Частота полиморфизма Val66Met гена BDNF у детей первого года жизни с перинатальным поражением центральной нервной системы легкой и средней степени тяжести

Папшева Е.А.; Шокарев Р.А.; Кривенцова А.А.

УДК: 616.831:612.8:577.112.7

ЧАСТОТА ПОЛИМОРФИЗМА VAL66MET ГЕНА BDNF У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ С ПЕРИНАТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ЛЕГКОЙ И СРЕДНЕЙ

СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ

Папшева Е. А., Шокарев Р. А., Кривенцова А. А.

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Минздрава России, 344012, г. Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, 43, Россия

Для корреспонденции: Шокарев Роман Александрович, кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией медицинской генетики, ФГБУ«РНИИАП» Минздрава России, E-mail: r715@yandex.ru

For correspondence: Roman A. Shokarev, PhD, head of the laboratory of medical genetics, Rostov Scientific-Research Institute of Obstetrics and Pediatrics, E-mail: r715@yandex.ru

Information about authors:

Papsheva E. A., http://orcid.org/0000-0002-5513-2380 Shokarev R. A., http://orcid.org/0000-0002-6684-800X Kriventsova A. A., http://orcid.org/0000-0002-8257-2680

РЕЗЮМЕ

Гипоксически-ишемическое поражение головного мозга является определяющим фактором перинатального поражения центральной нервной системы (ЦНС) у новорожденных детей. Одним из белков нейропротекторов является нейротрофический фактор головного мозга - BDNF (brain-derived neurotrophic factor). Наиболее исследованным однонуклеотидным полиморфизмом в гене BDNF является замена нуклеотида G на А в 196-м положении в 9-м экзоне (rs6265). Данная замена влияет на снижение активности BDNF-зависимой секреции, резко изменяя внутриклеточный транспорт и упаковку про-BDNF.

В группу исследования вошли: 161 ребенок без признаков поражения ЦНС в неонатальном периоде и в течение первого года жизни (группа I); группу II составили 25 детей с церебральной ишемией I степени; группу III - 64 ребенка с церебральной ишемией II степени тяжести.

Проведенные исследования не выявили достоверных различий в распределении частоты полиморфизма Val66Met между детьми из контрольной группы и детьми с поражением ЦНС. Не было также различий в распределении полиморфизма Val66Met в группах детей с церебральной ишемией I степени (II группа) и детей с церебральной ишемией II степени тяжести (III группа).

Наше исследование показало, что полиморфизм Val66Met гена BDNF не влияет на степень гипоксически-ишемического поражения ЦНС у новорожденных. Вероятно, что структура и способы экспрессии гена BDNF обеспечивают большую гибкость в контроле скорости и величины ответа на то или иное воздействие, что, возможно, компенсирует отрицательное влияние полиморфизма Val66Met.

ключевые слова: перинатальное гипоксически-ишемическое поражение центральной нервной системы, нейротрофический фактор головного мозга, BDNF ген, полиморфизм Val66Met.

FREQUENCY OF VAL66MET POLYMORPHISM OF BDNF GENE IN CHILDREN OF FIRST YEAR OF LIFE WITH PERINATAL DAMAGE OF THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM OF MILD AND MODERATE DEGREES OF SEVERITY

Papsheva E. A., Shokarev R. A., Kriventsova A. A.

Rostov Scientific-Research Institute of Obstetrics and Pediatrics, Rostov-on-Don, Russia

SUMMARY

Hypoxic-ischemic brain injures of the central nervous system (CNS) takes the leading place among all the factors of perinatal damage.

BDNF (brain-derived neurotrophic factor) is neurotrophic factor of the brain and one of the proteins playing neuroprotective role. One of the most studied single nucleotide polymorphisms in BDNF gene is the replacement of nucleotide G by A at 196th position of 9th exon (rs6265). This polimorphism affects decreasing of BDNF-dependent secretion activity, dramatically changes intracellular transport and pro-BDNF packaging.

Our study group included 161 children without injure of CNS in early neonatal period and during the first year of life (group I); group II comprised 25 children with cerebral ischaemia of the 1st degree; group III - 64 children with cerebral ischaemia of II degree and its manifestation during the first year of life.

Study of genotypes frequency and alleles did not reveal significant differences in the distribution of Val66Met polymorphism between children from the control group and children with CNS injure. There was no similar difference in the distribution of Val66Met polymorphism in groups of children with cerebral ischaemia of the 1st degree (group II) and children with cerebral ischaemia of the II degree (group III).

Our study showed that Val66Met polymorphism of the BDNF gene does not affect the degree of hypoxic-ischemic involvement of the CNS in newborns. Probably the structure and methods of expression of the BDNF gene provide greater flexibility in controlling the rate and magnitude of the response to malignant factor, which possibly compensates malignant effect of Val66Met polymorphism.

Key words: perinatal hypoxic-ischemic injury of the central nervous system, brain-derived neurotrophic factor, BDNF gene, Val66Met polymorphism.

Гипоксически-ишемическое поражение головного мозга является определяющим фактором перинатального поражения центральной нервной системы (ЦНС) у новорожденных детей. Раннее выявление и поиск маркеров этого заболевания является одной из наиболее актуальных проблем современной педиатрии [1]. Важнейшей задачей представляется изучение процессов, которые влияют на течение и прогнозирование исходов перинатального поражения ЦНС у детей, и механизмов действия защиты мозга в неонатальном периоде. В работах некоторых авторов доказано, что сохранение ткани мозга в стрессорные моменты обеспечивается взаимодействием систем трофических и ростовых факторов [2, 3]. В регуляции нейропласти-ческих процессов одна из главных ролей отводится нейротрофическим ростовым факторам. Это физиологически активные полипептиды, которые определяют в процессе филогенеза рост и дифференцировку нейронов, и способствуют формированию в постнатальном периоде новых синаптических связей [4]. Одним из таких белков является BDNF (brain-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор головного мозга, принадлежащий к классу цитокинов. Белок BDNF имеет молекулярную массу 13 кДаль-тон и экспрессируется в очагах повреждения, в нейронах различной локализации и на фибро-бластах [5]. Протективное влияние BDNF на нейроны путем уменьшения факторов локального воспаления было доказано при моделировании ишемического инсульта на крысах [6, 7]. При предварительном введении BDNF в желудочки мозга было зафиксировано уменьшение размера зоны ишемии мозговой ткани [8]. Эти исследования позволяют предположить, что BDNF препятствует проявлению механизма глутаматной эксайтотоксичности, во взрослом организме защищает нейроны головного мозга от ишемии, выполняя нейропротекторную функцию [9].

Ген BDNF локализован на коротком плече 11 хромосомы и состоит из 11 экзонов, в его составе присутствуют 9 функциональных промоторов, которые кодируют девять ткане- и время-специфичных транскриптов. Функциональную часть белка кодирует последний экзон [10].

Одним из наиболее исследованных одно-нуклеотидных полиморфизмов в гене BDNF

является замена нуклеотида G на A в 196-м положении в 9-м экзоне (rs6265), которая приводит к замене в 66-м кодоне аминокислоты Val на Met в 5' про-BDNF домене. Данная замена влияет на снижение активности BDNF-зависимой секреции, резко изменяя внутриклеточный транспорт и упаковку про-BDNF [11]. В некоторых исследованиях показано, что более низкий уровень сывороточного BDNF связывают с ал-лелем Met [12]. С этим аллелем также связано снижение объёма дорсолатеральной префрон-тальной коры и гиппокампа, ухудшение кратковременной памяти [11]. Учитывая, что низкая и крайне высокая концентрации сывороточного BDNF являются прогностически неблагоприятными для формирования структурных поражений головного мозга у новорожденных группы риска, определение уровня BDNF в сыворотке крови можно использовать и в клинической неонатологии для диагностики тяжести поражения и прогноза развития органических форм поражения ЦНС [13]. В этой связи изучение полиморфизма Val66Met BDNF у новорожденных с перинатальным гипоксически-ишемическим поражением ЦНС имеет научное и практическое значение. Исследование было одобрено Этическим комитетом Федерального государственного бюджетного учреждения «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Все родители обследованных детей дали информированное согласие на участие в исследовании.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Формирование групп сравнения. Нами было проведено обследование детей в два этапа: первый этап - в периоде новорожденности, второй этап - в конце первого года жизни. У всех матерей наблюдался отягощенный акушерско-гине-кологический анамнез. Дети с наследственными заболеваниями и врожденными пороками развития, воспалительными заболеваниями, внутриутробными инфекциями, метаболическими и токсическими энцефалопатиями, с механической травмой в родах из числа обследованных были исключены. Всего было обследовано 250 доношенных детей. В их число вошли: 161 ребенок без признаков поражения ЦНС в раннем

неонатальном периоде и в течение первого года жизни (группа I); группу II составили 25 детей с церебральной ишемией I степени; группу III -64 ребенка с церебральной ишемией II степени тяжести и ее последствиями на первом году жизни. С учетом физиологических особенностей детей неврологический статус оценивали синдромологически. Уровень психомоторного развития определялся у детей в возрасте 1, 3, 6, 9, 12 месяцев с использованием количественно-качественной оценки на основе комплексного эволюционного анализа развития ребенка на каждом месяце жизни по методу Журбы Л. Т. и Мастюковой Е. М. [14]. Основная нозологическая форма верифицировалась согласно классификации перинатальных поражений ЦНС и их последствий у детей, утвержденной Российской ассоциацией специалистов перинатальной медицины (2007).

Определение полиморфизма. Материалом для исследования служила дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), выделенная из лимфоцитов периферической крови. Определение аллельных вариантов полиморфизма Уа166Ме1 гена ИБОТ проводили тест-системами для молекулярно-ге-нетического анализа, разработанными в Государственном научном центре Российской Федерации Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промыш-

На основании наблюдений за детьми в течение года в каждой группе больных были выделены две подгруппы в зависимости от последствий поражения ЦНС к концу первого года жизни -подгруппа с исчезновением и подгруппа с сохранением неврологической симптоматики к концу года. В этих подгруппах также не было выявлено достоверных различий в распределении полиморфизма Уа166Ме1.

ленных микроорганизмов» («ГосНИИгенетика», Москва), методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом рестрикционных фрагментов. Продукты амплификации и рестрикции разделяли в 6% неденатурирующем полиакрила-мидном геле.

Статистическая обработка. Достоверность различий между сравниваемыми группами по частотам генотипов и аллелей проводили с помощью критерия Фишера или хи-квадрат по стандартной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений. Значение р<0,05 было принято как статистически значимое.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение распределения генотипов Уа166Ме1 гена ИБОТ (ге6265) в контрольной группе и в группах больных показало, что оно не отличалось от ожидаемого распределения Харди-Вайнберга (р>0,05).

Полученные результаты представлены в таблице. В ходе нашего исследования не было выявлено достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей полиморфизма Уа166Ме1 между детьми из контрольной группы и детьми с поражением ЦНС. Не было также различий в распределении полиморфизма Уа166Ме1 в группах детей с ишемией I степени (II группа) и детей с ишемией II степени тяжести (III группа).

ОБСУЖДЕНИЕ

Существующие данные по влиянию исследованного полиморфизма на уровень BDNF и на различные состояния весьма противоречивы. Рядом авторов показано, что у гомозигот по полиморфному аллелю Met66 активность фермента in vitro снижена на 70%, у гетерозигот - на 35% [15, 16]. В другом исследовании было обнаружено снижение выработки BDNF в культурах нейронов

Таблица

Частота генотипов и аллелей полиморфизма Val66Met гена BDNF в исследуемых группах

Количество детей (частота %)

Полиморфизм II группа III группа I группа

Контроль

G/G 16 (64,0%) 40 (62,5%) 104 (64,6%)

генотипы G/A 8 22 55

BDNF rs6265 (G>A) (32,0%) (34,4%) (34,2%)

A/A 1 (4,0%) 2 (3,1%) 2 (1,2%)

аллели G 40 102 264

A 10 26 58

гиппокампа в случае аллеля Met. Также аллель Met оказывает влияние на зависимую от деполяризации секрецию BDNF и его внутриклеточное распределение [17]. Выявлено, что аллель Met66 связан с увеличением периферического уровня мозгового нейротрофического фактора в сыворотке крови больных параноидной шизофренией

[18]. Авторы предполагают, что это является компенсаторным ответом на нарушенную секрецию внутриклеточного BDNF у носителей аллеля Met

[19]. Структура и регуляция гена BDNF весьма сложна. В гене человека присутствуют 9 промоторов, которые могут синтезировать 17 транс-криптов, и все они кодируют один и тот же белок

[20]. Уровень экспрессии мРНК и белка BDNF находится под воздействием многих факторов, концентрация BDNF варьирует в ходе роста и развития организма, изменяется при ишемии, гипоксии и гипогликемии, эпилептической активности, при травмах, а также находится в зависимости от физической активности [21, 22]. Данные, приведенные выше, говорят о том, что экспрессия гена BDNF в ЦНС находится под контролем многих внутри- и внеклеточных факторов. В ответ на повреждение происходит быстрая активация транскрипции гена, не требующая синтеза белка de novo, а использующая pro-BDNF [23, 24].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наше исследование показало, что полиморфизм Val66Met гена BDNF не влияет на степень гипоксически-ишемического поражения ЦНС у новорожденных и на наличие или отсутствие клинических проявлений последствий перинатального поражения мозга к концу года жизни. Вероятно, что структура и способы экспрессии гена BDNF обеспечивают большую гибкость в величине и скорости ответа на то или иное воздействие, что, возможно, компенсирует отрицательное влияние полиморфизма Val66Met.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Красноруцкая О.Н., Балакирева Е.А., Зуйкова А.А., Добрынина И.С. Оценка степени участия биохимических маркеров перинатального поражения центральной нервной системы у детей. Вестник новых медицинских технологий. 2014;21(2):26-29. doi: 10.12737/4991.

2. Голосная Г.С., Петрухин А.С., Терентьев А.А., Дуленков А.Б. Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) в ранней диагностике внутрижелудочковых кровоизлияний и пери-вентрикулярной лейкомаляции у новорожденных детей. Вопросы современной педиатрии. 2005;4(3):13-18.

3. Hill C.A., Fitch R.H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol. Res. Int. 2012;2012:867531. doi: 10.1155/2012/867531.

4. Alvarez-Buylla A., Garcia-Verdugo J.M. Neurogenesis in adult subventricular zone. J. Neurosci. 2002;22(3):629-634.

5. Martinowich K., Manji H., Lu B. New insights into BDNF function in depression and anxiety. Nat. Neurosci. 2007;10(9):1089-1093.

6. Jiang Y., Wei N., Lu T., Zhu J., Xu G., Liu X. Intranasal brain-derived neurotrophic factor protects brain from ischemic insult via modulating local inflammation in rats. Neuroscience. 2011;172:398-405. doi: 10.1016/j. neuroscience.2010.10.054.

7. Schabitz W.R., Schwab S., Spranger M., Hacke W. Intraventricular brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size after focal cerebral ischemia in rats. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 1997;17(5):500-506. doi: 10.1097/00004647-199705000-00003.

8. Rybakowcki J.K., Borkowska A., Czerski P.M., Skibinska M., Hauser J. Polymorphism of the brain-derived neurotrophic factor gene and performance on a cognitive prefrontal test in bipolar patients. Bipolar. Disord. 2003;5(6):468-472.

9. Kuipers S.D., Bramham C.R. Brain-derived neurotrophic factor mechanisms and function in adult synaptic plasticity: new insights and implications for therapy. Curr. Opin. Drug. Discov. Devel 2006;9(5):580-586.

10. Arien-Zakay H., Lecht S., Bercu M.M., Tabakman R., Kohen R., Galski H., Nagler A., Lazarovici P. Neuroprotection by cord blood neural progenitors involves antioxidants, neurotrophic and angiogenic factors. Exp. Neurol. 2009;216(1):83-94. doi: 10.1016/j.expneurol.2008.11.006.

11. Egan M.F., Kojima M., Callicott J.H., Goldberg T.E., Kolachana B.S., Bertolino A., Zaitsev E., Gold B., Goldman D., Dean M., Lu B., Weinberger D.R. The BDNF val66met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function. Cell. 2003;112(2):257-269.

12. Ozan E., Okur H., Eker C., Eker O.D., Gonul A.S., Akarsu N. The effect of depression, BDNF gene val66met polymorphism and gender on serum BDNF levels. Brain Res. Bull. 2010;81(1):61-65. doi: 10.1016/j.brainresbull.2009.06.022.

13. Попова Ю.Ю., Желев В.А., Михалев Е.В., Филиппов Г.П., Барановская С.В., Ермоленко С.П. Характеристика нейроспецифических маркеров у глубоко недоношенных новорожденных с гипок-сическим поражением центральной нервной системы. ^бирский медицинский журнал (Томск). 2007;22(4):5-10.

14. Журба Л.Т., Мастюкова Е.М. Нарушения психомоторного развития детей первого года жизни. М.: Медицина; 1981.

15. Vargas-Perez H., Ting-A Kee R., Walton C.H., Hansen D.M., Razavi R., Clarke L., Bufalino M.R., Allison D.W., Steffensen S.C., van der Kooy D. Ventral tegmental area BDNF induces an opiate-dependent-like reward state in naive rats. Science. 2009;324(5935):1732-1734. doi: 10.1126/ science.1168501.

16. Xiong P., Zeng Y., Wu Q., Han Huang D.X., Zainal H., Xu X., Wan J., Xu F., Lu J. Combining serum protein concentrations to diagnose schizophrenia: а preliminary exploration. J. Clin. Psychiatry. 2014;75(8):e794-801. doi: 10.4088/JCP.13m08772.

17. Chen Z.Y., Patel P.D., Sant G., Meng C.X., Teng K.K., Hempstead B.L., Lee F.S. Variant brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (Met66) alters the intracellular trafficking and activity dependent secretion of wild-type BDNF in neurosecretory cells and cortical neurons. J. Neurosci. 2004;24(18):4401-4411. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0348-04.2004.

18. Колесниченко Е.В., Барыльник Ю.Б., Го-лимбет В.Е. Редкий вариант поздней дискинезии у больной шизофренией с генотипом MetMet для полиморфизма Val66Met гена BDNF5. Фундаментальные исследования. 2011;9(2):257-259.

19. Chen S.L., Lee S.Y., Chang Y.H., Wang T.Y., Chen S.H., Chu C.H., Chen P.S., Yang Y.K., Hong J.S., Lu R.B. The BDNF Val66Met polymorphism and plasma brain-derived neurotrophic factor levels in Han Chinese heroin-dependent patients. Sci. Rep. 2015;5:8148. doi: 10.1038/srep08148.

20. Pruunsild P., Kazantseva A., Aid T., Palm K., Timmusk T. Dissecting the human BDNF locus: bidirectional transcription, complex splicing, and multiple promoters. Genomics. 2007;90(3):397-406. doi: 10.1016/j.ygeno.2007.05.004.

21. Lindvall O., Kokaia Z., Bengzon J., Elmer E., Kokaia M. Neurotrophins and brain insults. Trends Neurosci. 1994;17(11):490-496.

22. Chaieb L., Antal A., Ambrus G.G., Paulus W. Brain-derived neurotrophic factor: its impact upon neuroplasticity and neuroplasticity inducing transcranial brain stimulation protocols. Neurogenetics. 2014;15(1):1-11. doi: 10.1007/ s10048-014-0393-1.

23. Tao X., West A.E., Chen W.G., Corfas G., Greenberg M.E. A calcium-responsive transcription factor, CaRF, that regulates neuronal activity-dependent expression of BDNF. Neuron. 2002;33(3):383-395.

24. Dong M., Wu Y., Fan Y., Xu M., Zhang J. c-fos modulates brain-derived neurotrophic factor mRNA expression in mouse hippocampal CA3 and dentate gyrus neurons. Neuroscie. Lett. 2006;400(1-2):177-180. doi: 10.1016/j. neulet.2006.02.063.

REFERENCES

1. Krasnorutckaya O.N., Balakireva E.A., Zu'kova A.A., Dobrynina I.S. Assessement of biochemical markers of perinatal injuries of central nervous system in the children. Vestnik novyh medicinskih tehnologij. 2014;21(2):26-29. doi: 10.12737/4991. (In Russ).

2. Golosnaya G.S., Petrukhin A.S., Terentyev A.A., Dulenkov A.B. The brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in early diagnostics of intraventricular hemorrhages and periventricular leukomalacia in neonates. Voprosy sovremennoj pediatrii. 2005;4(3):13-18. (In Russ).