CC BY
86
дигиена и санитария 6/2012
Методы генетических исследований
О Е.В. ДРОЗДОВА УДК 614.7:615.9
Е.В. Дроздова
c. vidua как тест-модель для оценки токсичности химических веществ, их смесей и объектов окружающей среды
Республиканский научно-практический центр гигиены, Минск
Представлены результаты экспериментальных исследований по разработке новой тест-модели для оценки токсичности, основанной на применении в качестве тест-объекта водных ракообразных C. vidua (Ostracoda), характерных для экосистем Беларуси и обладающих преимуществами по сравнению со стандартизованными тест-моделями (простота ведения лабораторных культур, высокая воспроизводимость и чувствительность). Показана чувствительность тест-модели к распространенным поллютантам окружающей среды. Доказана возможность ее использования для оценки острой токсичности химических веществ и их смесей, интегральной токсичности природных и сточных вод, промышленных отходов, вытяжек из продукции. Даны рекомендации по применению при тестировании отдельных групп веществ.
К л ю ч е в ы е с л о в а : биотестирование, тест-модель, острая токсичность, интегральная токсичность, Cypri-
dopsis vidua, Daphnia magna
E. VDrozdova - CYPRIDOPSIS VIDUA AS A TEST-MODEL FOR THE ASSESSMENT OF THE TOXICITY OF
chemical substances, their mixtures and objects of the environment
Republican Scientific and Practical Centre of Hygiene, Minsk, Belarus
The results of experimental studies on development a new test-model for the evaluation of toxicity, based on the application as a test-object aquatic crustaceans Cypridopsis vidua (Ostracoda), typicalfor ecosystems of Belarus and compares favorably with standardized test models (ease of maintenance in laboratory cultures, high reproducibility and sensitivity) are presented. The sensitivity of the test model to common environmental pollutants has been shown. The opportunity of using it to assess the acute toxicity of chemical substances and their mixtures, integral toxicity of water in Natural Bodies & Sewage
Systems, industrial waste, extracts of products has been proved. The recommendations for use in testing specific groups of substances have been proposed
Keywords: biotesting, test-models, acute toxicity, integral toxicity, Daphnia magna, Cypridopsis vidua
Проблема химической безопасности в настоящее время приобрела глобальное значение, состав природных объектов в значительной степени формируется под влиянием антропогенной нагрузки. Многообразие веществ, обращающихся в среде обитания, разнообразие их химической структуры и свойств, сложность управления рисками превратили химические соединения в реальную угрозу выживания человека и природы. Угрозу представляют не только отдельные вещества, но и их определенные сочетания. В то же время система контроля качества и безопасности окружающей среды, базирующаяся на физико-аналитических методах исследования, не позволяет установить присутствие в исследуемом образце всех химических веществ, не предоставляет информацию об их доступности для живых организмов и их интегрированном отрицательном воздействии на окружающую среду. Одним из направлений совершенствования системы оценок и контроля качества объектов окружающей среды является биотестирование. Методы биотестирования широко используются в мире, позволяют оценить интегральную токсичность и риск неблагоприятного воздействия антропогенных факторов на человека и окружающую среду, широко применяются и для проведения скрининговых исследований.
Дроздова Е.В. - канд. мед. наук, зав. лаб. питьевого водоснабжения и санитарной охраны водоемов (drozdovaev@mail.ru).
Проведенный обзор методов биотестирования свидетельствует, что тест-объектами в экспериментах выступают живые организмы различных уровней организации, а также их органы, клетки и ферментные системы. Для ряда тест-объектов (дафнии, бактерии) методики высокостандартизованы, проведение экспериментов регламентируется международными стандартами. Вместе с тем до настоящего времени не сделано обоснованного выбора универсального тест-объекта, обладающего чувствительностью к веществам различной химической природы [2, 5]. Для гарантированного выявления в среде токсического агента общей практикой является использование набора биотестов - test battery; состав набора зависит от объекта и цели исследования. Основной принцип лабораторного биотестирования - применение одновременно 3-4 методов с тест-объектами различных трофических групп. При оценке токсичности водной среды (водной токсичности) в качестве тест-объектов используются представители основных уровней водной экосистемы: рыбы, рачки, водоросли и высшие растения, эксперименты проводят на видах, репрезентативных для каждого трофического уровня [5]. Решение об отнесении вещества к классу опасности осуществляется на основании результатов с тест-объектом, проявившим наибольшую чувствительность.
Однако даже, несмотря на использование батареи тестов, сохраняются общие для всех биотестов методологические проблемы - нечувствительность тест-объектов
78
к токсичным для человека концентрациям многих химических соединений, гипердиагностика опасности загрязнения воды веществами, малотоксичными для человека, но высокотоксичными для тест-объектов [2, 3]. На наш взгляд, основной ошибкой при использовании биотестирования для оценки токсичности является недифференцированное использование тест-моделей без учета их чувствительности к конкретному классу соединений. В таких случаях использование даже батареи стандартизованных тестов не может объективно охарактеризовать реальную ситуацию.
Для решения данной проблемы более рациональным представляется научно обоснованный дифференцированный подход при проведении биотестирования, заключающийся в подборе тест-объектов, чувствительных к содержанию загрязнителей в количествах, сравнимых с ПДК для человека, с учетом предполагаемого перечня загрязнителей. Учитывая, что в рамках Согласованной на глобальном уровне системы классификации и маркировки химических веществ допускается использование национальных методов (в случае, если они расцениваются в качестве эквивалентных и получены с использованием Руководящих принципов проведения испытаний Организации экономического сотрудничества и развития либо эквивалентных правил в соответствии с принципами НЛП), разработка чувствительной тест-модели для оценки токсичности химических веществ и их смесей на основе использования в качестве тест-объекта свойственных для страны видов водных организмов, обладающих преимуществами по сравнению со стандартизованными тест-моделями (простота постановки эксперимента и интерпретации полученных результатов, надежность, воспроизводимость, высокая чувствительность, легкость поддержания лабораторных культур), является перспективным и актуальным направлением.
В задачи исследований, проводившихся в Республиканском научно-практическом центре гигиены в рамках отраслевой научно-технической программы «Здоровье и окружающая среда», входили разработка методики проведения эксперимента с использованием потенциального тест-объекта, характеристика тест-модели по результатам экспериментальных исследований, выработка рекомендаций по применению для тестирования групп химических веществ, интегральной токсичности объектов среды.
Материалы и методы
На основании анализа структуры водной фауны республики с учетом требований, предъявляемых к тестобъектам в качестве потенциальной тест-модели для оценки острой токсичности, нами предложен вид мелких водных ракообразных Cypridopsis vidua (Muller O.F., 1776) отряда Ostracoda. На стадии предварительной оценки возможности использования вида в качестве модели выявленные достоинства заключались в неприхотливости к условиям культивирования, простоте учета результатов опыта.
Изучена чувствительность предложенной тестмодели к различным группам химических веществ в остром эксперименте. Методика проведения эксперимента разрабатывалась с учетом требований ИСО, руководств по проведению испытаний ОЭСР, ЕС, Агентства по охране окружающей среды США. В качестве модели сравнения использовали самый распространенный стандартизованный тест-объект D. magna. Изучалась чувствительность C. vidua к одноатомным спиртам, рас-
творимым солям тяжелых металлов (нитраты свинца и кадмия), хлорорганическим пестицидам (линдан). Выбор модельных химических веществ был обусловлен их доступностью, возможностью контроля концентрации их растворов; все соединения хорошо растворимы в воде, они обладают различными механизмами действия, достаточной токсичностью для водной среды, распространены в окружающей среде как поллютанты. Кроме того, проведен установочный эксперимент с наиболее распространенным эталонным веществом - дихроматом калия.
Разработанная методика оценки острой токсичности заключается в экспонировании C. vidua водными растворами тестируемого вещества в диапазоне концентраций в статическом режиме в течение 96 ч в стандартизованных лабораторных условиях. В качестве тест-объектов используют молодь не старше 2 нед и размером не более 0,3 мм из синхронизированных партеногенетических культур. Для приготовления тестируемых концентраций и в качестве негативного контроля использовалась отстоявшаяся в течение 3 сут водопроводная вода. В течение опыта животных не кормили. Учет тест-реакции проводился через 24, 48 и 96 ч. Критерием острого токсического действия является иммобилизация (отсутствие у животных способности к движению в течение 15 с после легкого встряхивания тестируемого субстрата). Тест считается действительным, если в контроле иммобилизация не превышает 10%. Расчет показателей токсичности - эффективных концентраций (ЭКх) осуществляют методом пробит-анализа с использованием Microsoft Excell.
Результаты и обсуждение
Получено значение ЭК50-96 референсного вещества дихромата калия для C. vidua, что позволило в последующем проводить оценку стабильности культуры. Показано, что зависимость концентрация - эффект для тестобъекта C. vidua носит логарифмический характер (R2 > 0,7, для log-преобразованных данных r > 0,85). Различия в положении регрессионных кривых, описывающих зависимость эффекта от концентрации (а, значит, и чувствительности ко всем протестированным веществам) статистически достоверны для обеих тест-моделей (p < 0,05). Полученные в эксперименте значения ЭК для
D. magna сопоставимы с данными базы ECOTOX, что косвенным образом свидетельствует о воспроизводимости результатов исследований и правильности постановки эксперимента на D. magna.
Показано, что C. vidua обладает большей по сравнению с D. magna чувствительностью к пропанолу и бутанолу (ЭК50 для D. magna 4800 и 228 мг/дм3 соответственно). В отношении одноатомных спиртов для C. vidua характерны более широкие диапазоны чувствительности (на 0,3 порядка для этанола, на 0,8 порядка для пропанола и на 1,1 порядка для бутанола). Установлена выраженная корреляция между параметрами токсичности одноатомных спиртов: ЭК10 для D.magna и ЭК50 для C. vidua (Я2 = 0,8238), ЭК50 для D. magna и ЭК90 для C. vidua (R2 = 0,8614), ЭК для D. magna и ЭК для C. vidua (Я2 = 0,9277).
C. vidua на порядок более чувствительна к воздействию кадмия по сравнению со стандартизованным тест-объектом D. magna (ЭК50-48 D mana = 0,01 мг/дм3) и обладает на 0,6 порядка более широким диапазоном чувствительности (ЭК10-90). Соли кадмия по сравнению с солями свинца более токсичны для живых организмов, что проявляется меньшими значениями ЭК10 и ЭК50 и более
79
[гиена и санитария 6/2012
I, пробит
о Ацетат цинка О Смесь
Чувствительность C. vidua к тяжелым металлам и модельной смеси.
узким диапазоном токсического действия (на 0,5 порядка для C. vidua и на 1,1 порядка для D. magna).
C. vidua на порядок более чувствительна по сравнению с D. magna к хлорорганическим веществам (лин-
дан): 3^50.96 C. = 0,00;6 ЭК5с-48 с. vidua = 0,01 мг/дм3
(ЭК50-48 D ma a = 0,08 мг/дм3), диапазон чувствительности к линдану при 96-часовой экспозиции 0,0005-0,07 мг/дм3 и при 48-часовой экспозиции 0,0005-0,25 мг/дм3 (ЭК 48-ЭК90 48 D от 0,006 до 1,15 мг/дм3).
С целью проверки гипотезы о возможности использования тест-модели для оценки интегральной токсичности оценили токсичность модельной смеси известного качественного и количественного состава, а также проверили испытание модели в реальных условиях применительно к смесям химических веществ неидентифицированного состава (сточные воды, промышленные отходы).
Для проведения модельных экспериментов была адаптирована методика анализа комбинированного действия смеси веществ Б.М. Штабского [4]. В эксперименте выявляли характер комбинированного действия модельной смеси и оценивали ее на основе сопряженного анализа дозовых зависимостей, полученных для смеси и отдельных ее компонентов. Программа и методы токсикометрии смеси и компонентов планировались тождественными.
Поскольку потенциальная тест-модель в сравнительных экспериментах проявила чувствительность к тяжелым металлам, модельная смесь состояла из 4 водорастворимых солей тяжелых металлов: нитрата кадмия, нитрата свинца, ацетата меди, ацетата цинка.
Эксперимент был спланирован таким образом, чтобы модельная смесь содержала равные доли от ЭК50 каждого компонента. Концентрация исходной модельной смеси составляла 5 мг/дм3 (в пересчете на содержание металла), тестируемые концентрации (в % от исходной): 25, 18,75, 12,5, 6,25, 3,12, 1,5, 0,75, 0,38, 0,2, 0,01, 0,05.
Результаты биотестирования графически представлены на рисунке в виде зависимости «концентрация-эффект» в одной системе координат для индивидуальных компонентов и смеси. Установлены следующие значения параметров токсичности смеси в отношении С. vidua: ЭК 0,22 (0,12^0,39) мг/дм3, ЭК 0,05 мг/дм3, ЭК 0,99 мг/дм3.
Значение ЭК50 для модельной смеси соответствует содержанию компонентов в концентрациях, соответствующих 0,07 ЭК50-96 C vidua для индивидуальных веществ либо 0,04 ПДК кадмия в воде, 0,8 ПДК свинца, 0,01 ПДК меди и 0,04 ПДК цинка. Расчет показал, что смесь не должна
обладать токсичностью, в то же время результаты изучения комбинированного действия модельной смеси по ее токсичности в остром эксперименте на C. vidua указывали на более чем аддитивное комбинированное действие (потенцирование) - Квд = 2,6 (1,4^4,8) (р < 0,05).
Таким образом, экспериментально доказано, что новая альтернативная модель для оценки острой токсичности, основанная на применении в качестве тест-объекта C. vidua, чувствительна к комбинированному действию химических веществ и может использоваться для оценки интегральной токсичности смесей.
Для апробации методики в реальных условиях проведены сравнительные эксперименты по оценке токсичности промышленных отходов и сточных вод различного происхождения и качественного состава на D. magna и С. vidua, инфузориях Tetrahymena pyriformis.
Показатели токсичности, полученные в остром эксперименте по оценке интегральной токсичности металлосодержащих производственных сточных вод на C. vidua, коррелировали с данными об их химическом составе: уменьшение содержания металлов в разведениях стоков после очистки проявлялось снижением токсичности. В ряде случаев увеличение содержания металлов в одной из проб стоков после очистки проявилось повышением токсичности. Инверсия токсичности могла быть обусловлена переходом веществ из нерастворимой формы в растворимую в ходе реагентной очистки, когда вещества становились биологически доступными и могли определяться аналитическими методами, а также присутствием в сточных водах веществ, не принимавшихся в расчет традиционным методом, образованием продуктов реакции между компонентами смеси. Это еще раз свидетельствует о необходимости введения биологического тестирования сточных вод перед выпуском в водные объекты как основного элемента охраны водоемов от загрязнения промышленными сточными водами.
Оценка токсичности отходов проводилась по значению наименьшей кратности разведения сточных вод (водной вытяжки), не оказывающей токсического воздействия на тест-культуру. С. vidua показала себя как более чувствительная тест-модель по сравнению с D. magna вне зависимости от длительности экспозиции (48 либо 96 ч), что проявляется большими значениями LID. Следует также отметить, что на протестированных разведениях эффективность биотеста с С. vidua не изменяется при увеличении времени экспозиции, что позволило обоснованно сократить длительность эксперимента до 48 ч и классификацию отходов проводить на основании значения LID48ij C vidua. Полученные в эксперименте с С. vidua результаты коррелировали с данными острого и подострого опытов на Tetrahymena pyriformis.
Результаты экспериментов свидетельствуют также о том, что класс токсичности промышленных отходов, установленный на С. vidua, соответствует классу токсичности, определенному по принципу комплексной интегральной оценки на основании методов, регламентируемых действующими нормативно-методическими актами. Это свидетельствует о возможности применения данной шкалы оценки токсичности отходов на ги-дробионтах для разработанной тест-модели.
Экспериментально полученные результаты позволили сделать следующие выводы:
- методика оценки токсичности на основе использования новой тест-модели C. vidua характеризуется простотой постановки эксперимента, интерпретации полученных результатов, воспроизводимостью, высокой
80
чувствительностью, простотой ведения лабораторных культур;
- новая тест-модель C. vidua обладает сравнимой со стандартизованным тест-объектом D.magna чувствительностью в отношении одноатомных спиртов, на порядок большей чувствительностью к токсическому воздействию кадмия и хлорорганических соединений;
- установленные закономерности в чувствительности C. vidua позволяют рекомендовать ее для повышения чувствительности при тестировании данных классов химических веществ, оценки острой токсичности в прескрининговом тесте для определения диапазона действующих концентраций, в том числе для дальнейшего тестирования на стандартизованном тест-объекте D. magrn;
- использование в качестве тест-модели C. vidua повышает объективность оценки токсичности хлорорганических соединений; приемлем сокращенный до 48 ч вариант тестирования;
- тест-модель, основанная на применении в качестве тест-объекта C. vidua может использоваться для оценки интегральной токсичности смесей идентифицированного и неидентифицированного состава.
Рекомендуется применение методики для интегральной оценки объектов окружающей среды, продукции, подлежащей оценке по показателям безопасности для здоровья населения, в дополнение к физико-аналитическим методам контроля, а также для скрининга проб с целью их последующего химического анализа.
Полученные результаты научной работы послужили основой для разработки инструкции по применению «Определение острой токсичности химических веществ, их смесей, природных и сточных вод методом биотестирования с применением ракообразных в качестве тестобъектов (Daphnia magna и Cypridopsis vidua)» (рег. № 093-1008) [1], которая послужила методической базой для внедрения методов оценки токсичности химических веществ с использованием водных тест-организмов в Республике Беларусь.
Л и т е р а т у р а
1. Инструкция по применению «Определение острой токсичности химических веществ, их смесей, природных и сточных вод методом биотестирования с применением ракообразных в качестве тест-объектов (Daphnia magna и Cypridopsis vidua)», рег. № 093-1008 от 30.12.2008.
2. Красовский Г.Н., ЕгороваН.А. //Гиг. и сан. - 2000. - № 4. - С. 63 - 66.
3. Красовский Г.Н., ЕгороваН.А. //Гиг. и сан. - 2005. - № 3. - С. 10-13.
4. МУ 4050-85. Постановка экспериментальных исследований по изучению характера комбинированного действия химических веществ с целью разработки профилактических мероприятий: Метод. указания. - М., 1987.
5. Progress in standartization of aquatic toxicity tests. SETAC Special Publications Series / Eds A.M. Soares, P. Calow. - Boca Raton: Lewis Publ., 1993.
Поступила 13.02.12
© В.П. АЛФЕРОВ, 2012
УДК 614.7+613.6]:616-092:612.014.49
В. П. Алферов
СТЕРЕОТИПЫ АДАПТАЦИОННОЙ ПЕРЕСТРОЙКИ ОРГАНИЗМА И ИХ ПРОЯВЛЕНИЯ В СТРУКТУРЕ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ нАСЕЛЕнИЯ И ПРОФЕССИОнАЛЬнЫХ ГРУПП
Муромский институт (филиал) Владимирского государственного Университета
Изложены результаты теоретического анализа и обобщения многолетних работ автора по физиологогигиеническим и клиническим исследованиям организма взрослых лиц, подверженных влиянию экстремально выраженных факторов окружающей среды и условий труда. Результат обобщения - теория адаптационной перестройки организма в экстремальных условиях - изложен в виде системы постулатов. Рассмотрены особенности заболеваемости как проявления феномена побочных эффектов адаптационной перестройки организма.
Ключевые слова: экстремальные факторы, адаптация организма, теория адаптации, побочные эффекты адаптации, изменения заболеваемости как побочные эффекты
VP. Alferov - STEREOTYPES OF ADAPTIVE ADJUSTMENT OF THE ORGANISM AND THEIR MANIFESTATIONS IN THE STRUCTURE OF MORBIDITY IN POPULATION AND PROFESSIONAL GROUPS
Murom Institute (branch) of a State Educational Institution of higher professional education "Vladimir State University" named after Alexander and Nicholas Stoletovs
The results of theoretical analysis and generalizations of long-term works of the author on the physiological-hygienic and clinical studies of the body in the adult population, exposed to influence of extremely pronounced environmental factors and conditions of employment are reported. The result of generalization - the theory of adaptive adjustment of the organism in extreme conditions - is presented as a system of postulates. The features of disease as a manifestations of the phenomenon of the side effects of adaptive adjustment of the organism are considered
Keywords: extreme factors, adaptation of the body, the theory ofadaptation, side effects ofadaptation, changes in morbidity as side effects
Современное население подвергается влиянию разнообразных экстремально выраженных факторов - сурового климата, атмосферных загрязнений, про-
Алферов В.П. - д-р мед. наук, проф. каф. «Безопасность жизнедеятельности» (alferovvp@mail.ru).
фессиональных вредностей, эмоциональных стрессов, фобий и т. д.
Факторы экстремальной выраженности преобладают среди причин заболеваемости. Именно на уровне защитно-приспособительных реакций организма, направленных против этих факторов, исчерпываются фи-
81
