Cellular metabolic activity as a marker of cytotoxicity and immunotropicity of probiotics’ derivatives Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Regulatory Mechanisms

in Biosystems

Regulatory Mechanisms

in

Biosystems

A

ISSN 2519-8521 (Print) ISSN 2520-2588 (Online) Regul. Mech. Biosyst., 9(2), 223-228 doi: 10.15421/021833

Cellular metabolic activity as a marker

of cytotoxicity and immunotropicity of probiotics' derivatives

O. V. Knysh*, O. Y. Isayenko*, O. V. Falko**, Y. M. Babych*, V. Y. Prokopyuk**, O. S. Prokopyuk**, M. S. Pogorila*

*SI "I. I. Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of National Academy of Medical Sciences of Ukraine", Kharkiv, Ukraine

**Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine, National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, Ukraine

Knysh, O. V., Isayenko, O. Y., Falko, O. V., Babych, Y. M., Prokopyuk, V. Y., Prokopyuk, O. S., & Pogorila, M S. (2018). Cellular metabolic activity as a marker of cytotoxicity and immunotropicity of probiotics' derivatives. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 9(2), 223-228. doi:10.15421/021833

Structural components of cells and metabolites of probiotics with biologically active potential, along with the study of effectiveness, require a series of tests to ensure their safety. The study aims to test the cytotoxicity and potential of structural and metabolic derivatives of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus reuteri to affect the immunocompetent cells using in vitro tests that characterize the metabolic activity of test-cells. Structural components of probiotic bacteria were obtained by the physical method of disintegration - cyclic freezing-thawing. Metabolic derivatives were obtained by cultivation of producers - bifidobacteria and lactobacilli in their own disintegrates. Cultures of mouse embryonic fibroblasts and splenocytes were used as the test cells. MTT and Alamar Blue® were used as redox indicators. According to the MTT test, filtrates that contain structural and metabolic derivates at a concentration of 5% and 10% in the incubation medium did not cause significant changes in the metabolic activity of the embryonic mouse fibroblasts. An increase of up to 20% of content in the incubation medium of filtrates of lactobacilli disintegrates led to a reduction of metabolic activity of test cells by 52.7 ± 6.2%, of filtrates of bifidobacteria disintegrates - by 26.5 ± 6.5%, of filtrates of lactobacterium culture - by 15.7 ± 6.9%, of filtrates of bifidobacterium cultures - by 40.4 ± 6.8%. According to the Alamar Blue® test, filtrates that contained only structural derivatives of lactobacilli and bifidobacteria at concentrations of 5% and 10%, as well as filtrates that contained a complex of structural and metabolic derivatives at a concentration of 5%, did not cause significant changes in the reducing ability of mouse splenocytes. At concentrations of 10%, filtrate containing a complex of structural and metabolic derivatives of lactobacilli, caused the inhibition of metabolic activity of splenocytes by 14.6 ± 3.5%, and bifidobacteria - by 10.0 ± 2.8%. With the contents of the incubation medium at 20% concentration, the filtrate of the disintegrates of lactobacilli decreased the metabolic activity of splenocytes by 12.2 ± 3.0%, and the filtrate of lactobacillus cultures that were grown on their own disintegrates - by 43.2 ± 3.3%. Increasing the content of the disintegrate filtrate and the bifidobacteria culture that were grown on their own disintegrates in the culture medium by up to 20% led to a decrease the metabolic activity of splenocytes by 38.0 ± 2.0%. Thus, the research has shown: the orientation of changes in cellular metabolism under the influence of the studied biologically active derivatives is similar in all model systems, and their intensity depends on the type of test cells, regenerative substrates and concentration of the agent of influence in model systems. The obtained results stimulate further exploration of the immunotropicity of the investigated derivatives of probiotic bacteria and can be used for development of new immunobiological preparations.

Keywords: metabolic activity; proliferation of lymphocytes; mouse embryonic fibroblasts; mouse splenocytes

Article info

Received 29.03.2018 Received in revised form

03.05.2018 Accepted 11.05.2018

SI "I. I. Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of National Academy of Medical Sciences of Ukraine ", Pushkins'ka st., 14/16, Kharkiv, 61057, Ukraine. Tel.: +38-068-210-47-10. E-mail: knysh_oksana@ukr.net

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine, National Academy of Sciences of Ukraine, Pereyaslavs 'ka st., 23, Kharkiv, 61015, Ukraine.

Метаболiчна актившсть клггин як маркер цитотоксичносл та iмунотропностi деривалв пробютиюв

О. В. Книш*, О. Ю. 1саенко*, О. В. Фалько**, С. М. Бабич*, В. Ю. Прокопюк**, О. С. Прокопюк**, М. С. Погорша*

*Державна установа «1нститут мкробюлоги та iмунологii iм. 1.1. Мечникова Нацюнально'1' академи медичних наук Украти», Хартв, Украта

**1нститут проблем крюбюлоги та крюмедицини Нацiональноi академи наук Украти, Харюв, Украта

Струкгурш компоненти клггин i метаболии пробютиюв, що володтоть бюлопчно активним потенщалом, поряд iз дослщженням ефективносп вимагають проведення низки випробувань безпечносп 1х застосування. Вивчали цитотоксичнють та потентнють до впливу

Regul. ЫееЬ. 9(2) 223

на Тмунокомпетентш клпини структурних i метаболпних дериватiв Bifidobacterium bifidum i Lactobacillus reuteri за допомогою теспв in vitro, що характеризують мeтаболiчну актившсть клiтин. Структурш компоненти пробiотичних бактерш отриманi методом фГзичж» дезштеграци - цикшчного заморожування- вiдiгрiвання. Мeтаболiтнi похгдш одeржанi шляхом культивування продyцeнтiв (бТфщобактерш та лактобактeрiй) у власних дезштегратах. Культури eмбрiональних фiброблаcтiв i спленоцшгв мишей викориcтанi як тecт-клiтини, а МТТ та Alamar Blue® - редокс-шдикатори. За даними МТТ-тесту, фТльтрати, що мicтять cтрyктyрнi та метаболита деривати, за умови вмicтy в ceрeдовищi шкубаци в концентраци 5% та 10%, не викликають суттевих змiн метаболТчно'1 активноcтi eмбрiональних фiброблаcтiв мишi. Збiльшeння вмicтy в шкубацшному ceрeдовищi фiльтратiв дeзiнтeгратiв лактобактeрiй до 20% знижуе мeтаболiчнy активнicть тест-кштин на 52,7 ± 6,2%, фшьтрапв дeзiнтeгратiв бiфiдобактeрiй - на 26,5 ± 6,5%, фiльтратiв культур лактобактерш - на 15,7 ± 6,9%, фшьтрапв культур бiфiдобактeрiй - на 40,4 ± 6,8%. За даними Alamar В1ие®-тесту, фiльтрати, що мютять лише cтрyктyрнi деривати лакто- та бiфiдобактeрiй, у концентраци 5% та 10%, а також фшьтрати, що мютять комплекс структурних i метаболггних деривапв у концентраци 5%, не спричиняють значних змш вадновлювальж» здатносп спленоци-пв мишг За концентраци 10% фшьтрати, що мютять структурш та метаболита деривати лактобактeрiй, викликають пригшчення метаболТчно'1 активноcтi cплeноцитiв на 14,6 ± 3,5%, а деривати бiфiдобактeрiй - на 10,0 ± 2,8%. За вмюту в ceрeдовищi шкубаци в концентраци 20% фiльтрати дезштеграпв лактобактeрiй викликають пригнiчeння метаболГчж» активносп cплeноцитiв на 12,2 ± 3,0%, а фшьтрати культур лактобактерш, вирощених у власних дезштегратах, -на 43,2 ± 3,3%. Пщвищення вмюту в шкубацшному ceрeдовищi фiльтратiв дезштеграпв та культур бiфiдобактeрiй, що виросли у власних дезштегратах, до 20% знижуе мeтаболiчнy актившсть спленоципв на 38,0 ± 2,0%. Таким чином, спрямованють змш кштинного мeтаболiзмy за впливу доcлiджyваних бюлопчно активних деривапв подiбна в уах модельних системах, а !х iнтeнcивнicть залежить ид виду тecт-клiтин, вiдновлюваних cyбcтратiв i концентраци агентов впливу в модельних системах. Отримаш результати спонукають до подальшого вивчення Тмунотропносп доcлiджyваних деривапв пробютичних бактeрiй i можуть бути використаш для розроблення нових ¡мунобюлопчних прeпаратiв.

Ключовi слова: мeтаболiчна активнicть; пролiфeрацiя лТмфоципв; eмбрiональнi фiброблаcти мишТ; спленоцити мишТ

Вступ

HoBi речовини та сполуки штучного та природного походжен-ня, а також створен! на ïx oснoвi лжувально-профшактичт засоби потребують як експериментального доклтчного випробування щодо певних бюлопчних властивостей, так i проведення токсико-лопчних дослвджень (Stefanov, 2001; Habiiev, 2005). Розроблення препарата нового покотння на основ! бактер1альних похщних -структурних компонента i продукта жигтедяльносп пробютичних мжрооргашзмш - метабioтикiв, яю мають низку переваг по-р1вняно з клпинними препаратами, наразi перспективне й актуальне (Shenderov, 2013; Shaikh & Sreeja, 2017; Shenderov & Gabiichevsky, 2017). Метаболии пробютичних мжрооргашзм1в мають стимулю-вальний вплив на нормальну мжрофлору (Rivière et al., 2016), виявляють протимжробну (Lew & Liong, 2013; Presti et al., 2015; Sharma et al., 2017), 1муномодуляторну (Jensen et al., 2010; Bauer et al., 2013; Kang & Connolly, 2016), протизапальну (Griet et al., 2014; Richards et al., 2016; Castiblanco et al., 2017), прот^русну (Kim et al., 2014; Ang et al., 2016; Al Kassaa, 2017), протипухлинну (Sharma & Shukla, 2016) та шш види активносп. Структури компоненти бакт^альних клпин - фрагменти клпинних сттнок, рибосоми, нукпеïнoвi кислоти вщносять до бюлопчно активних речовин 1му-нотропжа до завдяки здатносп викликати рецептор-опосередко-ваш каскаднi реакци, результат яких - активащя мехашзм1в 1мун-ного захисту организму (Ashraf & Shah, 2013; Kozlov & Andronova, 2013; Fong et al., 2015). Одержують клиинш структури за допомогою рзних способ1в дезштегращ: хмчних, фвичних, мехашчних i комбшованих (Bauer et al., 2010; Kim et al., 2014; Kang & Connolly, 2016). Метаболии отримують шляхом культивування у поживному середовиш продуцента та наступного його видалення (Griet et al., 2014; Castiblanco et al., 2017). При цьому повшстю очистити кшцевий метабoлiтумiсний продукт ввд поживного середовиша практично не можливо. Ми розробили споаб одержання бюлопчно активних деривата бактерш пробютичних штамзв, який дозволяе уникнути застосування поживних середовищ i об'еднати рoзрiзненi процеду-ри отримання структурних кoмпoнентiв бакIерiальниx клпин та ïx метабoлiтiв в один двоетапний процес (Knysh et al., 2018). Необхвд-шсть проведення токсиколопчних дослвджень дериватних продукта, що мютять структури та метаболии похвдн пробютиюв, зумовлена перспективною ïx використання пщ час розроблення нових !муно6юлопчних препарата.

Прийнятими в Украïнi та свт етико-правовими та законодав-чими нормами - Директивою 2010/63/СС, Законом Украши «Про захист тварин вщ жорстокого поводження» № 3447-IV 2006 року та «Свропейською конвенцию про захист хребетних тварин», до якoï 2 травня 2017 року приедналася Украша, затверджено обме-ження щодо застосування тварин для дослщних та шших науко-вих цiлей i необхвднють замiни класичних дослвджень in vivo адек-

ватними альтернативними методами: тестуванням на тканинних та клпинних культурах, математичним моделюванням, комп'ю-терними технологиями та Тншими тестами. Серед таких методв оцГнювання токсичностт ргзних сполук i нових препаратов найпо-ширеншими стали методи гз застосуванням бюлопчних систем, отриманих ввд тварин, метаботчт ланцюги яких наближеи до таких у людини. Вони дають можливгсть знизити варпсть, скороти-ти терм1ни та тдвищити надшнють докличних дослвджень (Davi-la et al., 1998; Arora et al., 2011; Adan et al., 2016). Використання клг-тинних культур дозволяе виявити прямий цитотоксичний ефект дослвджуваних речовин за змгнами морфологгчних показникiв, протфераци або мeтаболiчноi акгивноcтi кл1тин. Вщображенням деяких аспект1в загального мeтаболiзмy та маркером життездатно-ст1 кл1тин може служити iх здатн1сть до вдаовлення редокс-1нди-каторiв - резазурину та солей тетразолто. Так1 iндикатори июля шкубаци з популящею кл1тин перетворюються на забарвлен1 або флуоресцентш юнцев1 продукти, вм1ст яких визначаеться кшьюс-но та пропорц1йний кТлькостТ життездатних клгтин (Rampersad, 2012; Riss et al., 2013; Prabst et al., 2017).

Колориметричний МТТ-тест - стандартний метод перев1рки цитотоксичност1 р1зних сполук на етат фармаколог1чного скри-ннгу. ВТн техн1чно простий, чутливий та вiдтворюваний i за певних умов ввдображае кТлькТсть життездатних клпин (Riss et al., 2016; Prabst et al., 2017). У його основ1 - здаттсть бeзбарвноi сот тетразолто ((3-[4,5-диметилпазол-2-ш]-2,5-дифенлтетразолто бром1д„ МТТ) вiдновлюватиcя до забарвленого формазану за до мгтохонд-рiальних ферментов живих кл1тин, част1ше - адгезованих до стшок планшета. Формазан накопичуеться у вигляда нерозчинних преци-пiтатiв усередит, на поверхн1 кл1тин i в культуральному середови-щТ. Загибель клпин супроводжуеться втратою здатноcтi перетво-рювати МТТ на забарвлений кТнцевий продукт, що рееструють спектрофотометрично. Як тестовг застосовують клгтини ргзного походження, серед яких фгбробласти визнанТ стандартним об'ек-том пТд час доклТнТчних випробувань.

Також для вивчення цитотоксичностГ потенцТйних фармацев-тичних препаратТв i сполук застосовують резазурин-тест (Alamar B1ue®-гecт), який вгдображае вТдновлювальний потенцТал, що пролгферують (O'brien et al., 2000; Rampersad, 2012; Prabst et al., 2017). На вТдмшу вТд МТТ, резазурин вТдновлюеться бТльш широким спектром фермента: миохондрГальними та цигоплазмагич-ними деггдрогеназами, цитохромами. ЖиттездатнГ клгтини з ак-тивним метаболгзмом вТдновлюють резазурин у рожевий флуо-ресцентний продукт - резоруфш, кГлькгсть якого пропорцТйна кТлькостГ життездатних клгтин. Мета це! статтГ - оцГнити цитоток-сичнють структурних i метаболгтних дериваттв Bifidobacterium bifidum i Lactobacillus reuteri за допомогою in vitro тестгв шляхом ви-значення мeтаболiчноi активностТ тест-клгтин - ембргональних фгбробластГв i спленоциттв мишТ.

MaTepi&i i MeTogu goraig^eHb

.Hocnig^eHHro Ha iHToToKcHHHicTb mgnaranH 4>inbTpaTH ge3iH-TerpaiiB 6i^igo6aKTepiH i naKToSaKTepiH (MicTaTb cipyKTypHi KoMnoHeHTH 6aKTepianbHHX KniiHH); $inbTpaTH Kynbiyp 6i$igo6aKTepiH i naKioôaKTepiH, Bupo^eHHx Ha BnacHHx ge3iHTeipaiax (MiciaTb crpyKiypm KoMnoHeHTH Ta MeiaSoniiH 6aKTepiam>HHx KJiiiHH)

CipyKTypHi KoMnoHeHTH 6i^igo- Ta naKioôaKiepiH oipHMyBanH mnaxoM 3acTocyBaHHa ^HHHoro Meiogy ge3ÎHierpaniï SaKiepianB-hhx KjiiHH - LiHKjJJHHoro 3aMopo^yBaHHa-BigiaBaHHa. flja цboгo nio^miwBaHi BHpoÔHHni miaMH B. bifidum 1 (3 npenapaiy «Bi^igyM-6aKiepHH», npAT «Bio^iapMa», yKpaïHa) Ta L. reuteri Protectis DSM 17938 (3 npenapaTy «BioGaia», «BioGaia AB», Sweden) nicna perig-paTaiiï KyjLTHByBanH npoiaroM 20-24 rogHH 3a TeMnepaTypH 37 ± 1 °C y pigKoMy a6o HaniBpigKoMy no^HBHoMy cepegoBH^i (MRS-ôyjjbftoH, iiornkoneBe cepegoBH^e). nicna TpHpa3oBoro BigMHBaHHa Big cepegoBH^a roiyBanu cycnerniiï KniiHH 3 ommHoro rycTHHoro 10,0 ogHHHib 3a mKanoro MaK®apnaHga 3a gonoMororo npunagy Densi-La-Meter (Lachema, ^exia). Bhkjh 3aMopo:®yBaHHa-BigiaBaH-Ha npoBogHJH gecaiHpa3oBo B TaKoMy pexHMi: 3aMopoxyBaHHa - na-chbhhm oxonog^eHHaM y Mopo3HJbHiH KaMepi xonognnBHHKa Samsung RB29FSRNDSA go TeMnepaTypH -23 ± 1 °C, BigirpiBaHHa - Ha BogaHiH 6arn 3a TeMnepaiypH 37 ± 1 °C go noBHoro BigiaBaHHa.

npogyKTH Meia6oni3My 6i^igo- Ta naKioôaKTepiH ogepxcyBanu nig ^ac BHpomyBaHHa npoôioTHKÎB y BnacHHx ge3iHTerpaiax. flja iboro MÎKpoÔHy cycnerniro SaKiepin 3 ommHoro rycTHHoro 10 ogu-HHib 3a mKanoro MaK®apnaHga bhochjh b ge3ÏHTerpaT y cniBBigHo-meHHi 1 : 9 i KynKiHByBanH 3a TeMnepaTypH 37 ±1 °C ynpogoBX 72 rogHH (Knysh et al., 2018).

OrpHMaHÎ ge3ÏHTerpaiH Ta KyntiypH, aK BHpocnH b ge3iHierpa-iax, gna BHganeHHa linux KniiHH Ta KniiHHHoro geSpucy, cno^aixy niggaBanu lempH^yiyBaHHro 3a 1 100 g ynpogoBX 15 xbhjhh, nicna noro cynepHaïaHT 4>im>ipyBanH nepe3 cTepuntHi MeMÔpaHHi ^intTpu 3 giaMeipoM nop 0,2 mkm (Bnaginop, Pocia).

EKcnepHMeHTH 3 BHKopHciaHHaM na6opaiopHHx iBapHH npoBogu-nu BignoBigHo go 3aKoHy yKpaïHH «npo 3axucT iBapHH Big xopcioKo-ro noBog^eHHa» (№ 3447-IV Big 21.02.2006 p.) i3 goipHMaHHaM bh-Mor KoMÏTeiy 3 6ioeiHKH iHcTHiyiy, yaogaœHHx i3 nonoxeHHaM «cb-poneHctKoï KoHBeHiiï 3axuciy xpeSeiHHx iBapHH, aKix BHKopHcioBy-roib b eKcnepHMeHTanbHHx ia iHmux HayKoBHx linax» (Crpacôypr, 1986).

Kyntiypy eMSpioHantHHx $i6po6naciiB MHmi oipHMyBanH 3a ciaHgapTHoro MeiogHKoro 3 eMSpioHB MHmeH BALB/c, BHnyHeHHx Ha 13-14-iy go6y reciaiiï mnaxoM MexaHHHoï ia eH3HMaiHHHoï ro-MoreHÎ3aiiï (3a gonoMororo 0,05% Trypsin-EDTA) TynySiB eMSpioHB 6e3 HaBKononnigHHx o&otohok, ronoBH ia BHyipimHix opraHÏB (Jo-zefczuk et al., 2012). ®i6po6naciH pecycneHgyBanu y KyntTypantHo-My cepegoBH^i DMEM/F12 (Sigma, HiMen^HHa) 3 gogaBaHHaM 10% ^eiantHoï Tenanoï cupoBaiKH (FCS), neHÎiuniHy (50 og./Mn) i cipen-ToMiiHHy (50 Mr/Mn).

Bu3wmeHHM ijumomoKcuuwemi èepueam-eMicnux $mtmpamie 3a MTT-mecmoM CycneH3iro ^iôpoônaciiB y KoHieHipaiiï 100 000 KniTHH/Mn BHocHnH y nyHKH 96-nyHKoBoro nnaHmeTa (Tecan Genios, Tecan Inc., ÂBcTpania) no 100 mkj, KyntiHByBanH b CO2 iHKyôaiopi (Automatic Flo-Thru CO2 Incubators) 3a 95% Bonorocii, 5% BMiciy CO2 ia TeMnepaTypH 37 ± 1 °C. ^epe3 24 rogHHH HenpHKpinneHÎ go nnaciHKy KniiHHH BHaananu, a npHKpinneHy ^paKiiro KniiHH KyntiH-ByBanH go oipHMaHHa KoH^nroeHiHoro mapy. nicna 4>opMyBaHHa MoHomapy KniiHHH gBini npoMHBanu cepegoBH^eM DMEM/F12 6e3 cupoBaiKH. y gocnigHi nyHKH bhochjh cepegoBH^e DMEM/F12 3 gocnig»yBaHHMH ^inBipaiaMH y KiHieBiH KoHieHipaiiï 5%, 10% ia 20%o6., y Kompontm - cepegoBH^e 6e3 gocnig^yBaHoro ^intipaiy (HeraiHBHHH KoHipont, K). KiaHmeiH iHKyôyBanu 3a BH^e3a3Hane-hhx yMoB npoiaroM 24 rogHH. MTT-peareHT (6e36apBHy cinb Teipa-3oniro [3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide], Sigma Chemical Co., USA) gogaBanu b nyHKH no 15 mkj. iHKyôyBanu 3 hhm KniiHHH ynpogoBX 4 rogHH b CO2 iHKyôaiopi b yMoBax, cnpu-ainHBHx gna BigHoBneHHa KniiHHaMH po3HHHHoro MTT-peareHiy go Hepo3HHHHoro $opMa3aHy. nicna 3aKÏHqeHHa 3a3HaneHoro ^acy 3 ny-hok BHgananH cepegoBH^e ia bhochjh no 100 mkj gHMeiHncynB-

^OKcngy (^MCO) 3 Meroro conro6inÎ3aniï $opMa3aHy. ÄKypamo CTpymyBann nnaHmex npoTaroM 5-10 xbhhhh go po3HmeHHa Kpn-cxaniB $opMa3aHy.

3a gonoMororo nnaHmeraoro pngepa (Elise microplate reader with PC software UTRAO SM 600, China) BH3Ha^ann onrnHHy rycraHy koxhoï nyHKH 3a 530 hm, BigHÎMann BHMipaHe ^oHoBe noranmHHa 3a 620 hm. Pe3ynBiaiH po3paxoByBanu 3a ^opMynoro (RAU = omHHHa ryciHHa 3pa3Ka 3 KniiHHaMH - omwjHa ryciHHa 3pa3Ka 6e3 KniiHH) i Ha-Bogpnu y BigeoTKax Big 3HaneHt, oipHMaHHx gna KompontHoro 3pa3Ka.

OmpuMaHHM cnneHoijumiB Murni. Cene3iHKy MHmen BALB/c (3 caMna, bîkom 6-8 thxhîb, Baroro 18-20 r) oipHMyBanH b aceniHH-HHx yMoBax. BngjneHy cene3iHKy ogHopa3oBo npoMHBanH 70% eiH-noBHM cnHpioM i Tpmi cepegoBH^eM RPMI-1640 (Biowest), nicna noro nogpiÖHroBanH niHneiaMH go ciaHy ogHopigHoï MacH, nepeHo-cHnH y nnaciHKoBy npoöipKy eMHiciro 15 Mn, bhocmm 4 Mn cepego-BHma RPMI-1640 3 gogaBaHHaM 10% eM6pioHam>Hoï cHpoBaiKH Kpo-Bi BenHKoï poraioï xygoÖH (37 °C), nempH^yryBanH 3a 500 g (1500 o6./xb) npoiaroM 5 xBHnHH. CynepHaïaHT BHgananH, ocag pe-cycneHgyBanH b 1 Mn KyntiypantHoro cepegoBH^a RPMI 3 gogaBaHHaM 10% 4>eiam>Hoï lenanoï cHpoBaiKH (FCS), neHÎnpniHy (50 og./Mn) i CTpenToMinHHy (50 Mr/Mn). KoHneHipaniro KniiHH BH3Ha^anH 3a gonoMororo reMonHioMeipa Marienfeld.

Bu3wmeHHM ijumomoKcuuHoemi ôepmam-BMicHux inbmpamiB 3a Alamar Blue®-mecmoM. Cycneroiro cnneHonpiiB bhochtih b nyHKH nnaciHKoBoro nnaHmeia Tecan Genios (Tecan Inc., ABcipania) no 80 MKn (70 000 KniiHH Ha nyHKy). y gocnigHi nyHKH gogaBanu no 20 mki gocnig^yBaHHx ^intipaiiB (Hepo3BegeHHx i po3BegeHux 1 : 2; 1 : 4 KyntiypanBHHM cepegoBH^eM). KiHneBi KoHneHipaniï ^intipa-iiB y nyHKax cKnanu BignoBigHo 20%, 10% ia 5%o6. Kompontm nyHKH Miciunu cnneHouHiH y cepegoBH^i KynBiHByBaHHa (HeraiHBHHH KoHipont, K). KniiHHHi cycneH3iï KyntiHByBanH b iHKyöaropi 3a 5% KoHneHipaniï CO2, 95% Bonorocii ia ieMnepaiypH 37 ±1 °C ynpogoBX 24 rogHH. Alamar Blue® (Serotec Ltd, CfflA) bhochih y nyHKH b KoHneHipaniï 0,15 Mr/Mn, nicna noro nnaHmeiH BHipHMyBa-nu ynpogoBX gBox rogHH b iHKyöaropi y 3a3HaneHHx yMoBax. Kint-Kicit BigHoBneHoro ^nyopecneHiHoro öapBHHKa y 3pa3Kax BH3Ha^a-nu 3a iHieHcHBmciro ^nyopecneHniï 3a goBXHHH xBHni 36yg^eHHa 550 ia eMiciï 590 hm. BuMiproBaHHa npoBogpnu 3a gonoMororo pugepa (Elise microplate reader with PC software UTRAO SM 600, China). Рeзynвтaтн BuMproBaHt po3paxoBaHi 3a ^opMynoro (RFU = imieH-cHBHicib 4>nyopecneHniï 3pa3Ka 3 KniiHHaMH - iнтeнcнвнicтb ^nyo-pecneHuiï 3pa3Ka 6e3 KniiHH) i HaBegeHi y BigcoiKax BigmocHo KomipontHoro 3pa3Ka, ^o He MciHit gocnig^yBaHux penoBHH.

Cтaтнcтнннy o6po6Ky oipuMaHux pe3yntiaiiB npoBogunu 3 BHKopHciaHHaM nporpaMH Statistica 8.0 (StatSoft Inc., USA). flna kox-hoï KoHneHipaniï gocnig^yBaHux penoBHH eKcnepuMemiu BHKoHaHo ipmi y meciu noBiopax. flna BuaBneHHa po36ixHocieH mîx BußipKa-mh 3aciocoBaHo HenapaMeipHHHHH U-Kpuiepift MaHHa-yïiHi. Oipu-Mam gaHi HaBegeHi y BHrnagi cepegm>oro apH^MeiHHHoro (x) 3i ciaH-gapiHHM BigxuneHHaM (SD). 3HaneHHa P < 0,05 npuHHaii aK ciaiHc-thhho 3Ha^y^i.

Pe3yabTaTH

3a pe3yntiaraMH MTT-iecry, npHcyrmicit y cepegoBH^i iHKyöa-uiï eMßpioHantHHx ^iöpoönacriB Mumi ^intipaiiB, ^o Micrart cipyKiypHi ia MeiaöoniiHi gepuBaru naKioöaKTepiH, y KoHneHipaniï 5% ra 10% He BHKnuKae ciarHciHHHo gocioBipHux 3MiH MeraöoniH-hoï aKiHBHocii TecT-KniiHH (puc. 1). BBegeHHa go cKnagy cepegoBH-^a ^intipaiy ge3iHTerpaiy naKroöaKiepiH y KoHneHipaniï 20% cnpHHHHae 3Ha^He npurmiHeHHa BigmoBnroBantHoï 3gaiHocii $i6po-önaciiB: ïï noKa3HHK 3HH^yen>ca Ha 52,7 ± 6,2% nopiBHaHo 3 Komipo-neM. MeraßoniHHa aRiuBmicTt ^iöpoönaciiB 3a 20% BMiciy b cepego-BH^i iHKyôaniï ^intipaiy Kyntiypu naKioöaKTepiH, BHpo^eHoï y BnacHoMy Kpioge3iHierpaTi, 3HH®yertca Ha 15,7 ± 6,9%o. TaKHM hh-hom, BigmoBnroBantHa зgaIнicтb ^iöpoönaciiB nig Hac 3aciocyBaHHa aK pegoKc-iHgHKaiopa MTT BuaBunaca HyinHBimoro go BnnuBy crpyK-lypHux, Hix KoMnneKcy cipyKiypHHx i MeraöoniiHHx gepHBaiiB naKioöaKTepiH.

s

ц

о &

и

X

$

• S Ч

й 'и о ™ ю

Л о4

и

и

т

Г*1

■fi

l/5 l/10 l/20 ml/5 ml/10 ml/20

Зразки фшьтратш / bmíct в шкубацшному середовипц, % Рис. 1. Вплив дериваттв лактобактерш на метаботчну активтсть ембрiональних фiбробластiв миш, визначену за МГТ-тестом (х ± SD, n = 3): L - фшырати дезштеграпв лактобактерш;

ML - фшырати культур лакгобактерш, вирощених на власних дезштегратах; * - вiдмiнностi статистично достовiрнi за P < 0,05 пор1вняно з контролем

Фтьтрати, що мiстять струкгурнi та метаболiтнi деривати 6í-фщобактерш, у концентрацй 5% та 10% не викликають статистично достов1рних зм1н метаболч^}! активносп ембрiональних ф^б-робласттв мишi за МГТ-тестом (рис. 2). За концентрацй в середо-вищi культивування фшьтрапв 5% спостернаеться тенденцiя до пдвищення ввдновно! здатносп фiбробластiв. Збiльшення вмсту фiльтратiв дезiнтегратiв бiфiдобакгерiй у середовищi культивування до 20% супроводжуетъся суттевим пригнiченням метаболiчноi активносгi тест-клпин: И рiвень знижуеться на 26,5 ± 6,5%. Фiльтрати культур б1фщобактерш, вирощених у власних дезштегратах, за вмiсту в середовищi культивування 20% спричиняють значне зниження ввдновно! здатностi ембрiональних фiбробластiв мишi: пор1вняно з контрольними показниками вiдновний потен-цiал тест-клiтин зменшуеться на 40,4 ± 6,8%. Огриманi результати МТТ-тесту показують, що за однакового вмсту в шкубацшному середовищi (20%) структурт деривати бiфiдобакгерiй спричиняють менш суттеве пригнiчення метаболчно! акгивностi ф1бробла-стiв, нiж комплекс структурних i метаболпних дериватiв.

Рис. 2. Вплив дериваттв бiфiдобакгерiй на метаболiчну активтсть ембрюнальних фiбробластiв мишi, визначену за МТТ-тестом (x ± SD, n = 3): В - фшырати дезштеграттв б1фвдобактерш;

МВ - фшьтрати культур б1фвдобактерш, вирощених на власних дезштегратах; * - вiдмiнностi статистично досвжрт за P < 0,05 пор1вняно з контролем

Як видно з наведених на рисунку 3 даних, вмiст у середовищi шкубацй фiльтратiв дезiнтегратiв у концентрацй 5% i 10% та фтьтрапв культур лактобактерш, вирощених у власних дезштегратах, у концентрацй 5% не викликае статистично достовiрних змiн метаботчно! активностi спленоципв мишi за результатами Alamar В1ие®-тесту. Присутнiсгъ в шкубацшному середовищi дез-iнтегратiв лактобактерiй у концентращ 20% спричиняе статистично достовiрне зниження метаболч^}! активностi тест-клпин по-рiвняно з контролем (на 12,2 ± 3,0%). Фiльтрати культур лактобактерш, вирощених на власних дезштегратах, у концентрацй 10% викликають статистично достов1рне зниження метаботчно! ак-

тивносп спленоципв мишi на 14,6 ± 3,5%, а в концентраци 20% -на 43,2 ± 3,3% порiвняно з контрольними показниками. Таким чином, за результатами Alamar В1ие®-тесту, суттевше пригнiчення метабошчно! активностi спленоципв мишi ввдбуваеться за до комплексу структурних i метаболпних пор1вняно з аналогiчним ефек-том, викликаним дiею структурних деривапв лактобактерiй.

Рис. 3. Вплив дериваттв лактобактерш на метаболчну активнiсть спленоцигтв миш^ визначену за Alamar В1ие®-тестом

(х ± SD, n = 3): L - фшырати дезштеграпв лактобактерш; ML - фшырати культур лактобактерш, вирощених на власних дезштегратах; - ввдмшносп статистично достовiрm за P < 0,05 пор1вняно з контролем

Результати дослвдження впливу дериваттв бiфiдобактерiй на метаболiчну активнiсть спленоцитв мишi в Alamar B1ue®-тестi дозволили зробити висновок про те, що ва дослвджуваш дериват-умют фiльтрати за концентрацй в шкубацшному середовищi 5% та фiльтрати дезштеграттв бiфiдобактерiй за концентрацй 10% не викликають статистично достов1рних змiн метаболiзму тест-клъ тин (рис. 4). За умови 20% вмсту в середовищi шкубацй фшьтра-тiв дезiнтегратiв бiфiдобакгерiй метаболiчна активнiсть тест-клг-тин пригшчуетъся на 38,2 ± 2,0% пор1вняно з контролем. Уведен-ня в середовище iнкубацii спленоципв фшыраттв культур бiфiдо-бактерш, вирощених у власних дезштегратах, в концентрацй 10% пригшчуе метабомчну активнiсть спленоципв на 10,0 ± 2,8%, а в концентрацй 20% - на 38,0 ± 2,1% пор1вняно з контрольними показниками. Отже, за даними Alamar В1ие®-тесту, за до комплексу структурних i метаболпних дериваттв бiфiдобактерiй ввдбуваеться гаке саме за iнтенсивнiсгю пригшчення метаболiчноi активностi спленоципв миш, як i за да структурних деривапв бiфiдобактерiй.

Обговорення

Огриманi даш щодо впливу деривапв лактобактерш на метабомчну актившсть ембрюнальних фiбробластiв миш добре узгод-жуються з результатами аналопчних дослiджень, якi показали ввд-сутнiсть цитотоксичного впливу сумiшi фшьтрапв культуральних рiдин двох шгамiв L. reuteri (ATCC PTA 5298 та DSM 17938) на життездатmстъ гшгтвальних фiбробластiв iз застосуванням МТТ-тесту (Castib1anco et a1., 2017). Слвд зазначити, що вмiст метаболт-■пв лактобактерiй в iнкубацiйному середовищi, дослвджений авторами, значно нижчий, иж обраний нами, за рахунок розведення безклпинного супернаганта до концентрацй, екв1валеншо1 тiй, що виробляеться бактерiями у кшькосп вiд 0,5 до 5,0 х 107 КУО/мл. Iншi автори (Su1tana et a1., 2013) показали, що лзат L. reuteri ATCC 55730 (отриманий iз 1х108 КУО/мл бактерш) не впливае на життездатнють нормальних епiдермальних кератиноципв людини, визначену за допомогою МТТ-тесту. Ввдсутнють цитотоксичного ефекту фiльтратiв ультразвукових дезштеграпв шшого виду лактобактерш - L. ruminis ввдносно клiтин HeLa за допомогою МТТ-тесту встановили Kim et a1. (2014). Концентрация клпиц пвдданих дезштеграци, ввдповвдала обранiй у нашому дослвджент. Вмiст фшьтрату в середовищi культивування тест-клпин становив 10% (у наших експериментах - 5% та 20%). Пд час дослвдження впливу р1зних компонента лактобактерш (L. gasseri та L. crispatus): культуральних супернатанпв,

LinTonna3MaTMHHx eKCipaKTB, eKCipaKTB khithhhhx ctihok i xchbhx KnirnH he nponi^iepaTHBHy aKTHBmcib HopManbHnx Ta nyxnHHHnx (HeLa) nepBiKantHHx 4>i6po6nacronogi6HHx KnirnH 3a gonoMororo MTT-Teciy BnaBneHO HaaBmcib LinTOTOKCHHHOí gil BigHOCHO nyxnHHHHx te BÍgcyTHicTb - HopManbHnx KnirnH (Motevaseli et al., 2013).

Phc. 4. BnnHB gepHBariB 6i4)igo6aKTepin Ha Mera6onMHy aKTHBHicTb cnneHonHTB MHmi, BH3HaneHy 3a Alamar Blue®-recroM (x ± SD, n = 3): B - (jómparH ge3ÍHrerpaTÍB 6i4)igo6aKrepin; MB - (jómpaTH Kym>ryp 6i^igo6aKTepÍH, Bupo^eHHx Ha BnacHHx ge3iHTeiparax; * - BigMHHo-ctí CTaTHCTHHHO gocTüBÍpHi 3a P < 0,05 nopiBHamo 3 KotnponeM

Ogepxcam gaHi w>go BnnHBy gepHBariB 6i4)igo6aKTepin Ha Mera-6onMHy aKTHBHicTb eM6pioHam>HHx 4>i6po6nacrÍB MHmi nogi6Hi go noBigoMneHHx iHmHMH aBropaMH pe3ym>rarÍB aranorHHHx gocnig-xeHb. UHTOTOKCHHmCTb KnirHHHHx noxigHHx pi3HHx mraMiB 6i^igo-6aKTepiH 3a gonoMororo MTT-recry gocnigunu Kim et al. (2014). ABTopu noKa3anH, ^o 10% bmíct y cepegoBH^i KynKiHByBaHHa recT-KnirHH ^inbTpariB ym>rpa3ByKoBHx ge3iHTerpaTÍB 6i$igo6aKrepÍH He cnpHHHHae hhtotokchhhoi gil BigHocHo KnirHH HeLa. Cxoxi pe3ynb-rarH rarasc HaBenu Sultana et al. (2013): m3ar B. longum ATCC 51870 (orpHMaHHH 3 108 KyO/Mn 6aKTepin) He miHBae Ha Mera6onMHy aKTHBHicTb HopMantHHx enigepManbHHx KeparHHonHriB nrogHHH, BH3Ha-

neHy 3a gonoMororo MTT-recry. 3anexcmcn> e^eKry eKcrpaKry B. ado-lescentis SPM0212, ^o MicrHTb crpyKTypHi KoMnoHeHTH 6i^igo6aK-repiH, Big BHgy recT-KniTHH, BHaBHnH Lee et al. (2008). UHroroKcHHHa gia cnocrepiraen>ca BigHocHo paKoBHx KnirHH emreniro roBcroro KHmeHHHKa ra BigcyrHa BigHocHo He BpaxeHHx HeonnacrHHHHM nponecoM enireniantHHx KnirHH.

HH3Ka aBropiB 3acrocyBanH Alamar Blue®-recT gna oniHroBaHHa 3gaTHocri cnneHonHTB go nponi^epanii 3a gil noxigHHx naKTo6aKTe-piH (Bauer et al., 2010; Kang et al., 2016). npu nboMy aBropu ManH Ha yBa3i, ^o 3míhh Mera6onMHoi aKTHBHocTi KnirHH - ne Bigo6pa®eHHa 3míhh ix nponi^eparHBHoi aKTHBHocTi ra MapKep iMyHorponHocri gocnig^yBaHHx penoBHH. nig ^ac BHBHeHHa BnnHBy ni3ariB (400-500 Mr/Mn) ra cynepHaraHTiB L. reuteri ATCC 55730 (^o KynLTHByBanH b cepegoBH^i MRS i3 50 mM rninepHHoM i 6e3 Hboro) Ha nponi^epa-THBHy aKTHBHicTb mM^onHiiB cene3iHKH MHmen BALB/c ycraHoBne-ho, ^o ni3aru ra cynepHaraHTH, orpuMam nicna KynKiHByBaHHa L. reuteri 3a BigcyrHocri rninepHHy, BHKnHKarorb He3HaMHy go3o3a-ne^Hy crHMynaniro nponi^epanii niM^onuriB (Kang et al., 2016). CrHMynroBantHHH e^eKT cynepHaraHTiB, orpHMaHHx nicna KynbTHBy-BaHHa naKTo6aKrepin 3a npHcyrHocri rninepHHy, 3Ha^Ho nepeBH^y-BaB HaBirb e^eKT BigoMHx MiroreHiB - KoHKaBaniHy A, MoreHy naKo-Hoca, ^iroreMarnrorHHiHy ra ninononicaxapugy. iMyHocTHMynroBant-hhh e^eKT eKcrpaKriB naKTo6aKrepin (L. fermentum, L. rhamnosus) Ha cnneHonHTH MHmeñ BHaBHHH nig ^ac 3acrocyBaHHa Alamar Blue®-recry rarasc iHmi gocnigHHKH (Bauer et al., 2010).

flocnigxeHHa nuroroKcH^Hocri xchbhx L. reuteri Protectis DSM 17938 BigHocHo KnirHH pa6goMocapKoMH (RD) ra enirenianmoi ko-nopeKTantHoi ageHoKapnHHoMH (Caco-2) i3 3acrocyBaHHaM pe3a3y-pHH-recry noKa3ano, ^o rogHHHa iHKy6ania recT-KnirHH i3 xhbhmh naKTo6aKTepiaMH (1011 KYO) He BHKnHKae 3HaHHoi BTparH ix xurre-3garHocri (Ang et al., 2016).

BHBHeHHa BnnHBy pi3HHx ^paKnin nHronna3MarHHHHx nenrugiB ra 6inKiB B. lactis BHaBHno crHMynroBantHHH BnnHB noxigHHx Ha npo-

m^iepaiHBHy aKinBHicTb сппеноцнгiв y pa3i 3acrocyBaHHH Alamar Blue® ax MapKepa kjüthhhoi nponi^epanii (Amrouche et al., 2006). Bnpa^emcTb cmMynroBanbHoro BnnnBy 3ane^ana Big 4pamiii ra Mana K0HneHTpaniHH03ane®HHH xapaxrep. CmMynroBanbHnn e^eKT go3BonnB aBTopaM 3po6nm buchobok, ^o gocnig^eHi 6inKOBO-nen-rngm ^parnii 6i$igo6aKTepin iMyHonori^Ho aKTHBHi.

nopiBHroroHH orpuMaHi y nin crarri gaHi ra pe3ynbTam gocnig^eHb BnnnBy gepHBariB naxro- ra 6i^igo6aKrepiH Ha Mera6oniHHy aKTHBHicTb cnneHonuriB MHmi i3 3acrocyBaHHaM Alamar Blue®-recry iHmux aBropiB (Amrouche et al., 2006; Bauer et al., 2010; Kang et al., 2016), mh ginmnu BHCHoBKy: e^eKT noxigHHx npo6iorHHHHx 6aKTepiH 3anexHTb Big mraMy, yMoB KynbTHByBaHHa npo6iorHKa, cnoco6y orpHMaHHa ra 6ioxiMinHoro cxnagy KiHneBoro npogyKTy. Pi3HocnpaMoBaHHH xapaxrep BnnHBy gepHBaryMicHHx npogyKriB Ha cnneHonHTH y HamoMy (npHEHiHeHHa) ra BH^e3a3HaneHHx gocnigxeHHax (crHMynania) Mo^Ha noacHHTH, cnuparo^HCb Ha ^yHgaMeHranbHy 6ioMegHHHy napagurMy ropMe3Hcy, 3rigHo 3 aKoro Mani go3H crHMynrororb, a Benuxi -iHri6yron> 6ionoriHHi noKa3HHKH (Shafran et al., 2010). HMoBipHo, gna orpHMaHHa crHMynroBanbHoro BnnHBy Ha cnneHonHTH Heo6xigHe 3acrocyBaHHa MeHmux go3 BHnpo6yBaHHx HaMH gepHBar-yMicHHx ^inbrpariB, ^o nnaHyerbca nepeBipHTH y noganbmux gocnrig^eHHax.

BHCHOBKH

He3Ba^aroHH Ha 3acrocyBaHHa b nin po6ori MogentHHx cucreM, Bigpi3Harorbca BHKopHcraHHaM pi3HHx 3a Mop^o^yHKnio-HanbHHMH BnacrHBocraMH recT-KnirHH i cy6crparHHx penoBHH gna ^epMeHrarHBHoro BigHoBneHHa, xapaxrep BnnHBy gocnig^yBaHHx gepHBaryMicHHx ^intrpariB Ha Mera6oniHHy aKTHBHicTb recT-KniTHH nogi6HHn. iHreHcHBHicTb BnnHBy gocnig»yBaHHx noxigHHx npo6io-THHHHx 6aKrepin Ha Mera6oniHHy aKTHBHicTb Tecr-KJiiiHH Mae 3anex-Hicrb Big KoHLtempanii gepHBarHoro npogyKry y cepegoBH^i iHKy6a-nii ra cxnagy MogentHoi cucreMH (recT-KnirHH i pegoKc-iHguxaropa). yMicT 4>ini>TpariB ge3iHTerpariB naKro- ra 6i^igo6aKrepin b iHKy6a-ninHoMy cepegoBH^i 5% ra 10% cyrreBo He BnnHBae Ha Mera6onHHy aKTHBHicTb eMßpioHanLHHx $i6po6nacriB i cnneHonmiB MHmi. üig-BH^eHHa BMicry 3a3HaneHHx ^inLTpariB y iHKy6anjnHoMy cepegoBH-^i go 20% cynpoBog^yerbca craTHCTHHHo gocroBipHHM 3HHxeHHaM Mera6oniHHoi aKTHBHocri recT-KnirHH. OinLTparH, axi MicraTb crpyK-rypHi ra Mera6oniTHi gepHBaru npo6iorHKiB, y KoHLtempanii 5% He BHKnHKarorb 3HaMHHx 3MiH Mera6oniHHoi aKTHBHocri o6ox BugiB recT-KnirHH. KoHneHTpania 3a3HaneHHx 4>ini>TpariB y cepegoBH^i iHKy6a-nii 10% He BnnHBae Ha Mera6oniHHy aKTHBHicTb eMßpioHanLHHx po6nacriB, ane cnpuHHHae 3HHxeHHH BigHoBHoro noreHniany cnneHo-nHTB MHmi. üigBH^eHHa BMicry b cepegoBH^i iHKy6anji $intтpaтiв Kynbryp npo6iorHKiB, BHpo^eHHx y BnacHHx ge3iHTerparax, go 20% cynpoBog^yerbca 3HaMHHM npurHineHHaM Mera6oniHHoi aKTHBHocri eMßpioHanbHHx $i6po6nacriB ra cnneHonuriB MHmi.

OrpuMaHi peзyntтaтн gocnig^eHHa nHToToKcHHHocri 6ionorMHo aKTHBHHx gepHBariB B. bfidum ra L. reuteri cnoHyKarorb go noganb-moro BHBHeHHa iMyHorponHocri gocnig^yBaHux gepHBariB npo6io-THMHHx 6aKrepin i Mo^yrb 6yru BHKopHcraHi gna po3po6neHHH ho-bhx iMyHo6ionoriHHHx npenapariB gepuBarHoro runy.

References

Adan, A., Kiraz, Y., & Baran, Y. (2016). Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology, 17(14), 1213-1221. Al Kassaa, I. (Ed.). (2017). The antiviral activity of probiotic metabolites. In: New

insights on antiviral probiotics. Springer, Cham. Amrouche, T., Boutin, Y., & Fliss, I. (2006). Effects of bifidobacteria! cytoplasm peptide and protein fractions on mouse lymphocyte proliferation and cyto-kine production. Food and Agricultural Immunology, 17(1), 29-42. Ang, L. Y. E., Too, H. K. I., Tan, E. L., Chow, T. K. V., Shek, P. C. L., Tham, E., & Alonso, S. (2016). Antiviral activity of Lactobacillus reuteri protectis against Coxsackievirus A and Enterovirus 71 infection in human skeletal muscle and colon cell lines. Virology Journal, 13(1), 111. Arora, T., Mehta, A. K., Joshi, V., Mehta, K. D., Rathor, N., Mediratta, P. K., & Sharma, K. K. (2011). Substitute of animals in drug research: An approach towards fulfillment of 4R's. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 73(1), 1.

Ashraf, R., & Shah, N. P. (2013). Immune system stimulation by probiotic microorganisms. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 54(7), 938-956.

Bauer, J. A., Salvagni, M., Vigroux, J. P. L., Chalvet, L. L. G., & Chiavaroli, C. (2010). Immunomodulatory extracts from Lactobacillus bacteria and methods of manufacturing and use thereof. U.S. Patent No 20100055082A1. U.S. Patent and Trademark Office, Washington.

Castiblanco, G. A., Yucel-Lindberg, T., Roos, S., & Twetman, S. (2017). Effect of Lactobacillus reuteri on cell viability and PGE2 production in human gingival fibroblasts. Probiotics and Antimicrobial Proteins, 9(3), 278-283.

Davila, J. C., Rodriguez, R. J., Melchert, R. B., & Acosta, J. D. (1998). Predictive value of in vitro model systems in toxicology. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 38(1), 63-96.

Fong, F. L. Y., Shah, N. P., Kirjavainen, P., & El-Nezami, H. (2015). Mechanism of action of probiotic bacteria on intestinal and systemic immunities and antigen-presenting cells. International Reviews of Immunology, 35(3), 179-188.

Griet, M., Zelaya, H., Mateos, M. V., Salva, S., Juarez, G. E., Font de Valdez, G., Villena, J., Salvador, G. A., & Rodriguez, A. V. (2014). Soluble factors from Lactobacillus reuteri CRL1098 have anti-inflammatory effects in acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice. PLoS One, 9(10), e110027.

Habriev, R. U. (2005). Rukovodstvo po eksperimental'nomu (doklinicheskomu) izucheniju novyh farmakologicheskih veshhestv [Manual on experimental (preclinical) study of new pharmacological substances]. Medicina, Moscow (in Russian).

Jensen, G. S., Benson, K. F., Carter, S. G., & Endres, J. R. (2010). GanedenBC 30™ cell wall and metabolites: anti-inflammatory and immune modulating effects in vitro. BMC Immunology, 11(1), 15.

Jozefczuk, J., Drews, K., & Adjaye, J. (2012). Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluri-potent stem cells. Journal of Visualized Experiments, 64.

Kang, H. J., & Connolly, E. (2016). Method of improving immune function in mammals using lactobacillus strains with certain lipids. U.S. Patent No 2016/0287702 A1. U.S. Patent and Trademark Office, Washington.

Kim, M. J., Lee, D. K., Park, J. E., Park, I. H., Seo, J. G., & Ha, N. J. (2014). Antiviral activity of Bifidobacterium adolescentis SPM1605 against Coxsackievirus B3. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 28(4), 681-688.

Knysh, O. V., Isajenko, O. J., Babych, J. M., Poljans'ka, V. P., Zachepylo, S. V., Kompanijec', A. M., & Gorbach, T. V. (2018). Sposib oderzhannja biolo-gichno aktyvnyh deryvativ bakterij probiotychnyh shtamiv [Method for obtaining biologically active derivatives of bacteria of probiotic strains]. Patent of Ukraine for useful model No 122859. Derzhavne Patentne Vidomstvo Ukrainy, Kyiv (in Ukrainian).

Kozlov, I. G., & Andronova, T. M. (2013). Lekarstvennyye vozdeystviya cherez retseptory vrozhdennogo immuniteta [Effect of medicines via innate immunity receptors]. Allergologiya i Immunologiya, 14(4), 254-259 (in Russian).

Lee, D. K., Jang, S., Kim, M. J., Kim, J. H., Chung, M. J., Kim, K. J., & Ha, N. J. (2008). Anti-proliferative effects of Bifidobacterium adolescentis SPM0212 extract on human colon cancer cell lines. BMC Cancer, 8(1), 310.

Lew, L. C., & Liong, M. T. (2013). Bioactives from probiotics for dermal health: Functions and benefits. Journal of Applied Microbiology, 114(5), 1241-1253.

Motevaseli, E., Shirzad, M., Akrami, S. M., Mousavi, A. S., Mirsalehian, A., & Modarressi, M. H. (2013). Normal and tumour cervical cells respond differ-rently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. Journal of Medical Microbiology, 62(7), 1065-1072.

Obrien, J., Wilson, I., Orton, T., & Pognan, F. (2000). Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. The FEBS Journal, 267(17), 5421-5426.

Prabst, K., Engelhardt, H., Ringgeler, S., & Hubner, H. (2017). Basic colorimetric proliferation assays: MTT, WST, and resazurin. In: Gilbert, D., Friedrich, O. (Eds.). Cell Viability Assays. Methods in Molecular Biology, 1601. Humana Press, New York.

Presti, I., D'Orazio, G., Labra, M., La Ferla, B., Mezzasalma, V., Bizzaro, G., Giardina, S., Michelotti, A., Tursi, F., Vassallo, M., & Di Gennaro, P. (2015). Evaluation of the probiotic properties of new Lactobacillus and Bifidobacterium strains and their in vitro effect. Applied Microbiology and Biotechnology, 99(13), 5613-5626.

Rampersad, S. N. (2012). Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors, 12(9), 12347-12360.

Richards, J. L., Yap, Y. A., McLeod, K. H., Mackay, C. R., & Marino, E. (2016). Dietary metabolites and the gut microbiota: An alternative approach to control inflammatory and autoimmune diseases. Clinical and Translational Immunology, 5(5), e82.

Riss, T. L., Moravec R. A., Niles, A. L., Benink, H. A., Worzella, T. J., & Minor, L. (2016). Cell viability assays. In: Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., Arkin, M., Auld, D., Austin, C. et al. (Eds.). Assay guidance manual. Eli Lilly & Company, Bethesda.

Rivière, A., Selak, M., Lantin, D., Leroy, F., & De Vuyst, L. (2016). Bifidobacte-ria and butyrate-producing colon bacteria: Importance and strategies for their stimulation in the human gut. Frontiers in Microbiology, 7, 979.

Shafran, L. M., Mokienko, A. V., Petrenko, N. F., Gozhenko, A. I., & Nasibullin, B. A. (2010). K obosnovaniyu gormezisa kak fundamentalnoy biomeditsin-skoy paradigmy [On the substantiation of hormesis as fundamental biomedical paradigm]. Sovremennye Problemy Toksikologii, 49-50(2-3), 13-23 (in Russian).

Shaikh, A. M., & Sreeja, V. (2017). Metabiotics and their health benefits. International Journal of Fermented Foods, 6(1), 11-23.

Sharma, C., Singh, B. P., Thakur, N., Gulati, S., Gupta, S., Mishra, S. K., & Pan-war, H. (2017). Antibacterial effects of Lactobacillus isolates of curd and human milk origin against food-borne and human pathogens. 3 Biotechnology, 7(1), 31.

Sharma, M., & Shukla, G. (2016). Metabiotics: One step ahead of probiotics; an insight into mechanisms involved in anticancerous effect in colorectal cancer. Frontiers in Microbiology, 7, 1940.

Shenderov, B. A. (2013). Metabiotics: Novel idea or natural development of probiotic conception. Microbial Ecology in Health and Disease, 24(1), 20399.

Shenderov, B. A., & Gabrichevsky, G. N. (2017). Metabiotics: An overview of progress, opportunities and challenges. International Conference on Chronic Diseases & 6th International Conference on Microbial Physiology and Genomics Brussels, Belgium, 2017. Journal of Microbial and Biochemical Technology, 9(4 Suppl), 103.

Stefanov, O. V. (2001). Doklinichni doslidzhennia likarskyh zasobiv [Preclinical studies of drugs]. Avicena, Kyiv (in Ukrainian).

Sultana, R., McBain, A. J., & O'Neill, C. A. (2013). Strain-dependent augmentation of tight-junction barrier function in human primary epidermal keratinocy-tes by Lactobacillus and Bifidobacterium lysates. Applied and Environmental Microbiology, 79(16), 4887-4894.