CC BY
48
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 11 No. 4 2015, pp. 128-136 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 by Itskovich, Shigarova, Glyzina, Kaluzhnaya, Kupchinsky and Borovskii
ORIGINAL ARTICLE
Changing of the HSP70 Content in the Baikal Endemic Sponges Lubomirskiidae Under Conditions of
Hyperthermia
Itskovich V.B.1, Shigarova A.M.2, Glyzina O.Y.1, Kaluzhnaya O.V.1, Kupchinsky A.B.1, Borovskii G.B.2
1 Limnological Institute of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Ulan-Batorskaya 3, P.O. Box 278, 664 033, Irkutsk, Russia.
2 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, Lermontova 132, P.O. Box 317, 664033, Irkutsk, Russia
*E-Mail: [email protected]
Received November 15, 2015
Baikal endemic sponges (Lubomirskiidae) make up the bulk of the benthos biomass of the lake. For the first time the changes in the content of HSP70 in response to elevated environment temperature were analyzed in three endemic species of Baikal sponges: Baikalospongia bacillifera (Dybowski, 1880), B. intermedia (Dybowski, 1880) and Swartschewskia papyracea (Dybowski, 1880). Interspecific variability of constitutive HSP70 level was revealed for representatives of the three analyzed Lubomirskiidae species. After exposure at 13 °С for 3 and 7 days opposite changes were noted in the amount of HSP70. Under conditions of hyperthermia the protein level decrease at Baikalospongia species, while at the S. papyracea HSP70 content slightly increased. The differences in the mechanisms of stress adaptation probably affect the thermal resistance of the species, as well as are evidence supporting their specific status.
Key words: Porifera, Baikal, Lubomirskiidae, hyperthermia, HSP70
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
129
Changing of the HSP70 Content in the Baikal Endemic Sponges...
Губки (Porifera) - самые примитивные многоклеточные животные, которые являются доминирующей частью биомассы бентоса многих водоемов, в том числе озера Байкал (Webster & Taylor 2012). Являясь сидячими биофильтраторами, губки играют большую роль в процессах естественной очистки воды, и могут использоваться как биоиндикаторы оценки состояния окружающей среды. Эндемичное семейство Lubomirskiidae является доминирующим в Байкале по количеству видов, обитает на всех глубинах озера и представлено 13 видами и одним подвидом (Efremova, 2001, 2004). Известно, что одним из базовых механизмов стресс-адаптации (в том числе и к высокой температуре) на клеточном уровне является синтез стрессовых белков, который индуцируется широким кругом стрессовых воздействий, такими как экстремальные температуры, токсический и окислительный стрессы и др. (Kolesnichenko, Voinikov, 2003). Белки теплового шока, в том числе и БТШ70, играют центральную роль в развитии устойчивости организмов к повышенным температурам, обеспечивая выживание клеток в течение и после теплового стресса (Parsell, Lindquist, 1993). В процессе стрессового воздействия белки теплового шока участвуют во внутриклеточном транспорте и денатурации-ренатурации белков (Feder, Hofmann, 1999). Эти белки также являются индикаторами стресса, поскольку трансляционная и транскрипционная активность их синтеза индуцируется экстремальными температурами, ультрафиолетовой радиацией и присутствием
тяжелых металлов (Kultz, 2005).
У губок экспрессия БТШ70 может быть вызвана тепловым или осмотическим шоком, рН стрессом, тяжелыми металлами и фенолами (Schroder et al., 1999, 2006). Динамика БТШ70 у морских губок изучалась в связи с проблемами теплового стресса вызванного глобальным потеплением (Lopez-Legentil et al., 2008; Webster et al., 2013). Была показана связь нескольких случаев массовой гибели губок с повышением температуры, что определяется узкими границами их температурного оптимума (Vicente, 1989; Cerrano et al., 2000; Cebrian et al., 2011; Webster et al., 2013). В геммулах пресноводной губки Spongilla lacustris было обнаружено повышенное содержание БТШ70, что позволяет клеткам стабилизировать белки и мембраны при изменениях температуры среды (Shill et al., 2006). В первом мониторинговом исследовании биомаркеров стресса было показано, что БТШ70 экспрессируется у эндемичных байкальских губок при тепловом и химическом стрессе (Efremova et al., 2002; Schroder et al., 2006). Проведенные ранее исследования показали также, что сточные воды Байкальского целлюлозно-бумажного комбината вызывают у байкальских губок повышенную экспрессию БТШ70 (Efremova et al., 2002; Schroder et al., 2006), однако данные о температурном оптимуме Lubomirskiidae отсутствуют. В свете последних экологических изменений экосистемы озера Байкал, количественная оценка стресс-индуцируемых белков необходима, чтобы
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
Itskovich et al.
130
идентифицировать ранние биомаркеры стресса.
Целью работы являлось изучение особенностей изменения содержания белков теплового шока семейства БТШ70 у трех эндемичных видов байкальских губок: Baikalospongia bacillifera
(Dybowski, 1880), B. intermedia (Dybowski, 1880) и Swartschewskia papyracea (Dybowski, 1880) в условиях гипертермии.
MATERIALS AND METHODS
Губки были собраны в Южном Байкале (п. Листвянка) на глубине 15 метров в июле 2014 года (рис.1). Сразу после доставки в лабораторию образцы были помещены в аквариумы с байкальской водой (10 л) и содержались при температуре 4 °С и 12 часовом световом режиме, постоянной аэрации и ежедневной замене одной трети воды. Видовая идентификация образцов была проведена на основе микроскопического анализа спикул и скелета согласно ранее описанным методикам (Efremova, 2001). Температура стрессирования была выбрана на основе данных об изменении жирнокислотного состава у Lubomirskia baicalensis после культивирования в аквариуме при повышенных температурах (Glyzina, Glyzin, 2014). После периода адаптации губки были помещены в аквариумы с температурой 13 °С на 3 и 7 суток. Для S. papyracea пробы после трех суток экспозиции не фиксировали из-за мелких размеров губок. По окончании времени экспозиции образцы были помещены в кельвинатор (-70 °С).
Общий белок выделяли по ранее описанному методу (Voinikov et al., 1986). Концентрацию белка
в пробах определяли с помощью Quant-iT™ Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). По 30 мкг белка каждой пробы разделяли
электрофоретически в 12% SDS-PAGE (Laemmli, 1970), далее белок переносили на нитроцеллюлозную мембрану в системе miniProtean III (Bio-Rad, USA) по прилагаемой инструкции. БТШ70 детектировали с помощью антител, как было описано ранее (Timmons, Dunbar, 1990). Использовали первичные антитела против Hsp70 (Cat. No H5147 Sigma, USA). Антитела визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой (Sigma, USA). Интенсивность окрашивания пятен определяли с помощью программы Gel Analysis (Россия) (усл. ед) и выражали как процент от интенсивности окрашивания пятна данного белка в контроле (или в первом образце на рисунках). Для сравнения интенсивности окрашивания пятен использовали не менее трех типичных мембран для каждого варианта опыта. Приведены средние значения суммарной интенсивности пятна и их стандартные отклонения.
RESULTS AND DISCUSSION
При анализе уровня конститутивного синтеза БТШ70 в пробах трех видов губок при 4 °С выявлены значимые различия между видами (рис.1). Наибольший уровень БТШ70 выявлен у B. intermedia, более низкий у B. bacillifera (68% по сравнению с B. intermedia), самый низкий уровень синтеза белка выявлен у S. papyracea (39% по сравнению с B. intermedia) (рис.2). Межвидовая
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
131
Changing of the HSP70 Content in the Baikal Endemic Sponges...
вариабельность по содержанию конститутивного снижение содержания БТШ70 у B. bacillifera при
БТШ70 описана для многих морских и повышении температуры до 13 °С, сохраняющееся
пресноводных организмов (Henkel et a/., 2009; на протяжении 7 суток, может указывать на
Garbuz et a/., 2011), в частности для организмов угнетение метаболизма, деградацию стрессовых
Байкала (Timofeyev et al., 2009; Bedulina et a/., белков, а также переключение с аэробного на
2013). Уровень конститутивного синтеза БТШ70 менее эффективный анаэробный метаболизм
связан с резистентными способностями вида. Так, (Geret et al., 2002 ; Sokolova, Portner, 2003; Axenov-
у термочувствительных видов амфипод уровни Gribanov et al., 2012). В отличие от представителей
конститутивного синтеза БТШ70 в несколько раз рода Baikalospongia у S. papyracea выявлена
снижены по сравнению с термоустойчивыми тенденция к повышению уровня синтезируемого
видами (Timofeyev et al., 2009; Bedulina et al., БТШ70 (на 15% по сравнению с контролем).
2013). Уровень конститутивного синтеза БТШ70 Функциональной причиной увеличения количества
определяет различия в механизмах стрессового БТШ70 у S. papyracea, вероятно, является
ответа, что и было выявлено нами при анализе необходимость компенсации стрессового
динамики изменений количества белка у губок воздействия, вызванного повышением температуры
после стрессового воздействия повышенной выше оптимальных для данного вида значений.
температурой 13 °С. Ефремовой с соавторами было показано, что
После экспозиции при температуре 13 °С в повышение температуры окружающей среды до 20
течение 3 и 7 суток были отмечены °С вызывает увеличение количества БТШ70 у трех
разнонаправленные изменения в количестве видов байкальских губок включая B. intermedia
БТШ70 у трех проанализированных видов (Efremova et al., 2002), однако данные о
Lubomirskiidae. После трех суток экспозиции при температурном оптимуме Lubomirskiidae
13 °С уровень белка у B. intermedia остался отсутствуют. Согласно нашим данным, повышение
практически на прежнем уровне (97% по температуры окружающей среды до 13 °С может
сравнению с контролем при 4 °С), в то время как у вызывать изменения в содержании БТШ70 и
B. bacillifera количество БТШ70 уменьшилось в два возможно влияет на стабильность других
раза по сравнению с количеством белка при 4 °С. показателей клеточного метаболизма у
Через семь суток экспозиции при гипертермии Lubomirskiidae. Этот факт указывает на возможную
уровень БТШ70 у B. intermedia незначительно связь зафиксированного явления обесцвечивания
снизился (до 91% от контроля), тогда как у B. (Kaluzhnaya, Itskovich, 2015) и массовой гибели
bacillifera остался почти на том же уровне, как и байкальских губок в последние годы с
после трех суток экспозиции (37% по сравнению с повышением среднегодовых температур. Известно,
контролем при 4 °С) (рис.2). Выявленное значимое что морские губки имеют узкий температурный
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
Itskovich et al.
132
оптимум, при этом была показана связь нескольких случаев массовой гибели губок с климатическими изменениями (Vicente, 1989; Cerrano et al., 2000; Cebrian et al., 2011; Webster et al., 2013). Выявленная избирательная поражаемость
Особенности механизмов стресс-регуляции у разных видов, как правило, коррелируют с температурными условиями существования вида. Однако исследованные нами виды обитают в сходном температурном, но различном световом режимах. Виды B. bacillifera, B. intermedia и S. papyracea населяют литоральную и
синдромом обесцвечивания представителей различных видов Lubomirskiidae (Itskovich et al., unpubl.), возможно, также связана с межвидовыми различиями в их терморезистентности.
Figure 1. Губки Baikalospongia intermedia и papyracea.
Lubomirskiidae. a-bacillifera, b-B. c- Swartschewskia
сублиторальную зоны на глубинах от 1,5 до 400 метров (Efremova, 2001). Температура глубинных вод Байкала постоянна и составляет около 4 °С, в то время как в зоне верхней литорали (до 20 м глубины) возможны сезонные и суточные повышения температуры до 14-20 °С (Kozhova, Izmest’eva, 1998). S. papyracea имеет отличие в
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
133
Changing of the HSP70 Content in the Baikal Endemic Sponges...
световом режиме среды обитания от B. bacillifera и B. intermedia, поскольку населяет отрицательные склоны скал и камней. Вследствие недостатка света S. papyracea всегда имеет светлую окраску из-за отсутствия симбиоза с фотосинтезирующими
микроорганизмами, в то время как виды Baikalospongia на глубинах, доступных свету, имеют зеленую окраску. Влияние симбиотического состава на стресс-устойчивость губок требует дополнительных исследований.
Figure 2. Изменение уровня белка БТШ70 у байкальских губок после экспозиции при повышенной температуре среды (13 °С) в течение 3 и 7 суток. B.bac.-Baikalospongia bacillifera, B.int.-B. intermedia, S.pap.-Swartschewskia papyracea.
Выявленное несоответствие морфологических и молекулярных данных делает актуальной проблему определения границ видов внутри Lubomirskiidae (Itskovich et a/., 2008). Наиболее перспективным подходом на сегодня является интегративная таксономия, использующая все имеющиеся наборы морфологических, молекулярных, биохимических и экологических данных. Молекулярный анализ на сегодня не поддерживает монофилетичность B.bacillifera и B. intermedia (Itskovich et al., 2015). Однако выявленные нами различия в механизмах стресс-адаптации, вероятно, свидетельствуют в
поддержку их видового статуса.
ACKNOWLEDGMENT
Работа выполнена в рамках госбюджетной темы № VI.50.1.4. «Молекулярная экология и эволюция живых систем Центральной Азии на примере рыб, губок и ассоциированной с ними микрофлоры» при частичной поддержке грантов РФФИ № 14-04-00838А, 14-44-04165р_сибирь_а (совместного с правительством Иркутской области).
REFERENCES
Axenov-Gribanov D.V., Lubyaga JA, Shakhtanova
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
Itskovich et al.
134
N.S., Gurkov A.N., Bedulina D.S., Shatilina Zh. М., Kondratyeva Е.М., Vereshchagina K.P., Timofeyev М.А. (2012) Determination of Lake Baikal endemic amphipod Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf., 1858) thermal optima limits by changes in its metaboliс markers. JSPB, 8(4), 289-301.
Bedulina D.S., Evgen'ev M.B., Timofeyev M.A., Protopopova M.V., Garbuz D.G., Pavlichenko V.V., Luckenbach T., Shatilina Z.M., Axenov-Gribanov D.V., Gurkov A.N., Sokolova I.M., Zatsepina O.G. (2013) Expression patterns and organization of the hsp70 genes correlate with thermotolerance in two congener endemic amphipod species (Eulimnogammarus cyaneus and E. verrucosus) from Lake Baikal. Mol. Ecol., 22(5). DOI:10.1111/mec.12136
Cebrian E., Uriz M.J., Garrabou J., Ballesteros E. (2011) Sponge mass mortalities in a warming Mediterranean Sea: are cyanobacteria-
harboring species worse off? PLoS One, 6, e20211.
Cerrano C., Bavestrello G., Bianchi C.N., Cattaneovietti R., Bava S., Morganti C., Morri C., Picco P., Sara G., Schiaparelli S., Siccardi A., Sponga F. (2000) A catastrofic mass-mortality episode of gorgonians and other organisms in the Ligurian Sea (North-Western Mediterranean), summer 1999. Ecol. Lett., 3, 284-293.
Efremova S.M. (2001) Sponges (Porifera). In Timoshkin, O.A. (ed.), Index of animal species
inhabiting lake Baikal and its catchment area, vol. 1. Lake Baikal, Book 1. Nauka, Novosibirsk, pp. 182-192. (in Russian).
Efremova S., Margulis B., Guzhova I., Itskovich V., Lauenroth S., MCiller W., Schroder H. (2002) Heat shock protein Hsp70 expression and DNA damage in Baikalian sponges exposed to model pollutants and wastewater from Baikalsk Pulp and Paper Plant. Aquat. Toxicol., 57, 267-280.
Efremova S.M. (2004) New genus and new species of sponges from family Lubomirskiidae Rezvoj, 1936. In Timoshkin, O.A. (ed.), Index of animal species inhabiting lake Baikal and its catchment area, vol. 1. Lake Baikal, Book 2. Nauka, Novosibirsk, pp. 1261-1278. (in Russian).
Feder M.E., Hofmann G.E. (1999) Heat-shock proteins, molecular chaperones and the stress response: evolutionary and ecological
physiology. Annu. Rev. Physiol., 61, 243-282.
Garbuz D.G., Yushenova I.A., Zatsepina O.G. Przhiboro A.A, Bettencourt B.R, Evgen'ev M.B. (2011) Organization and evolution of hsp70 clusters strikingly differ in two species of Stratiomyidae (Diptera) inhabiting thermally contrasting environments. BMC Evol. Biol., 11(74). DOI:10.1186/1471-2148-11-74
Geret F., Serafim A., Barreira L., Bebianno M.J. (2002) Effect of cadmium on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in the gills of the clam Ruditapes decussates. Biomarkers, 7(3), 242-256.
Glyzina O.Yu., Glyzin A.V. (2014) Biochemical
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
135
Changing of the HSP70 Content in the Baikal Endemic Sponges...
adaptation of Lubomirskia baicalensis Baikal sponge to changes in temperature conditions of the environment. Water: chemistry and ecology,
I, 71-79.
Henkel S. K., Kawai H. and Hofmann G. E. (2009) Interspecific and interhabitat variation in hsp70 gene expression in native and invasive kelp populations. MEPS, 386, 1-13.
Kaluzhnaya O.V., Itskovich V. B. (2015) Bleaching of Baikalian sponge affects the taxonomic composition of symbiotic microorganisms. Rus.
J. Genetics, 51(11), 1153-1157.
Kolesnichenko A.B., Voinikov V.K. (2003) Belki
nizkotemperaturnogo stressa rastenij, Art-press, Irkutsk, 196 p. (in Russian).
Kozhova O.M., Izmest'eva L.R. (1998) Lake Baikal -Evolution and Biodiversity. Backhuys, Leiden.
KCltz D. (2005) Molecular and evolutionary basis of the cellular stress response. Annu. Rev. Physiol., 67, 225-257.
Laemmli U.K. (1970) Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.
Lopez-Legentil S., Song B., McMurray S. E., Pawlik J. R. (2008) Bleaching and stress in coral reef ecosystems: hsp70 expression by the giant barrel sponge Xestospongia muta. Mol. Ecol., 155(17), 159-171.
Parsell D.A., Lindquist S. (1993) The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Annu. Rev. Genet. 27, 437-496.
Schill R.O., Pfannkuchen M., Fritz G., Kohler H-R., BrCmmer F. (2006) Quiescent gemmules of the freshwater sponge, Spongilla lacustris (Linnaeus, 1759), contain remarkably high levels of Hsp70 stress protein and hsp70 stress gene mRNA. J. Exp. Zool. A Comp. Ex.p Biol., 305(5), 449-57.
Schroder H.C., Hassanein H.M., Lauenroth S., Koziol C., Mohamed T.A., Lacorn M., Steinhart H., Batel R., MCiller W.E.G. (1999) Induction of DNA strand breaks and expression of HSP70 and GRP78 homolog by cadmium in the marine sponge Suberites domuncula. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 36(1), 47-55.
Schroder H.C., Efremova S., Margulis B., Guzhova I.V., Itskovich V.B., MCiller W.E.G. (2006) Stress response in Baikalian sponges exposed to pollutants. Hydrobiologia, 568(1), 277-287.
Sokolova I.M., Portner H.O. (2003) Metabolic plasticity and critical temperatures for aerobic scope in a eurythermal marine invertebrate (Littorina saxatilis, Gastropoda: Littorinidae) from different latitudes. J. Exp. Biol., 206(1), 195-207.
Timmons T.M., Dunbar B.S. (1990) Protein Blotting and Immunodetection. Meth. in Enzymol., 182, 679-688.
Timofeyev M.A., Shatilina Z.M., Protopopova M.V., Bedulina D.S., Pavlichenko V.V., Kolesnichenko A.V., Steinberg C.E.W. (2009) Thermal stress defense in freshwater amphipods from contrasting habitats with emphasis on small heat
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
Itskovich et al.
136
shock proteins (sHSPs). J. Therm. Biol., 3(4), 281-285.
Vicente V.P. (1989) Regional commercial sponge extinction in the West Indies: are recent climatic changes responsible? Mar. Ecol. Prog. Ser., 10, 179-191.
Webster N.S., Taylor M.W. (2012) Marine sponges and their microbial symbionts: love and other relationships. Environ. Microbiol., 14, 335-346.
Voinikov V.K., Ivanova G.G., Korytov M.V. (1986) Sintez belkov v rasteniyah pri dejstvii nizkoj temperatury. Fiziol. i bioh. kul't. Rastenij., 18(3), 211-222 (in Russian).
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015
