
Таблица 1
Набор праймеров, использованных в работе
Позиция Позиция
нуклеот нуклеот
Ген Пары праймеров идов в геноме, порядко вый Ген Пары праймеров идов в геноме, порядко вый
номер согласно GenBank номер согласно GenBank
stx1 (169) 5-gaagagtccgtgggattccg-3 5 -agcgatgcagctattaataa-3 10191038 11291148 sfaG (59) 5 -tgccgggaacacagaccatag-3 5-caatcttgataccgccagcattc-3 839-856 12891266
stx2 (169) 5 -ttaaccacaccccgccggc-3 5 -gctctggatgcatctctggt-3 351-370 679-699 papC (59) 5-cgttcgccgggtatcgtttctcag-3 5-cccgttccccagcgatttgtcac-3 49460744946097 49453744945396
eaeA (102) 5- gcaaatttaggtgcgggtcagcgtt-3 5- ggctcaatttgctgagaccacggtt-3 10961120 15651589 papH (59) 5 -ttaaagataatcgggtcat-3 5-ggaatcagagaaaaggtt-3 49488224948840 49478044947821
ehx (152) 5-agccggaacagttctctcag-3 5-ccagcataacagccgatg-3 381-400 890-907 fimA (158) 5-cgacgcatcttcctcattcttct-3 5 -attggttccgttattcagggttgtt-3 332-354 10521028
cnf1 5 -gggtcagggcccacagtcaa-3 5 -tagcggcttcaaaatacggatag-3 27352752 311173139 hlyB (59) 5-cgacgtcgccttgatgata-3 5 -tccccctgcttaatactgagat-3 4988149899 5040150422
sfaA (59) 5-cggtgtgcgtagttcaat-3 5-cacccgcatggataaaaa-3 139-156 762-779
Праймеры синтезированы в НПФ "ДНК-технология" (Россия).
Выделение бактериальной ДНК проводили по методу Boom et al. [9].
Подбор праймеров (таблица 1) и температуры отжига (таблица 2) осуществляли при ^пользовании пакета программ "Lasergene" (США).
Таблица 2
Использованные режимы амплификации
Ген Температурные режимы амплификации Кол-во циклов Ген Температурные режимы амплификации Кол-во циклов
stx1 94 0С - 2 мин 56 0С - 2 мин 72 0С - 5 мин 35 sfaG (59) 94 0С - 2 мин 55 0С - 2 мин 72 0С - 5 мин 30
stx2 94 0С - 2 мин 56 0С - 2 мин 72 0С - 5 мин 35 papC (59) 94 0С - 2 мин 53 0С - 2 мин 72 0С - 5 мин 30
eaeA 94 0С - 2 мин 65 0С - 2 мин 72 0С - 5 мин 35 papH (59) 94 0С - 2 мин 54 0С - 2 мин 72 0С - 5 мин 30
ehx 94 0С - 2 мин 58 0С - 2 мин 72 0С - 5 мин 30 fimA (158) 94 0С - 2 мин 53 0С - 2 мин 72 0С - 5 мин 30
94 0С - 2 мин hlyB (59) 94 0С - 2 мин
cnf-1 53,6 0С - 2 мин 30 55 0С - 2 мин 30
72 0С - 5 мин 72 0С - 5 мин
sfaA (59) 94 0С - 2 мин 54 0С - 2 мин 72 0С - 5 мин 30
В нашей работе регистрацию результатов ПЦР осуществляли путем
электрофоретического разделения
продуктов амплификации на окрашенном бромистым этидием в агарозном геле. Используя набор праймеров,
амплифицирующих фрагменты генов рарС, рарН, БГаЛ, БГаО, йшА, 81x1, б1х2, еаеА, сиМ и ЫуБ и еЬх, было протестировано 94 штамма Е.соИ с нормальной ферментативной активностью, выделенных из ассоциаций с B.hominis различной степени
вирулентности, а также после их совместного культивирования и 134 штамма эшерихий, выделенных из
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерной программы Vector NTI Suite (США).
консорциумов, где бластоцисты не являлись участниками микробного сообщества. Тестирование штаммов E.coli, выделенных из ассоциации с авирулентными бластоцистами, показали, что чаще всего, независимо от периода исследования, искомые ампликоны выявлялись при использовании праймеров к рарС, рарН и БГаА генам (таблица 3).
Таблица 3
Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов Е.соИ, выделенных из ассоциации с бластоцистами различной вирулентности
# п/п Группы E.coli Период изучения Частота встречаемости последовательностей
рарН абс./% рарС абс./% sfaG абс./% sfaA абс./% fimA абс./%
1. в ассоциации с авирулентными B.hominis (n=33) до сокультивирования 2/6,1 4/12,1 0 2/6,1 0
после 15 мин сокультивирования 4/12,1* 11/33,3* * 0 4/12,1* 0
монокультуры 0 2/6,1 0 0 0
2. в ассоциации с умеренновирул ентными B.hominis (n=32) до сокультивирования 2/6,2 5/15,6 0 2/6,2 3/9,4
после 24 часов сокультивирования 6/18,7* 12/37,5* 1/3,1* 6/18,7* 3/9,4
после 21 суток сокультивирования 13/40,6 ** 28/87,5* * 5/15,6* * 13/40,6 ** 9/28,1**
монокультуры 0 2/6,2 0 0 0
3. в ассоциации с высоковирулен тными B.hominis (n=29) до сокультивирования 2/6,9 7/24,1 0 2/6,9 1/3,4
после 24 часов сокультивирования 4/13,8* 9/31,0* 2/6,9* 4/13,8* 3/10,3*
после 21 суток сокультивирования 9/31,0* * 17/58,6* * 6/20,7* * 9/31,0* * 8/27,6**
монокультуры 0 2/6,8 0 0 0
* - р<0,05; **- р<О,О01 У бактерий E.coli, выделенных из ассоциации с умеренно- и высоковирулентными бластоцистами, дважды отмечено увеличение частоты образования искомых ампликонов, специфичных изучаемым генам - через 24 часа и 21-е сутки совместного культивирования с B.hominis, что соответствовало увеличению численности популяции бактерий вследствие усиления их защитных механизмов от фагоцитирования бластоцистами. Из 94 протестированных штаммов с праймерами к eaeA гену, положительный сигнал был получен только с 12 культурами, что составляет 12,8 %. В общем пуле контрольных штаммов положительные сигналы были получены у 2 культур (1,5 %).
Далее была изучена распространенность шП гена. В группе бактерий с нормальной ферментативной активностью, в
ассоциации с авирулентными простейшими B.hominis, распределение фрагментов изучаемого гена оказалось следующим: до сокультивирования - 3% (1 штамм), после -3% (1 штамм) и статистически не различалось с данными, полученными в контрольной группе (2,9 %), что свидетельствует о наличии механизмов сохранения в популяциях особей с данным генотипом, но на низком уровне. В группах эшерихий в ассоциации с умеренно- и высоковирулентными бластоцистами
данный показатель составил 31,2% и 58,6% соответственно (р<0,001). Исследования выявили, что частота встречаемости фрагментов ehx гена у бактерий возросла после совместного культивирования с простейшими B.hominis. Так, среди E.coli с нормальной ферментативной активностью в ассоциации с авирулентными бластоцистами фрагменты ehx гена до и после совместного культивирования выявлены не были, в ассоциации с умеренно- и высоковирулентными бластоцистами
показатель распространенности данной нуклеотидной последовательности
увеличился в 1,3, и 1,5 раза соответственно по сравнению с монокультурами и данными до проведения совместной инкубации (р<0,001).
Используя праймеры, амплифицирующие нуклеотидные последовательности ЫyB гена, показано, что среди типичных кишечных палочек в консорциуме с высоко-, умеренно- и авирулентными бластоцистами искомые ампликоны обнаруживались в 20,7%, 18,7% и 3,0 % случаев соответственно и не менялись после проведения сокультивирования. В группе контрольных штаммов данный показатель не превышал 1,5 % (2 культуры).
У бактерий с нормальной ферментативной активностью в ассоциации с авирулентными простейшими B.hominis распределение фрагментов stx1 и stx2 генов оказалось равно 0 % как до, так и после совместной инкубации. Среди E.coli в консорциуме с умеренновирулентными бластоцистами отмечено статистически достоверное увеличение частоты обнаружения нуклеотидных
последовательностей stx1 и stx2 генов после сокультивирования с 3,1 до 9,4% и 3,1 до 6,2% соответственно. В группе эшерихий в тандеме с
высоковирулентными бластоцистами
отмечен также статистически достоверный рост частоты обнаружения искомых ампликонов после сокультивирования с 6,9 до 13,8 % и 6,9 до 10,3 % соответственно. В общем пуле контрольных штаммов данный показатель не превышал 0,7 % (1 культура).
Суммируя полученные данные, можно заключить, что в общем пуле штаммов эшерихий с нормальной ферментативной активностью, выделенных из
микробиоценоза кишечника совместно с авирулентными бластоцистами, только в 5 случаях (15,1 %) получены положительные сигналы при тестировании с амплификонами искомых генов
патогенности. После сокультивирования с авирулентными бластоцистами увеличилась
только частота выявления ампликонов, специфичных рарС, рарН, sfaA генам. Оценка встречаемости генов патогенности у эшерихий до сокультивирования с умеренновирулентными простейшими показала, что образование искомых ампликонов, специфичных изучаемым генам, имело место в 10 случаях (31,2 %). После совместной инкубации данный показатель среди протестированных штаммов составил 93,7 % (30 культур). Анализ частоты обнаружения ампликонов, специфичных изучаемым генам, среди кишечных палочек, выделенных и культивированных совместно с
бластоцистами высокой вирулентности, нами были получены следующие результаты. Так, среди 29 штаммов эшерихий с нормальной ферментативной активностью,
протестированных с использованием амплификонов, специфичных исследуемым генам патогенности, положительные результаты получены в 11 случаях (37,9 %). После совместного культивирования уровень обнаружения фрагментов генов патогенности увеличился до значения 89,6 % (26 штаммов).
Статистический анализ полученных данных установил тесную
корреляционную зависимость между встречаемостью генов fimA и ehx (р=0,084), cnfl и eaeA, где р=0,086, рарС и hlyB (р=0,093). Меньшая зависимость в распространенности отмечена для фрагментов cnfl, eaeA и stxl генов (р=0,076), а также между sfaG и ehx генами (р=0,07). Значения коэффициентов корреляции для cnfl, eaeA и stx2 генов равнялись р=0,064, а для fimA, sfaG и рарС р=0,057.
Следует отметить, что возрастание количества положительных сигналов со всеми изучаемыми фрагментами генов совпадало с периодами увеличения плотности популяций бактерий E.coli и появлением в среде разрушенных клеток B.hominis.
Заключение. Проведенные тестирования показали, что после сокультивирования бактерий с простейшими бластоцистами
различной вирулентности возрастает частота встречаемости изучаемых пар праймеров по сравнению с показателями до сокультивирования и в монокультурах. Причем чаще всего искомые ампликоны выявлялись с использованием праймеров к рарС, рарН и БГаА генам. С наименьшей частотой обнаруживались фрагменты sfaG и fimA генов. По нашему мнению, резкая мобилизация защитных механизмов в ответ на "хищничество" простейших
B.hominis также сопровождается увеличением числа особей, содержащих в своем генотипе фрагменты еае А, cnfl, ehx, stxl и stx2 генов и их фенотипической экспрессии.
Напротив, hlyB ген, контролирующий выработку а-гемолизина, создает преимущества в алгоритме совместного выживания изучаемых симбионтов только в условиях макроорганизма, тогда как на искусственных питательных средах в системе "хищник-жертва" данный признак не влияет на сохранение популяционной численности организма-"жертвы".
Литература
1. Немова, И. С. Микроэкология организма человека : учебное пособие / И. С. Немова, Н. И. Потатуркина-Нестерова, О. Е. Беззубенкова, О. С. Сментына, М. Ю. Зубарева. -Ульяновск : УлГПУ, 2012. - 101 с.
2. Арутюнян, В. Г. Биологические свойства условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от здоровых и больных людей / В. Г. Арутюнян, А. А. Лалаян, Ю. Т. Алексанян // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. - № 2. - С. 124-125.
3. Бондаренко, В.М. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий / В. М. Бондаренко, А. Р. Мавзютов, Е. Golkocheva // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2002. - № 1. - С. 84-90.
4. Ефимов, Б. А. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник / Б. А. Ефимов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2002. - № 5. -
C. 98-104.
5. Бугеро, Н. В. Копрологические исследования толстого кишечника на фоне бластоцистной инвазии : монография / Н. В. Бугеро, Н. И. Потатуркина-Нестерова, Н. А. Ильина. - М. : ФЛИНТА: Наука, 2012. - 108 с.
6. Несвижский, Ю. В. Анализ простых межмикробных взаимодействий в микробиоценозе толстой кишки человека / Ю. В. Несвижский, А. А.
Воробьев, С. С. Белоносов // Вестник Российской Академии медицинских наук. - 1997. - № 3. - С. 23-26.
7. Brunder, W. Genom plasticity in Enterobacteriaceae / W. Brunder, H. Karh // J Med Microbiol. - 2000. - V. 290. - Р. 153-165.
8. Suresh, K. A multiple fission-like mode of asexual reproduction in B.hominis / К. Suresh, J. Hove, G. C. Ng // Parasitol. Res. - 1994. - V.80. - № 6. - Р. 523-527.
9. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom, C.J. Sal, M. M. Salimans, E. Carniel, B. Vandeic, C. Rainolds // J Clin Microbiol. - 1988. - V. 28. - Р. 495-503.
References
1. Nemova, I. S. Microecology of human organism: educational book / I. S. Nemova, N. I. Pataturkina-Nesterova, O. Е. Bezzubenkova, О. S. Smentyna, М. Ju. Zubareva. - Ulyanovsk : Ulyanovsk State Pedagogical University, 2012. - 101 pp
2. Arutyunyan, V. G. Biological property of opportunistic enterobacteria, separated from healthy and sick people / V. G. Arutyunyan, А. А. Lalayan, J. T. Aleksanyan // Microbiology, epidemiology and immunobiology magazine - 2001. - № 2. - P. 124-125
3. Bondarenko, V.M. Secretable factors of enterobacteria pathogenicity / V. М. Bondarenko, A. R. Mavzyutov, Е. Golkocheva // Microbiology, epidemiology and immunobiology magazine //- 2002. - № 1. - Pp.84-90.
4. Efimov, B. A. Characteristic of microorganisms colonizing intestinal canal / B. A. Efimov // Microbiology, epidemiology and immunobiology magazine - 2002. - № 5. - P. 98-104.
5. Bugero N. V. Coprological examination of large intestine on the background of blastocyst invasion: monography / N. V. Bugero, N. I. Potaturkina-Nesterova, N. . Ilyuna. - Moscow : FLINTA: Science, 2012. - 108 pp
6. Nesvizhski, J. V. Analysis of simple intermicrobial cooperation in microbiocenosis of humans' large intestine / Ju. V. Nesvizhski, A. A. Vorobiev, S. S. Belonosov // Reporter of Russian Academy of medical science . - 1997. - № 3. - P. 2326.
7. Brunder, W. Genom plasticity in Enterobacteriaceae / W. Brunder, H. Karh // J Med Microbiol. - 2000. - V. 290. - Р. 153-165.
8. Suresh, K. A multiple fission-like mode of asexual reproduction in B.hominis / К. Suresh, J. Hove, G. C. Ng // Parasitol. Res. - 1994. - Volume.80. - № 6. - Р. 523-527.
9. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom, C.J. Sal, M. M. Salimans, E. Carniel, B. Vandeic, C. Rainolds // J Clin Microbiol. - 1988. - Volume. 28. - Р. 495-503.
Статья поступила в
редакцию:21.01.2015г.
