CC BY
42
УДК 575.167
© м. ю. синицкий,
В. п. Волобаев, м. А. Асанов
ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет»
изучены ассоциации уровня микроядер (мя) и других цитогенети-ческих нарушений у 129 работников угольных шахт с различными полиморфными вариантами генов репарации двойных разрывов Днк — Lig4 и ХЯСС4
01394Т. Установлено, что носители генотипа Ile/Ile гена Lig4 характеризуются повышенной частотой клеток с мя и клеток с протрузи-ями по сравнению с генотипами ^г/ ^г и Тhr/Ile. Данный ген потенциально может служить маркерным для определения индивидуальной чувствительности работников угледобывающих предприятий к комплексу вредных факторов, сопутствующих производству.
С ключевые слова: цитогенетика; микроядерный тест; уголь; генотипирование; репарация.
Поступила в редакцию 19.04.2015 Принята к публикации 07.12.2015
частота микроядер в лимфоцитах шахтеров с различными полиморфными вариантами генов репарации двойных разрывов днк
ВВЕДЕНИЕ
Уголь — один из наиболее распространенных полезных ископаемых, служащих для получения энергии. Россия занимает 6-е место в мире по добыче угля и 1-е место по его запасам. Работники угледобывающих предприятий, помимо риска развития различных профессиональных заболеваний, подвергаются также воздействию целого комплекса генотоксических факторов, способных оказать серьезное влияние на организм. В воздухе выработок отмечается наличие полициклических ароматических углеводородов, тяжелых металлов и радона. Частицы угольной пыли, являющиеся переносчиками радионуклидов, попадают в легкие шахтеров, создавая источники внутреннего облучения. Степень генетических повреждений в результате воздействия генотоксикантов на организм человека зависит от эффективности функционирования репаративных систем. Оценка полиморфных вариантов генов репарации ДНК позволяет определить индивидуальную чувствительность обследуемого к комплексу генотоксических факторов и снизить риски путем составления индивидуальных рекомендаций для каждого работника. Несмотря на актуальность данной проблемы как для России, так и для других угледобывающих стран, исследование уровня цитогенетических повреждений у шахтеров в нашей стране не проводилось, а в мировой литературе встречаются довольно ограниченные и противоречивые результаты ^опЬак et а1., 2005; Ку№о et а1., 2012; Ье6п-М^1а et а1., 2011; Ьеоп-Мф et а1., 2014; ^г et а1., 2013).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом исследований послужила венозная кровь 129 работников угольных шахт Кемеровской области. Средний возраст в выборке составил 53 года, средний стаж работы на угледобывающих предприятиях — 26 лет. Лица, на момент участия в обследовании страдающие онкологическими и инфекционными заболеваниями, принимающие лекарственные препараты, обладающие подтвержденным мутагенным эффектом, а также проходившие рентгенологические процедуры за 3 месяца до сбора материала, исключались из исследования. Каждый обследуемый подписывал протокол информированного согласия на участие в эксперименте. Все исследования были выполнены в соответствии с требованиями этического комитета Кемеровского государственного университета.
Оценку степени повреждения ДНК проводили с помощью микроядерного теста в лимфоцитах периферической крови, культивируемой в условиях цитокинетического блока ^епей, 1993). В каждый культуральный флакон, содержащий 3,8 мл культуральной среды, добавляли 200 мкл венозной крови и 30 мкг фитогемагглютенина («ПанЭко», г. Москва) и культивировали 44 часа при температуре 37 °С. Далее в каждый флакон вносили 24 мкл цито-халазина Б («ПанЭко», г. Москва) и культивировали еще 24 часа. После окончания культивирования препараты обрабатывали гипотоническим раствором КС1 и фиксировали (с использованием фиксатора Карнуа). Затем проводили окрашивание с помощью 2%-го раствора красителя Гимза («ПанЭко», г. Москва)
и анализировали препараты с помощью микроскопа Nikon Eclipse 80i при увеличении х 1000 (Ингель, 2006). Критерии отбора лимфоцитов, включаемых в анализ, а также критерии регистрируемых цитогенетических повреждений соответствовали общепринятым рекомендациям (Fenech, 2000). На каждом препарате анализировали ядра 1000 лимфоцитов, в которых отмечались микроядра (МЯ), нуклеоплазменные мосты и ядерные протрузии.
Выделение геномной ДНК из лимфоцитов проводили с использованием стандартного метода фенол-хлороформной экстракции.
Для определения полиморфных вариантов генов репарации ДНК проводили аллель-специфическую End-Point ПЦР с использованием наборов НПФ «Литех» (г. Москва).
Статистическая обработка результатов исследования была проведена в программе STATISTICA 7.0. Распределение частот цитогенетических повреждений сравнивали с нормальным (с помощью теста Колмогорова—Смирнова). На основании этого в дальнейшем использовали методы непараметрической статистики — ранговый U-тест Манна—Уитни для парного сравнения групп и тест Крас-кела—Уоллиса для сравнения 3 групп (Закс, 1976).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве кандидатных генов в данном исследовании были использованы гены репарации двунитевых разрывов ДНК Lig4 Thr9Ile и XRCC4 G1394T. Данный выбор обусловлен литературными данными о том, что ведущую роль в образовании МЯ играют именно двунитевые разрывы ДНК (Fenech et al., 2011). Кроме того, частоты встречаемости аллелей изученных генов в популяции достаточно высоки, что позволяет обнаруживать в выборках достаточное (для проведения ассоциативных исследований) количество всех полиморфных вариантов данных генов.
В результате учета цитогенетических повреждений у шахтеров нами было установлено, что главный показатель — количество двуядерных лимфоцитов с МЯ
в нашем опыте составил 11,16 %о, что несколько выше аналогичных показателей, полученных другими исследователями. Так, в исследовании ученых из Колумбии количество лимфоцитов с МЯ составило 8,6 % (Leon-Mejia et al., 2011), ученых из Бразилии — 7,46 % (Rohr et al., 2013). В работе турецких исследователей, напротив, был получен результат, более чем вдвое превышающий показатель, отмеченный в нашей работе, — 27,17 % (Donbak et al., 2005). Таким образом, имеющиеся данные о частотах цитогенетических повреждений, регистрируемых у шахтеров с помощью микроядерного теста, очень ограничены и противоречивы, что обусловливает необходимость проведения дополнительных исследований в данной области.
Анализ уровня цитогенетических повреждений у носителей различных аллелей гена Lig4 Thr9Ile показал ряд статистически достоверных различий (табл. 1).
Таким образом, носители гомозигот по минорному ал-лелю гена Lig4 Thr9Ile характеризовались повышенной частотой ряда цитогенетических повреждений. МЯ образуются из ацентрических хромосомных и хроматидных фрагментов, появляющихся в клетке в результате дефектов ферментов репарации двойных разрывов (Fenech et al., 2011). Обнаруженное превышение уровня лимфоцитов с МЯ у носителей генотипа Ile/Ile, вероятно, связано с пониженной активностью фермента ДНК-лигазы IV, катализирующей окончательный этап негомологичного соединения двунитевых разрывов. Возникновение протрузий связывают с воздействием на клетку ионизирующей радиации — в ряде исследований отмечалось наличие белкового комплекса RAD51 в данных цитогенетических аномалиях (Fenech et al., 2011). Полученные нами результаты могут свидетельствовать о повышенной чувствительности к экспозиции радоном шахтеров с генотипом Ile/Ile.
Следует отметить, что сопоставить полученные результаты с литературными данными не представляется возможным, так как на настоящий момент отсутствуют работы, посвященные оценке уровня цитогенетических
Таблица 1
Количество двуядерных лимфоцитов (т ± SE, %о) у носителей различных генотипов по гену Lig4 ТЪг9Пе
Генотип, признак Thr/Thr Thr/Ile Ile/Ile
2-яд. лимфоциты с 1 МЯ 9,93 ± 0,38 9,03 ± 0,61 12,07 ± 0,98a
2-яд. лимфоциты с 2 МЯ 1,01 ± 0,38 0,41 ± 0,12 1,07 ± 0,25ь
Всего 2-яд. лимфоцитов с МЯ 11,16 ± 0,44 9,69 ± 0,67 13,21 ± 1,05е
2-яд. лимфоциты с протрузиями 13,28 ± 0,62 11,41 ± 0,75 14,43 ± 1,30d
а — достоверные (р < 0,05) различия по сравнению с носителями генотипов Т^/Т^ (р = 0,21), Т^/Ие (р = 0,024); ь — достоверное различие по сравнению с носителями генотипа Т^/Ие (р = 0,033); с — достоверное различие по сравнению с носителями генотипа Т^/Пе (р = 0,039); й — достоверное различие по сравнению с носителями генотипа Т^/Пе (р = 0,020)
маркеров у работников угольных шахт с различными полиморфными вариантами генов репарации двунитевых разрывов ДНК.
Значимых различий по уровню цитогенетиче-ских повреждений у носителей различных генотипов по гену XRCC4 G1394T выявлено не было.
Кроме того, не было получено значимых различий по частоте лимфоцитов с нуклеоплазменными мостами у носителей различных полиморфных вариантов генов репарации двунитевых разрывов ДНК.
выводы
Носители генотипа Ile/Ile по гену Lig4 Thr9Ile обладают повышенной чувствительностью к воздействию генотоксических факторов в угольных шахтах. Данный ген потенциально может служить маркерным и, наряду с другими генами, быть включенным в биологическую тест-систему для определения индивидуальной чувствительности шахтеров к комплексу неблагоприятных факторов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Закс Л. (1976) Статистическое оценивание. М.: Статистика.
2. Ингель Ф. И. (2006) Перспективы использования микроядерного теста на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока. Часть I. Пролиферация клеток. Экологическая генетика. Т. 3 (3): С. 7—19.
3. Fenech M. (1993) The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Research. V. 285: P. 35-44.
4. Fenech M. (2000) The in vitro micronucleus technique. Mutation Research. V. 455: P. 81-95.
5. Fenech M., Kirsch-Volders M., Natarajan A. T. et al. (2011) Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. V. 26: P. 125-132.
6. Donbak L., Rencuzogullari E., Yavuz A., Topaktas M. (2005) The genotoxic risk of underground coal miners from Turkey. Mutation Research. V. 588: P. 82-87.
7. Kvitko K., Bandinelli E., Henriques J. et al. (2012) Susceptibility to DNA damage in workers occupationally exposed to pesticides, to tannery chemicals and to coal dust during mining. Genetics and Molecular Biology. V. 35: P. 1060-1068.
8. Leon-Mejia G., Espitia-Perez L., Hoyos-Giraldo L. S. et al. (2011) Assessment of DNA damage in coal opencast mining workers using the cytokinesis-blocked micronucleus test and the comet assay. Science of the Total Environment. V. 409: P. 686-691.
9. Leon-Mejia G., Quintana M., Debastiani R. et al. (2014) Genetic damage in coal miners evaluated by buccal micronucleus cytome assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. V 107: P. 133-139.
10.Rohr P., Kvitko K., da Silva F. R. et al. (2013) Genetic and oxidative damage of peripheral blood lymphocytes in workers with occupational exposure to coal. Mutation Research. V. 758: P. 23-28.
THE ASSESSMENT oF micronucleiIs FREQuENcY
in lymphocytes in the cohort of coal-miners characterized by different polymorphisms of double strand break reparation genes
Sinitsky M. Yu, Volobaev V. P., Asanov M. A.
C SuMMARY: Background: Coal-miners are exposed to a lot of number of harmful factors (chemical agents, ionizing radiation, heavy metals, coal dust etc.). Material and methods: Venous blood samples extracted from 129 coal-miners. Assessment of cytogenetic damage was performed using the cytokinesis-block micronucleus assay (CBMN) on peripheral blood lymphocytes. PCR and gel electrophoresis were used to determine polymorphisms in the genes Lig4 (rs1805388) and XRCC4 (rs6869366). Results: We found a significant increase in the frequency of binucleated lymphocytes with micronuclei (MN) and protrusions in carriers of the Ile/ Ile genotype of the Lig4 gene Thr9Ile polymorphism in comparison to Thr/Thr and Thr/Ile genotypes. Conclusions: Thr9Ile polymorphism within Lig4 gene can be used as potential molecular genetic markers of increased individual susceptibility to the complex of harmful factors in coal-mining conditions.
C KEYwoRDS: cytogenetics; micronucleus assay; coal; genotyping; DNA-reparation.
references (transliterated)
1. Zaks L. (1976) Statisticheskoe otsenivanie [Statistical evaluation]. M.: Statistika.
2. Ingel' F. I. (2006) Perspektivy ispol'zovaniya mik-royadernogo testa na limfotsitakh krovi cheloveka, kul'tiviruemykh v usloviyakh tsitokineticheskogo bloka. Chast' I. Proliferatsiya kletok. Ekologicheskaya gene-tika. T. 3 (3): S. 7-19.
3. Fenech M. (1993) The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Research. V. 285: P. 35-44.
4. Fenech M. (2000) The in vitro micronucleus technique. Mutation Research. V. 455: P. 81-95.
5. Fenech M., Kirsch-Volders M., Natarajan A. T. et al. (2011) Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasms bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. V 26: P 125-132.
6. Donbak L., Rencuzogullari E., Yavuz A., Topaktas M. (2005) The genotoxic risk of underground coal miners from Turkey. Mutation Research. V. 588: P. 82-87.
7. Kvitko K., Bandinelli E., Henriques J. et al. (2012) Susceptibility to DNA damage in workers occupationally
exposed to pesticides, to tannery chemicals and to coal dust during mining. Genetics and Molecular Biology. V. 35: P. 1060-1068.
8. Leon-Mejia G., Espitia-Perez L., Hoyos-Giraldo L. S. et al. (2011) Assessment of DNA damage in coal opencast mining workers using the cytokinesis-blocked mi-cronucleus test and the comet assay. Science of the Total Environment. V. 409: P. 686-691.
9. Leon-Mejia G., Quintana M., Debastiani R. et al. (2014) Genetic damage in coal miners evaluated by buccal micronucleus cytome assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. V. 107: P. 133-139.
10. Rohr P., Kvitko K., da Silva F. R. et al. (2013) Genetic and oxidative damage of peripheral blood lymphocytes in workers with occupational exposure to coal. Mutation Research. V. 758: P. 23-28.
C Информация об авторах
Синицкий Максим Юрьевич — аспирант, биологический факультет, кафедра генетики. ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет». 650043, Кемерово, ул. Красная, д. 6. E-mail: max-sinitsky@rambler.ru.
Волобаев Валентин Павлович — аспирант, биологический факультет, кафедра генетики. ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет». 650043, Кемерово, ул. Красная, д. 6. E-mail: kitsuneoni42@gmail.com.
Асанов Максим Айдарович — студент 5-го курса, биологический факультет, кафедра генетики. ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет». 650043, Кемерово, ул. Красная, д. 6. E-mail: asmaks988@gmail.com.
Sinitsky Maxim Yur'yevich — PhD student, Biology Faculty, Department of Genetics, Kemerovo State University. 650043, Kemerovo, Krasnaya St., 6. E-mail: max-sinitsky@rambler.ru.
Volobaev Valentin Pavlovich — PhD student, Biology Faculty, Department of Genetics, Kemerovo State University. 650043, Kemerovo, Krasnaya St., 6. E-mail: kitsuneoni42@gmail.com.
Asanov Maxim Aydarovich — Student, Biology Faculty, Department of Genetics, Kemerovo State University. 650043, Kemerovo, Krasnaya St., 6. E-mail: asmaks988@gmail.com.
