CC BY
4
ЧАСТОТА ЭКСПРЕССИИ ТИРОЗИНКИНАЗЫ ГЕНА ALK И ОНКОБЕЛКА TAG-72 ПРИ ПЕРВИЧНОЙ МЕЛАНОМЕ КОЖИ
К.С. Титов1, Д.Л. Ротин2, А.М. Казаков3, О.Ю. Михеева1, И.М. Тележникова1, Д.А. Рябчиков4
'ГБУЗ «Московский клинический научный центр ДЗМ»; Россия, 111123 Москва, ш. Энтузиастов, 86; 2ГБУЗ «ГКБ им. С.П. Боткина ДЗМ»; Россия, 123001 Москва, Мамоновский пер., 7; 3ФГБОУВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России; Россия, 117997Москва, ул. Островитянова, 1; ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24
Цель исследования — определить частоту экспрессии тирозинкиназы мутированного гена ALK и онкобелка TAG-72 у пациентов с первичной меланомой кожи, определить их связь с рядом гистологических параметров и оценить диагностическую ценность определения ALK и TAG-72.
Материалы и методы. Для рутинного гистологического исследования материал фиксировали 10 %-ным нейтральным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4—5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование с моноклональными антителами D57.3 к ALK проводилось на иммуностейнере Ventana, с антителами B72.3 к TAG-72 на иммуностейнере Thermo Fischer.
Результаты. ALK-мутация была обнаружена в 7 (12 %), TAG-72 — в 4 случаях из 40. Оценка корреляционной силы между экспрессией ALK и TAG-72 показала прямую среднюю силу связи (коэффициент корреляции составлял 0,31). Была выявлена прямая связь средней силы между наличием у пациента онкомаркера TAG-72, мутации ALK и изъязвлением — коэффициент корреляции составил 0,53 и 0,68 соответственно. Наблюдалась статистически значимая связь между наличием ALK и лим-фоидной инфильтрацией, которая в большинстве случаев была выраженной (p <0,05).
Выводы. Сопоставляя позитив признака экспрессии ALK (17,5 %) и TAG-72 (10 %) и позитив их одновременного обнаружения (7,5 %), можно сделать вывод о том, что дальнейшие исследования по определению их диагностической ценности перспективны. Наличие выраженной лимфоидной инфильтрации у ALK-позитивных пациентов претендует на диагностическое значение при первичной меланоме кожи.
Ключевые слова: меланома, ALK, лимфоидная инфильтрация
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-3-50-54 EXPRESSION RATE OF ALK TYROSINE KINASE AND TAG-72 ONCOPROTEIN IN PRIMARY SKIN MELANOMA
K.S. Titov1, D.L. Rotin2, A.M. Kazakov3, O. U. Micheeva1, I.M. Telezhnikova1 D.A. Ryabchikov4
1Moscow Clinical Scientific Center, Moscow Health Department; 86 Shosse Entuziastov, Moscow 111123, Russia; 2S.P. Botkin City Clinical Hospital, Moscow Health Department; 7Mamonovsky Pereulok, Moscow 123001, Russia; 3N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia; 1 Ostrovityanova St., Moscow 117997, Russia 4N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia
Objective. Determine the frequency of occurrence of tyrosine kinase expression of the mutated ALK and TAG-72 gene among patients with primary melanoma of the skin, to identify their association with a number of histological parameters, and to assess the diagnostic value of the determination of ALK and TAG-72.
Materials and methods. Paraffin blocks with surgical material from 40 patients with primary skin melanoma. For routine histological examination, the material was fixed with 10 % neutralformalin for 24 h, poured into paraffin, sections were prepared with a thickness of 4—5 ^m, stained with hematoxylin and eosin. IHC study with monoclonal antibodies D57.3 to ALK was performed on an immunostender — Ventana, with antibodies B72.3 to TAG-72 — on Thermo Fischer. As a detection system used: Envision — for TAG-72 and Ventana — for ALK. Results. ALK mutation was detected in 7 (12 %), TAG-72 — 4 (10 %) cases. Evaluation of the correlation force between the presence of ALK and TAG-72 showed a direct average coupling strength (correlation coefficient was 0.31). A direct correlation of the mean force between the presence of TAG-72 oncoprotein, ALK mutation and ulceration in the patient was found — the correlation coefficient was 0.53 and 0.68, respectively. There was a statistically significant association between the presence of ALK and lymphoid infiltration, which in most cases (57 %) was pronounced (p <0.05).
Conclusion. Comparing the positive sign of the expression of ALK — 17.5 % and TAG-72 — 10 %, and the positive of their simultaneous detection — 7.5 %, it can be concluded that further studies to determine their diagnostic value are promising. The presence of severe lymphoid infiltration in ALK-positivepatients claims a diagnostic value in primary skin melanoma.
Key words: melanoma, ALK, lymphoid infiltration
Контакты: Алексей Михайлович Казаков hordavii@yandex.ru
Введение
На долю меланомы приходится около 4 % всех форм злокачественных опухолей кожи, однако 80 % смертей в данной группе обусловлено именно мела-номой. Заболеваемость меланомой кожи в России и многих странах мира неуклонно растет: ежегодно на 5 %. За последние 10 лет в нашей стране заболеваемость меланомой кожи увеличилась на 52 %, а смертность — на 18 %. По абсолютному приросту заболеваемости среди всех злокачественных опухолей меланома кожи занимает 2-е место после рака легкого. В России примерно 22 % пациентов с выявленной меланомой кожи на момент первичного обращения к онкологу имеют уже III—IV стадию опухолевого процесса.
На сегодняшний день выявлено множество причин возникновения меланомы кожи, большинство из которых — драйверные мутации в MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) сигнальном пути. К ним относятся перестройки в генах, кодирующих белки RAS, RAF, MEK1/2 и ERK1/2, наиболее часто встречаются мутации RAF и MEK1/2 [1]. Большинство мутантных белков служат мишенями для современной таргетной терапии. Однако не все пациенты с меланомой имеют данные мутации и, соответственно, мишени для таргетной терапии [2]. Для группы пациентов с отсутствием мишеней для использующейся в настоящий момент таргетной терапии, низкой экспрессией рецепторов и прогностически неблагоприятным количественным и качественным составом лимфоидной инфильтрации для успешного применения ингибиторов иммунных контрольных точек [3, 4] необходим поиск иных подходов к лечению, в частности выявление новых точек приложения таргетной терапии.
Одной из таких точек является ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) — мутация, впервые исследованная в других опухолях (немелкоклеточный рак легкого, анапластическая лимфома) и выявляемая при первичной меланоме кожи в 2—8 % случаев [5]. ALK является рецепторной тирозинкиназой из семейства инсулинзависимых рецепторов, состоящей из 3 доменов: экстрацеллюлярного, трансмембранного и интрацеллюлярного [6]. Существует 3 изоформы мутантной ALK: ALKATI, ALK wt, EML4—ALK, различающихся по механизму образования (альтернативный сплайсинг, транслокация соответственно) [7, 8]. Мутантная ALK содержит преимущественно ин-трацеллюлярный домен и обладает повышенной способностью к аутоактивации, что вызывает неконтролируемое деление клеток [9]. Данная мутация может встречаться как отдельно, так и в комбинации с другими мутациями: B-RAF, NRAS (NF1), GNA11, что прогностически неблагоприятно [10]. Этот феномен еще раз подтверждает необходимость опреде-
ления мутации ALK у ряда пациентов, так как инги-бирование одной мутации из нескольких не дает должного результата, приводя к последующему про-грессированию болезни [11]. У пациентов с ALK-позитивной меланомой становится возможным применение ингибиторов ALK, эффективно используемых до этого при метастатическом немелкоклеточном раке легкого и анапластической лимфоме [12]. К данным препаратам относятся энсартиниб, церитиниб, кри-зотиниб, энтректиниб и TAE-684 [13, 14]. Новейшие исследования показали эффективность ингибиторов ALK при терапии EML4 — ALK позитивной меланомы кожи in vitro и in vivo. Запущено исследование эффективности данных препаратов при лечении ряда опухолей, в том числе меланомы NCT02097810. Изоформы ALK wt и ALKATI, согласно результатам последних исследований, нечувствительны к ингибиторам ALK [15].
Актуальна в настоящее время и проблема дифференциальной диагностики первичной меланомы кожи, поэтому поиск новых маркеров меланомы также заслуживает внимания. Одним из возможных диагностических маркеров меланомы является Tumor associated protein-72 (TAG-72), активно изучающийся при таких онкологических заболеваниях, как рак яичника, рак желудка и рак легкого, и также претендующий на диагностическое и прогностическое значение при первичной меланоме кожи [16]. Очевидно, что выявление ALK и TAG-72 у пациентов с мелано-мой кожи в будущем может играть важную роль при выборе метода лечения, а также дифференциальной диагностики и прогнозирования исхода заболевания.
Материалы и методы
В работе использовались парафиновые блоки с операционным материалом от 40 пациентов с первичной меланомой кожи, проходящих лечение в Московском клиническом научном центре с 20 июля 2015 г. по 26 сентября 2016 г. (мужчин — 15, женщин — 25) медиана возраста — 64 года.
В качестве методов исследования применялись гистологическое исследование, морфологический анализ, иммуногистохимическое исследование, статистическая обработка результатов. Оцениваемые признаки морфологического анализа: гистологический тип, толщина по Бреслоу, уровень инвазии по Кларку, изъязвление, степень выраженности лимфо-идной инфильтрации, митотический индекс. Для рутинного гистологического исследования материал фиксировали 10 %-ным нейтральным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4—5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином. Анализ экспрессии тирозинкиназы ALK и онкобелка TAG-72 проводился иммуногистохими-ческим методом на срезах, изготовленных с тех же
рис. 1. Выраженная очаговая ядерно-цитоплазматическая положительная экспрессия ALK в клетках опухоли (х 200). Мутантный белок был окрашен моноклональными антителами D57.3
рис. 2. Умеренная очаговая цитоплазматическая положительная экспрессия ALK в клетках опухоли (х 200). Мутантный белок был окрашен моноклональными антителами D57.3
блоков. Иммуногистохимическое исследование с мо-ноклональными антителами D57.3 к ALK проводилось на иммуностейнере Ventana, с антителами B72.3 к TAG-72 — на Thermo Fischer. В качестве системы детекции использовали: Envision для TAG-72 и Ventana для ALK. Оценку статистической значимости результатов исследования выполняли путем вычисления коэффициента корреляции методом рангов.
Результаты и обсуждение
ALK-мутация обнаружена в 7 (17,5 %) (рис. 1, 2), TAG-72 — в 4 (10 %) случаях (см. таблицу). Мы провели оценку коэффициента корреляции между наличием ALK и TAG-72, которая показала прямую среднюю силу связи (коэффициент корреляции составил 0,31). Также была выявлена прямая связь средней силы между наличием у пациента онкомаркера
Характеристика морфологических параметров и степени выраженности лимфоидной инфильтрации у пациентов с обнаруженной экспрессией ALK и TAG-72
возраст пациен- Пол паци- ALK TAG-72 локализация кларк Бреслоу митоти-ческий лимфоцитарная инфильтрация изъязвление Гистологический тип опухоли
та, лет ента индекс опухоли
65 Ж + Верхняя конечность и плечевой 3 1,1 <1/мм2 Умеренная Нет Узловая эпителиоид-но-клеточная меланома
пояс
63 Ж + + Нижняя конечность 4 5 >1/мм2 Нет Есть Узловая эпителиоид-но-клеточная пигментная меланома
65 М + + Корпус 3 4 >1/мм2 Выраженная Есть Узловая эпителиоид-но-клеточная пигментная меланома
67 М + - Корпус 4 4 >1/мм2 Выраженная Есть Узловая эпителиоид-но-клеточная пигментная меланома
48 Ж + - Корпус 4 1 <1/мм2 Выраженная Есть Поверхностно распространяющаяся эпителио-идно-клеточная меланома
68 Ж + + Верхняя конечность и плечевой пояс 2 1 <1/мм2 Умеренная Есть Поверхностно распространяющаяся эпителио-идно-клеточная пигментная меланома
89 Ж + - Голова/шея 5 6 >1/мм2 Выраженная Есть Узловая эпителиоид-но-клеточная пигментная меланома
33 М - + Голова/шея 2 1 >1/мм2 Выраженная Есть Поверхностно распространяющаяся эпителио-идно-клеточная меланома
TAG-72, мутации ALK и изъязвлением — коэффициент корреляции составил 0,53 и 0,68 соответственно. Наблюдалась статистически значимая связь между наличием ALK и лимфоидной инфильтрации, которая в большинстве случаев была выраженной (p <0,05). Корреляция между наличием ALK, TAG-72 и другими морфологическими параметрами не выявлена.
Заключение
Несмотря на наличие корреляции средней силы связи между рядом параметров, стоит отметить, что для более достоверных выводов необходимо дальнейшее исследование данной проблемы с увеличением когорты. Однако на данном этапе, сопоставляя наличие экспрессии ALK (17,5 %) и TAG-72 (10 %) и их одновременное обнаружение (7,5 %), можно
сделать вывод о том, что дальнейшие исследования по определению их диагностической ценности представляются перспективными. Наличие корреляционной связи средней силы между изъязвлением, с одной стороны, и наличие онкомаркера и мутант-ной киназы с другой, также говорит о потенциальной ценности данного явления для усовершенствования диагностики первичной меланомы кожи. Наличие выраженной лимфоидной инфильтрации у ALK-по-зитивных пациентов претендует на диагностическое значение при первичной меланоме кожи.
Наше исследование показывает перспективность определения ALK и TAG-72, поскольку в совокупности с дальнейшими исследованиями определение данных параметров может улучшить диагностику и лечение пациентов с первичной ме-ланомой кожи.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Evans M.S., Madhunapantula S.V., Robertson G.P., Drabick J.J. Current and Future Trials of Targeted Therapies in Cutaneous Melanoma. Adv Exp Med Biol 2013;779:223-55. DOI: 10.1007/97 8-1-4614-6176-0_10. PMID: 23288642.
2. Dhomen N., Marais R. BRAF signaling and targeted therapies in melanoma. Hematol Oncol Clin North Am 2009;23(3):529-45. PMID: 19464601.
3. Jazirehi A.R., Lim A., Dinh T. PD-1 inhibition and treatment of advanced melanoma-role of pembrolizumab. Am J Cancer Res. 2016;6(10):2117-28. PMID: 27822406.
4. Titov K.S., Chikileva I.O., Kiselevskiy M.V., Kazakov A.M. Lymphoid infiltration, as a predictor of successful immunotherapy with melanoma. Malignant Tumors 2017;1:61-6. DOI: 10.18027/ 2224-5057-2017-1-61-66.
5. Yeh I. Recent advances in molecular genetics of melanoma progression: implications for diagnosis and treatment. Department of Dermatology, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA. 2016, Jun 28; 5. (F1000FacultyRev):1529.
DOI: 10.12688/f1000research. 8247.1 PMID: 27408703.
6. Roskoski R.Jr. Anaplastic lymphoma kinase (ALK) inhibitors in the treatment of ALK-driven lung cancers. Pharmacol
Res 2017;117:343-56.
DOI: 10.1016/j.phrs.2017.01.007.
PMID: 28077299.
7. Montavon G., Jauquier N., Coulon A. et al. Wild-type ALK and activating ALK-R1275Q and ALK-F1174L mutations upregulate Myc and initiate tumor formation in murine neural crest progenitor cells. Oncotarget 2014;5:4452-66. PMID: 24947326. PMCID: PMC4147337.
8. Takezawa K., Okamoto I., Nishio K. et al. Role of ERK-BIM and STAT3-survivin signaling pathways in ALK inhibitor-induced apoptosis in EML4-ALK-positive lung cancer. Clin Cancer Res 2011;17(8):2140-8.
PMID: 21415216.
9. Lemmon M.A., Schlessinger J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell 2010;141:1117-34. DOI: 10.1016/j. cell.2010.06.011. PMID: 20602996.
10. Busam K.J., Villain R.E., Lum T. et al. Primary and metastatic cutaneous melanomas express ALK through alternative transcriptional initiation. Am J Surg Pathol. 2016;40(6):786-95. PMID: 26872010.
PMCID: PMC5037961.
11. Sosman J.A., Margolin K.A. Inside life of melanoma cell signaling, molecular insights, and therapeutic targets. Curr Oncol Rep. 2009;11(5):405-11. PMID: 19679016.
12. Obenauf1 A.C., Zou Y., Ji A.L. et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature 2015;520(7547): 368-72. DOI: https://doi.org/10.1038/ nature14336.
13. Schulte J.H., Bachmann H.S., Brockmeyer B. et al. High ALK receptor tyrosine kinase expression supersedes ALK mutation as a determining factor of an unfavorable phenotype in primary neuroblastoma. Clin. Cancer Res 2011;17:5082-92.
PMID: 21632861.
14. Cheng D.T., Mitchell T.N., Zehir A. et al. Memorial sloan kettering-integrated mutation profiling
of actionable cancer targets (MSK-IMPACT): a hybridization capture-based nextgeneration sequencing clinical assay for solid tumor molecular oncology. J.Mol. Diagn 2015;17:251-64. PMID: 25801821.
15. Couts K.L., Bemis J., Turner J.A. et al. ALK Inhibitor response in melanomas expressing eml4-alk fusions and alternate ALK isoforms. Mol Cancer Ther. 2018;17(1):222-3. PMID: 29054983.
16. Deo Y.M., Tibor K. Bispecific molecules directed to tumor associated glycoprotein-72 and fc receptor. 1997. Pub. No.:WO/1999/019362 International Application No.: PCT/us 1997/018428.
ORCID авторов / ORCID of authors
А.М. Казаков / A.M. Kazakov: https://orcid.org/0000-0002-9534-2729
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
