CC BY
14_ИЗВЕСТИЯ ВЫСШИХ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ_
Т 55 (12) ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ 2012
УДК 544.77.022.823:546.62-31 В.В. Виноградов, Г.А. Дышина, А.В. Виноградов, А.В. Агафонов
БЫЧИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН, ЭНТРАПИРОВАННЫЙ В МАТРИЦУ ОКСИДА АЛЮМИНИЯ: ЗОЛЬ-ГЕЛЬ СИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ТЕРМИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ*
(Институт химии растворов им. Г.А. Крестова РАН)
Данная статья впервые описывает эффект термической стабилизации энтра-пированных биомолекул в керамическую матрицу, отличную от кремнезема. Данное исследование посвящено изучению структуры золь-гель матрицы на основе оксида алюминия в присутствии модельного белка - бычьего сывороточного альбумина (БСА). Золь-гель матрицы были получены с помощью гидролиза изопропоксида алюминия при различных значениях pH для получения матриц с различными текстурными свойствами. Для пептизации были использованы азотная кислота, уксусная кислота и ультразвуковая (УЗ) обработка. Развитие структуры матрицы с энтрапированным белком исследовано с помощью комплекса методов, включая рентгеноструктурный анализ, метод ИК-спектроскопии, метод динамического светорассеяния, метод атомно-силовой микроскопии и метод низкотемпературной адсорбции/десорбции азота. В итоге, были синтезированы образцы с различными текстурными характеристиками и размером частиц. По результатам дифференциальной сканирующей калориметрии показано смещение температуры денатурации свободного белка по сравнению с энтрапированным в матрицу оксида алюминия на 26°С в сторону более высоких температур.
Виноградов Владимир Валентинович -
к.х.н., младший научный сотрудник лаборатории химии гибридных на-номатериалов и супрамолекулярных систем ИХР РАН.
Область научных интересов: золь -
гель синтез, гетерогенный катализ,
биоматериалы
Тел.: +7(4932)20-33-31,
e-mail: vvv@isc-ras.ru
Виноградов Александр Валентинович -
к.х.н., младший научный сотрудник лаборатории химии гибридных на-номатериалов и супрамолекулярных систем ИХР РАН, старший преподаватель кафедры «Технология керамики и наноматериалов» ИГХТУ. Область научных интересов: золь-гель синтез, фотоактивные и магнитные наноматериалы. Тел.: +7(4932)33-62-64, e-mail:vav@isc-ras.ru
Дышина Галина Александровна -
к.х.н., младший научный сотрудник лаборатории химии гибридных нано-материалов и супрамолекулярных систем ИХР РАН.
Область научных интересов: золь-гель синтез биоактивных препаратов, микроэлектромеханические системы. Тел.: +7(4932)33-62-64, e-mail: gak@isc-ras.ru
Агафонов Александр Викторович -
д.х.н., зав. лабораторией химии гибридных наноматериалов и супрамо-лекулярных систем ИХР РАН, профессор кафедры «Технология керамики и наноматериалов» ИГХТУ. Область научных интересов: химия функциональных наноматериалов. Тел.: +7(4932)33-62-64, e-mail: ava@isc-ras.ru
Ключевые слова: золь-гель, оксид алюминия, биомолекулы, энтрапирование, термическая стабильность
* Обзорная статья
ВВЕДЕНИЕ
Начиная с 1990-х годов золь-гель метод был успешно использован для капсулирования различных объектов: от красителей [1] или масел [2] до более сложных биомолекул, таких как ферменты [3,4], бактерии [5] и клетки [6]. Капсулиро-вание происходит при непосредственном введении биомолекул в золь в процессе образования неорганического полимерного каркаса при температуре окружающей среды. При этом образуется гель с активной фазой, равномерно распределенной по внутренней поверхности геля (или ксеро-геля). Физические характеристики (такие как плотность, размер пор и наноструктура) таких ок-сигидроксидов, полученных в процессе золь -гель синтеза могут варьироваться за счет регулирования кинетики протекания реакций гидролиза и дальнейшей конденсации [7-9]. Возможность тщательного контролирования микроструктуры ксерогелей крайне важна при создании систем с контролируемым высвобождением биообъектов в процессе практического использования. Например, при переходе от щелочного к кислотному гидролизу структура геля SiO2 может измениться от мезопористой к микропористой, при этом подвижность закапсулированных биомолекул резко снижается и скорость высвобождения уменьшается [10]. Аналогичным образом влияют другие исходные параметры (соотношение вода/алкоксид, спирт/алкоксид, время старения, время и температура сушки и т.д.), которые также могут быть использованы для регулирования скорости высвобождения из пористой структуры гелей.
Широкий спектр различных параметров золь - гель процесса, которые могут быть использованы для регулирования скорости высвобождения лекарственных препаратов, привели к появлению новых видов продукций, биосовместимых с организмом, включающих в своем составе закап-сулированные: антибиотики [11], антикоагулянты [12], анальгетики [13], гипотоники [14], белки [15], гормоны [16], антиэстрогены [17], антипро-тивосудорожные [18] и противоопухолевые средства [19] и даже аденовирус [20].
Несмотря на то, что большинство исследований связано с использованием силикатных прекурсоров, существует огромное число других прекурсоров на основе переходных металлов (Т^ V, 2г) или металлов III группы периодической таблицы (В и А1), которые также могут быть использованы для эффективной иммобилизации биообъектов. Данные несиликатные прекурсоры отличаются более высокой реакционной способностью в водной среде из-за низкой электроотрицательности металла и его способности находиться в раз-
личных координационных состояниях [21]. Например, глюкозооксидаза была успешно закапсу-лирована в псевдобемитовый гель [22]. Оксигид-роксиды алюминия были также применены для иммобилизации полифенолоксидазы [23]. Но наиболее распространенным является использование гидроксоформ алюмооксидных систем в качестве адъювантов.
Алюминиевые адъюванты используются в практической вакцинации уже более полувека для выработки защитного иммунитета у организма. Миллиарды доз вакцин на основе гидроксоформ алюминия вводились на протяжении многих лет, и они в настоящее время являются наиболее широко используемыми для вакцинации животных и человека.
Алюминиевые адъюванты считаются безопасными при использовании в соответствии с действующими нормами вакцинации [24, 25]. В отличие от традиционных вакцин, в которых антиген адсорбируется на поверхности гидроксо-форм алюминия, в данной работе рассмотрены подходы по получению вакцин нового поколения - композитов, в которых белок закапсулирован в матрицу геля оксигидроксида алюминия. Необходимо рассмотреть аспекты золь-гель синтеза при различных условиях приготовления и оценить термическую стабильность белков в закапсулиро-ванном состоянии. Бычий сывороточный альбумин будет использован в качестве модельного белка для капсулирования.
В данной работе золь-гель методом был синтезирован оксигидроксид алюминия, полученный при различных условиях с целью его применения в качестве матрицы для иммобилизации бычьего сывороточного альбумина (БСА) для улучшения его термической стабильности. А также предложены подходы, позволяющие регулировать размер и структуру формирующихся композитов для использования их в качестве потенциальных вакцин.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. Изопропоксид алюминия (Al(C3H7O)3), азотная кислота (HNO3), уксусная кислота (CH3COOH) и бычий сывороточный альбумин (БСА) были использованы фирмы Sigma Aldrich.
Синтез псевдобемитовых золей. Псевдо-бемитовые золи были получены, используя метод Йолдаса, посредством пептизации осадка гидро-ксида алюминия азотной кислотой (образец 1) и уксусной кислотой (образец 2). Более подробно, 3.28 г Al(C3H7O)3 было добавлено в 50 мл дистиллированной воды, что привело к образованию бе-
лого осадка. Осадок был пептизирован Q.2 (2 мл уксусной кислоты) мл концентрированной азотной (уксусной) кислоты при 90°C при интенсивном перемешивании в течение 2 часов для получения стабильного и прозрачного бемитового золя и для испарения изопропанола, образующегося при гидролизе. Конечные значения pH растворов были 2.8 (4.8 в среде уксусной кислоты). В другом случае (образец 3), для того чтобы избежать кислой среды, белый осадок обрабатывался ультразвуком (37 кГц, 0063 кВт) в течение 4 часов без добавления кислоты (рН 7.3). Через 4 ч образовался гель.
Синтез с энтрапированными молекулами БСА. Полученные бемитовые золи были охлаждены до 4°C. Далее 0.03 г бычьего сывороточного альбумина было растворено при комнатной температуре в среде бемитовых золей и оставлено на 3 часа. Полученные растворы были высушены при 2Q°C в течение недели для получения образцов 4,5,6, приготовленных с использованием азотной кислоты, уксусной кислоты и при УЗ обработке соответственно.
Характеристика методов. Удельная площадь поверхности, объем пор и распределение пор по размерам были определены методом адсорбции-десорбции азота при 77 К (Quantachrome Nova 1200). Площадь поверхности была рассчитана, используя уравнение BET, объем пор и распределение пор по размерам были определены используя метод BJH. Перед анализом образцы были дегазированы в течение 4 часов при комнатной температуре. Распределение размеров гидродинамического радиуса было измерено методом динамического светорассеяния (DLS, Malvern, Zeta-sizer nano ZS). ДСК кривые были получены с использованием DSC 204 Fl Phoenix NETZSCH со скоростью нагрева 10 K/мин. Кристаллическая фаза и кристалличность образцов были измерены методом рентгеновской дифракции (РФА) (Bruker D8 Advance) с помощью Си-Ка излучения (X = 1,54 Â), образцы были сканированы по 2) в диапазоне 4-60°С со скоростью 2 градуса в минуту. Твердые образцы были охарактеризованы методом ИК-спектроскопии с помощью спектрометра «Avatar 360 FTTIR ESP» и с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) SPM Solver P47H-PRO. Образцы для сканирования наносились на стеклянную подложку с идеально чистой поверхностью.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Измерения методом динамического светорассеяния. Рис. 1 показывает средний гидродинамический размер частиц гидрозоля оксида алюминия и продуктов взаимодействия между
частицами гидрозоля оксида алюминия и бычьим сывороточным альбумином. Высокое мольное соотношение [Н+/А13] и высокий заряд на поверхности частиц приводят к предотвращению коагуляции и осаждению агрегированных частиц оксида алюминия в присутствии БСА за счет электростатического отталкивания. Избыток кислоты может сжимать двойной электрический слой таким образом, что сила взаимодействия частиц на расстоянии уменьшается во время столкновения, в результате чего образуются агломераты.
Таким образом, мы выбрали оптимальные концентрации азотной и уксусной кислоты, необходимой, с одной стороны, для разделения частиц на более мелкие во время пептизации и для предотвращения коагуляции частиц оксида алюминия. Образец 1 имеет средний гидродинамический радиус 26.2 нм. В случае использования уксусной кислоты средний гидродинамический радиус увеличивается и соответствует 31.2 нм, что связано с меньшим значением ионной силы раствора. Использование физических методов пептизации может приводить к образованию устойчивых золей и гелей без введения дополнительных ионов. При этом интенсивность и скорость их образования зависит от частоты и мощности ультразвука. При облучении осадка, полученного в результате гидролиза изопропоксида алюминия, образуется золь с достаточно широким распределением частиц по размерам (рис. 1).
Согласно [26], необходимо отметить, что для многих вакцин на основе белков лучший эффект достигается в интервале значений рН между изоэлектрической точкой белка антигена и точкой нулевого заряда адъюванта оксида алюминия. В этом интервале адъювант и антиген будут иметь противоположные электрические заряды, способствующие электростатическому притяжению и адсорбции. В нашем случае наибольшее взаимодействие достигается в интервале рН от 4,7 до 8, поскольку именно в этом интервале молекулы бычьего сывороточного альбумина и частицы золя оксида алюминия заряжены разноименно. Использование азотной кислоты в качестве пептиза-тора способствует понижению значения рН до уровня 2.8, что вызывает отталкивание частиц между собой и, как следствие, взаимодействия наночастиц оксида алюминия (НОА) и молекул бычьего сывороточного альбумина (БСА) не происходит. Данный факт подтверждается присутствием нескольких пиков 16.3, 95, 553.2; 2400 нм на кривой распределения частиц по размерам (рис.1.). Использование уксусной кислоты и ультразвуковой обработки создает значение рН в растворе равное 4.8 и 7.3 соответственно, что соот-
ветствует оптимальному диапазону, в котором молекулы БСА и частицы НОА заряжены разноименно, обеспечивая электростатическое взаимодействие. При использовании уксусной кислоты значение среднего гидродинамического радиуса по сравнению с НОА увеличилось на 11.3 нм (табл. 1). Взаимодействие наночастиц золя оксида
алюминия, полученного при помощи ультразвуковой обработки, и молекул БСА происходит с образованием более крупных агрегатов размером 2 мкм, что соответствует оптимальному значению при производстве современных вакцин на основе гидроксида алюминия [27].
г, нм
10 100 1000 г, нм
10
100
г, нм
1000
5
Í
10 100 1000 г, нм
1 10 100 1000
г, нм г, нм
Рис. 1. Средний гидродинамический радиус синтезированных образцов: 1 -образец 1, 2-образец2, 3 -
4, 5 - образец 5, 6 - образец 6
Fig. 1. Average hydrodynamic radius of synthesized samples: 1- sample 1, 2 - sample 2, 3 - sample 3, 4 - sample 4, 5 - sample 5,
6 - sample 6
■ образец 3, 4 - образец
■■Л'
ллА
v\
'V
V
л
i
v'\ J \
¡¡J\J .vjV/J
10
20
30
40 26
50
60
70
Рис. 2. РФА образцов композитов оксида алюминия с БСА:
1 - образец 4, 2 - образец S, 3 - образец 6 Fig. 2. XRD spectra of sol-gel BSA alumina samples. 1 - sample 4, 2 - sample S, 3 - sample 6
Рентгеноструктурный анализ. Используя рентгеновскую кристаллографию и инфракрасную спектроскопию, ученые продемонстрировали, что основной фазой алюмооксидного адъюванта является псевдобемит [27].
На рис. 2 представлены данные РФА синтезированных образцов с БСА. Расчет с использованием уравнения Шеррера показывает наличие псевдобемита (JCPDS file № 21-1307) с размером кристаллитов 4, 8, 6 нм для образцов 4, 5, 6 соответственно. Эти результаты хорошо согласуются с данными РФА наиболее часто используемых адъ-ювантов на основе гидроксида алюминия, которые также содержат в качестве основной кристаллической фазы псевдобемит со средним размером кристаллитов 4.5^2.2^10 нм [26].
Влияние значения pH на текстурные свойства. На рис. 3 изображены изотермы адсорбции-десорбции азота и распределение пор по размерам синтезированных образцов.
БСА был капсулирован в псевдобемито-вый гель, полученный при различных значениях pH и условиях пептизаций для того, чтобы определить роль условий синтеза на текстурные характеристики получаемых материалов. Как известно [28], введение кислот и оснований может изменить удельную площадь поверхности получаемых
материалов, средний размер пор и их объем и, тем самым, влиять на скорость высвобождения белка. Данный факт может быть использован для контроля размера и формы неорганического полиме-
ра, присутствующего в растворе в процессе золь-гель синтеза. При низких значениях рН, как правило, образуются линейные полимеры в результа-
D, нм
я
D.II4
»
»
п, НМ
40
л »
1), нм
я so
[>, н.м
на
я
]>. Ш1
и
Рис. 3. Изотермы адсорбции-десорбции азота и распределение пор по размерам синтезированных образцов: 1- образец 1, 2-
образец 2, 3- образец 3, 4 - образец 4, 5- образец 5, 6- образец 6 Fig. 3. N2 adsorption-desorption isotherms and pore size distribution of synthesized samples: 1- sample 1, 2- sample 2, 3- sample 3, 4 -
sample 4, 5- sample 5, 6- sample 6
те реакций конденсации. С другой стороны, при высоких значениях рН конденсация преимущественно происходит между оксополимерами, при этом наблюдается интенсивное сшивание и образование разветвленного трехмерного неорганического плотного каркаса [29].
С возрастанием рН и увеличением плотности на молекулярном уровне увеличения плотности конечных ксерогелей не происходит. Как мы можем наблюдать из данных по сорбции азота (рис. 3), увеличение значения рН синтеза приводит к образованию существенно более пористых ксерогелей (табл. 1). Данный факт может быть объяснен процессами сжатия неорганической сетки геля во время сушки. Капиллярное давление, возникающее в процессе удаления растворителя из «влажных» лиогелей достигает критических значений (несколько МПа [28]), что приводит к усадке (а иногда и к разрушению) монолита. Гидролиз и конденсация при низких значениях рН (образцы 1, 4) ведет к образованию неоднородного каркаса, который разрушается в процессе сушки с образованием микропористых гелей со средним значением пор 2.3 нм (рис. 3).
При более высоких значениях рН (образцы 2, 5 и 3, 6), наблюдается более сильное сшивание
неорганического полимера оксигидроксида алюминия и образование более однородной структуры, что обеспечивает сопротивление возникающему капиллярному давлению. При этом образуются более пористые, но менее плотные ксерогели (рис. 3). Прочность сетки оксигидроксида алюминия может быть также связана со степенью конденсации.
Анализ BJH, проведенной по десорбцион-ной ветви изотермы (рис.3) показывает, что средний размер пор образцов увеличивается с возрастанием рН. Ксерогели, полученные при рН 2.8 (образцы 1, 4) являются микропористыми, что также подтверждается характерной изотермой и соответствующим распределением пор по размерам, центрированным около 2.3 нм. Использование уксусной кислоты (образцы 2, 5) приводит к росту рН до 4.8, при этом удельная площадь поверхности, средний размер пор и объем пор увеличивается (табл. 1). При синтезе геля в условиях ультразвуковой обработки (образцы 3, 6) рН раствора составил о 7.3, при этом размер пор все больше сдвигается к мезообласти фр=3.7 нм), и изотерма имеет вид, характерный для мезопори-стых образцов. При увеличении рН распределение пор по размерам также становится уже.
Таблица 1
Характеристики синтезированных образцов
Образец Условия пептизации Sbet, м2/г Объем пор, см3/г Средний размер пор, нм Средний гидродинамический радиус, нм
1 Азотная кислота 156 0.114 2.34 26.2
2 УЗ обработка 246 0.229 3.72 129.7; 390.3; 2623
3 Уксусная кислота 183 0.128 2.79 31.16
4 Азотная кислота +БСА 67 0.053 2.31 16.34; 95.07; 553.2; 2400
5 УЗ обработка +БСА 370 0.341 3.69 1133
6 Уксусная кислота +БСА 141 0.088 2.49 42.55
Таким образом, регулируя рН, можно изменять микроструктуру гелей на основе гидро-ксоформ оксида алюминия от микро- к мезопори-стой. Можно предположить, что скорость высвобождения белка из матрицы оксида алюминия будет увеличиваться с возрастанием значения рН среды, в процессе золь-гель синтеза. Данный факт будет подтвержден в наших дальнейших исследованиях.
В данной работе был также проведен анализ влияния значения рН среды на средний размер формирующихся частиц. Морфология поверхности образцов была исследована методом атомно-силовой микроскопии в полуконтактном режиме на сухих образцах. Результаты измерений, полученные с помощью зондового микроскопа, представляют собой геометрические образцы (режим
«топографии») в виде двумерных цифровых изображений поверхности (рис. 4). На АСМ изображениях также приведены результаты распределения частиц по размерам. Микрорельеф поверхности оценивали сравнением поверхности образца свободного белка с поверхностью капсулирован-ного белка в матрицу Al2O3. Наблюдается различие в структуре поверхности некапсулированного белка и в матрице оксида алюминия, полученной при различных значениях pH. Поверхность свободного белка изначально имеет сложное строение, характеризующееся несколькими уровнями архитектурной организации. Средний размер частиц белка (рис. 4а) составляет 8 .5нм, что свидетельствует о его различной ориентации на поверхности подложки. Рис. 4а показывает две возможные ориентации БСА, боковыми сторонами
молекул к поверхности ("side-on") или их концами к поверхности ("end-on"), о чем также сообщалось авторами [29]. Сравнительное изучение топографии поверхностей образцов с закапсулированным белком (рис. 4б,в,г) демонстрирует отсутствие нанофазного разделения компонентов композитов БСА@А1203, что подтверждает иммобилизацию белка в каркас матрицы А1203. Причем, структура
поверхности образцов 4,5,6 представляет собой скопление большого количества агрегатов. Размер агрегатов в образце 4 составляет в среднем 15 нм, в образце 5 - 200-300 нм, в образце 6 - 25 нм. Для описания оптимального размера частиц адъюван-тов, используемых при производстве вакцин, используют термины «наночастицы» и «микрочастицы» [30,31]. Теоретически, наночастицы -
Рис. 4. Двухмерное АСМ-изображение поверхности БСА и распределение частиц по размерам для образцов: БСА (а), образец
4(б), образец 5(в), образец 6(г)
Fig. 4. Two-dimensional AFM image of the BSA surface and particles size distribution for samples: BSA (а), sample 4 (б), sample
5 (в), sample 6 (г)
это частицы с размером от 1 - 1000 нм (1цм), в то время как микрочастицы - 1-1000цм [32]. С практической точки зрения, частицы с более мелким размером предпочтительней [33], так как по сравнению с большими, мелкие частицы более эффективно преодолевают различные биологические барьеры, проходят по капиллярам после инъекции и обладают высокой стабильностью при циркуляции в крови [34]. Таким образом, при целевой доставке лекарств наночастицы с размером менее 100 нм являются более предпочтительными [33, 35, 36]. Однако, при изготовлении вакцин, вопрос об оптимальном размере частиц адъюванта до сих пор является актуальным [37]. Например, при использовании бычьего сывороточного альбумина, закапсулированного в частицы с различными размерами (200, 500 и 1000 нм) наиболее эффективными оказались частицы с размером 1000 нм [38]. Вместе с тем, традиционно применяемые адъю-ванты на основе оксида алюминия имеют размер 2 мкм [27].
ИК-спектроскопический анализ. Отнесение полос поглощения в спектрах А120з (образцы 1- 3) проведено в соответствии с литературными данными [39-45]. Основные полосы поглощения образца А1203 соответствуют следующим колебаниям: пики 444 см-1, 460 см-1 и 467 см-1 - деформационным колебаниям связи А1-0 в гексако-ординированном состоянии атома А1 (АЮ6), пики 628 см-1, 631 см-1 и 625 см-1 относятся к валентным колебаниям связи А1-0 также в гексакоорди-нированном состоянии атома А1. Пики 821 см-1, 803 см-1 и 812 см-1 соответствуют валентным колебаниям связи А1-0 в тетракоординированном состоянии атома А1 (АЮ4). Пики 1071 см-1, 1049 см-1 и 1067 см-1 относятся к симметричным валентным колебаниям связи А1-0-Н. Во всех спектрах наблюдаются пики деформационных колебаний молекул Н2О, к ним относятся: 1638 см-1, 1637 см-1 и 1635 см-1. Широкая полоса в области 3000-3600 см-1, свидетельствует о наличии неэквивалентных молекул воды, гидроксогрупп и водородных связей. Наличие пика при 1384 см-1 соответствует валентному колебанию связи С-Н в СН3 группе. Все эти же полосы можно наблюдать в спектрах А1203-БСА (образцы 4, 5, 6). Это подтверждает наличие в исследуемых образцах соединения А1203, однако главным отличием является появление I и II амидных полос, доказывающих присутствие белка - бычьего сывороточного альбумина. I амидная полоса проявляется в области 1700-1600 см-1 и обусловлена валентными колебаниями связи С=О пептидных групп, плоскостными деформационными колебаниями связи N Н и валентными колебаниями связи С-К Частота
этих колебаний зависит от природы водородной связи, в которой участвуют группы С=О [46,47]. II амидная полоса, связанная с деформационными колебаниями связей К-Н/С-К, проявляется в области 1570-1510 см-1 [47].
V, см"1
Рис. 6. ИК спектры образцов БСА-А1203: 4 - с добавлением HN03, 5 - под действием УЗ, 6 - с добавлением CH3C00H Fig. 6. FTIR spectra of the BSA-A1203 samples: 4 - with addition of HN03; 5 - upon US treatment; 6 - with addition of CH3C00H
На рис. 6 представлены ИК спектры композитов А1203-БСА. Сравнение спектров, представленных на рис. 1 и 2, показывает, что в спектрах композитов А1203-БСА (рис. 6) появляются новые полосы: при 1643 см"1 и 1540 см"1 (образец 4), 1649 см-1 и 1542 см-1 (образец 5) и 1642 см-1 и 1539 см-1 (образец 6). Эти новые полосы можно
-I—1—|—I—|—1—|—I—[—I—[—1—|—1—1
500 1000 1500 20110 2500 .1110(1 3500 4000
V, см"1
Рис. 5. ИК спектры образцов Al203: 1- с добавлением HNO3,
2 - под действием УЗ, 3 - с добавлением CH3C00H Fig. 5. FTIR spectra of the undoped alumina samples: 1 - with addition of HN03; 2 - upon US treatment; 3- with addition of CH3C00H
1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
отнести к I и II амидным полосам белка в составе композита. Таким образом, приведенные на рис. 6 ИК спектры качественно доказывают наличие белка в образцах.
Термическая стабильность белка. Повышение температуры приводит к увеличению теплового движения молекул белка. Это разрушает ковалентные связи, которые удерживают структуру белка целостной, что приводит к его денатурации. Термическая стабильность инкапсулированных белков определяется различными факторами, например, такими как условия синтеза, размер пор, которыми белок ограничен, размер частиц белка, характер и сила взаимодействия между белком и порами и т.д. Многочисленные публикации свидетельствуют об увеличении термической стабильности белков при использовании в качестве матрицы диоксида кремния [48-51]. Вместе с тем, практически отсутствуют данные о термической стабильности белков в матрице оксида алюминия. Поскольку оксид алюминия используется в качестве адъюванта при производстве вакцин, то изучение термических и химических свойств энтрапированных в его структуру белков крайне важно. Метод дифференциально-сканирующей калориметрии (ДСК) обычно используется для контроля фазовых переходов, которые в случае белков связывают с денатурационным переходом от нативной формы белка и обычно наблюдающийся в диапазоне 30-100°С.
Кривые ДСК приведены на рис. 7, в табл. 2. представлены результаты анализа энтрапирован-ного и свободного БСА.
Т, °С
Рис. 7. Смещение ДСК кривых свободного (3) и энтрапиро-
ванного БСА: образцы 4(4),5(1),6(2) Fig. 7. The shift in DSC curves of free BSA (3) and entrapped BSA: samples 4(4), 5(1), 6(2)
По ДСК-кривым видно, что процесс денатурации БСА начинается при 46.49°С, достигая своего максимума при 93.33°С. Совершенно дру-
гая картина наблюдается в случае энтрапирован-ного белка. Начало процесса денатурации сдвигается в среднем на 13 С для образцов 4 и 5, и на 23.6°С - для образца 6, полученного с добавлением уксусной кислоты. При сравнении температуры денатурации для всех энтрапированных систем наблюдается смещение в сторону высоких температур максимума в среднем на 26°С, по сравнению со свободным БСА. Данный факт свидетельствует о высокой стабильности материалов. В данной работе был использован модельный белок - бычий сывороточный альбумин. Аналогичным образом могут быть получены системы, применяющиеся в вакцинации. Открытие данного эффекта на системах оксида алюминия позволит существенно повысить термическую стабильность применяемых вакцин и, тем самым, существенно улучшить их эксплуатационные характеристики.
Таблица2
Результаты ДСК анализа Table 2. Results of DSC analysis_
Образец Начало Температура
денатурации, °С денатурации, °С
БСА 46,49 93,33
Образец 4 59,63 119,13
Образец 5 59,52 118,60
Образец 6 70,18 118,97
ВЫВОДЫ
Золь-гель методом синтезированы материалы на основе оксида алюминия с энтрапиро-ванным БСА. Белок был введен непосредственно в золь оксида алюминия, полученный при различных значениях рН. Для регулирования рН среды и процессов пептизации псевдобемитового золя были использованы азотная кислота, уксусная кислота и ультразвуковая обработка. В зависимости от условий синтеза были получены биоматериалы, характеризующиеся различной удельной площадью поверхности (от 67 до 370 м2/г), размером пор (от 2.3 до 3.7 нм) и объемом пор (от 0.053 до 0.341 см3/г). По результатам рентгенофазового анализа показано, что основной кристаллической фазой в составе биокомпозитов является псевдобемит со средним размером кристаллитов 4, 8, 6 нм. По данным атомно-силовой микроскопии установлено, что образцы имеют размер частиц от 15 до 300 нм. Впервые показана высокая термическая стабильность материалов с белком в матрице оксида алюминия. По результатам дифференциальной сканирующей калориметрии смещение температуры денатурации свободного белка, по сравнению с энтрапированным в матрицу оксида алюминия, составило в среднем 26°С в сторону более высоких температур. Открытие данного эффекта
на системах оксида алюминия позволит существенно повысить термическую стабильность применяемых вакцин и, тем самым, существенно улучшить их эксплуатационные характеристики.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта президента РФ для молодых кандидатов наук МК-2229.2012.3.
ЛИТЕРАТУРА
1. Zink J.L, Dunn B.S. // J. Mater. Chem. 1991. V. 1. N 6.
P. 903-913.
2. Boettcher H., Kallies K-H., Haufe H., Seidel J. // Adv. Mater. 1999. V. 11. N 2. P. 138-141.
3. Braun S., Rappoport S., Zusman R., Avnir D., Ottolenghi
M. // Mater. Let. 1990. V. 10. P. 1-5.
4. Долуда В.Ю., Лакина Н.В., Матвеева В.Г., Матвеева О.В., Сульман Э.М. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2011. Т. 54. Вып. 3. С. 78-81;
Doluda V.Yu., Lakina N.D., Matveeva V.G., Matveeva O.V., Sulman E.M. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2011. V. 54. N 3. P. 78-81 (in Russian).
5. Gill L, Ballesteros A. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 8587-8598.
6. Boninsegna S., Bosetti P., Carturan G., Dellagiacoma G., Dal Monte R., Rossi M. // J. Biotechnol. 2003. V. 100. N 3. P. 277-286.
7. Brinker C.J., Scherer G.W. Sol-gel science: the physics and chemistry of sol-gel processing. San Diego: Academic Press. 1990. P. 21-91.
8. Вольхин В.В., Жарныльская А.Л., Казаков Д.А., Леонтьева Г.В. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2010. Т. 53. Вып. 7. С. 3-7;
Volkhin V.V., Zharnylskaya A.L., Kazakov D.A., Leonteva G.V. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2010. V. 53. N 7. P. 3-7 (in Russian).
9. Агафонов А.В. Виноградов В.В. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2008. Т. 51. Вып. 11. С. 26-29; Agafonov A.V., Vinogradov V.V. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2008. V. 51. N 11. P. 26-29 (in Russian).
10. Barbe' C., Bartlett J., Kong L., Finnie K., Lin H.Q., Lar-kin M., Calleja S., Bush A., Calleja G. // Adv. Mater. 2004. V. 16. P. 1959-1966.
11. Radin S., Ducheyne P., Kamplain T., Tan B.H. // J. Biomedical. Res. 2001. V. 57. P. 313-320.
12. Ahola M., Sailynoja E.S., Raitavuo M.H., Vaahtio M.M., Salonen J.L, Yili-Urpo A.U.O. // Biomaterials. 2001. V. 22. P. 2163-2170.
13. Kortesuo P., Ahola M., Kangas M., Yli-Urpo T.A., Kies-vaara J., Marvola M. // Int. J. Pharm. 2001. V. 221. P. 107114.
14. Bottcher H., Slowik P., Suss W. // J. Sol-gel Sci. Technol. 1998. V. 13. P. 277-281.
15. Santos E.M., Radin S., Ducheyne P. // Biomaterials. 1999. V. 20. P. 1695-1700.
16. Siemenska L., Ferguson M., Zerda T.W., Couch E. // J. Sol- Gel Sci. Technol. 1997. V. 8. P. 1105-1109.
17. Ahola M., Kortesuo P., Kangasniemi L, Kiesvaara T.J., Yli-Urpo A. // Int. J. Pharm. 2000. V. 195. P. 219-227.
18. Lopez T., Manjarrez J., Rembao D., Vinogradova E., Moreno A., Gonzalez R.D. // Mater Lett. 2006. V. 60. P. 2903-2908.
19. Lopez T., Sotelo J., Navarrete J., Ascencio J.A. // Opt. Mater. 2006. V. 29. P. 88-94.
20. Sailaja G., Hogen-Esch H., North A., Hays J., Mittal S.K.
// Gene Therapy. 2002. V. 9. P. 1722-1729.
21. Brinker C.J., Scherer G.W. Sol-gel science: the physics and chemistry of sol-gel processing. San Diego: Academic Press. 1990. P.235-297.
22. Liu Z., Liu B., Zhang M., Kong J., Deng J. // Anal. Chim. Acta. 1999. V. 392. P. 135-141.
23. Yagar H., Sagiroglu A. // Acta Chim. Slov. 2002. V. 49. P. 893-902.
24. World Health Organization. Immunological Adjuvants. Technical Report Series 595. Geneva: World Health Organization. 1976.
25. Edelman R. // Rev. Infect. Dis.1980. V. 2. P. 370-383.
26. Lindbland E.B. // Immunology and Cell Biology. 2004. V. 82. P. 497-505.
27. Gregg S.J., Sing K.S.W. Adsorption, Surface Area and Porosity. London: Academic Press. 1982.
28. Brinker C.J., Scherer G.W. Sol-gel science: the physics and chemistry of sol-gel processing. San Diego: Academic Press. 1990. P. 212-213.
29. Yoon J-Y., Park H-Y., Kim J-H., Kim W-S. // J. Colloid. Inter. Sci. 1996. V. 177. P. 613-620.
30. Jung T., Kamm W., Breitenbach A., Hungerer K-D., Hundt E., Kissel T. // Pharm. Res. 2001. V. 18. N 3. P. 352-360.
31. Sharp F., Ruane D., Claas B., Creagh E., Harris J., Ma-lyala P., Singh M., O'Hagan D.T., Pétrilli V., Tschopp J., O'Neill L.A.J., Lavelle E.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2009. V. 106. P. 870-875.
32. Kreuter J. // J. Anat. 1996. V. 189. P. 503-505.
33. Mumper R.J., Cui Z., Oyewumi M.O. // J. Dispers. Sci. Technol. 2003. V. 24. N 3. P. 569-588.
34. Monfardini C., Veronese M. // Bioconjug. Chem. 1998. V. 9. P. 418- 450.
35. Kim G.J., Nie S. // Mater. Today. 2005. V. 8. P. 28-33.
36. Wu N.Z., Da D., Rudoll T.L., Needham D., Whorton A.R., Dewhirst M.W. // Cancer Res. 1993. V. 53. N 16. P. 3765-3770.
37. Xiang S.D., Scholzen A., Minigo G., David C., Aposto-lopoulos V., Mottram P.L., Plebanski M. // Methods.
2006. V. 40. N 1. P. 1-9.
38. Gutierro I., Hernández R.M., Igartua M., Gascón A.R., Pedraz J.L. // Vaccine. 2002. V. 21. N 1-2. P. 67-77.
39. Zaki T., Khalid I.K., Hassan H. // Ceramics International. 2012. V. 38. P. 2021-2026.
40. Sasani Ghamsari M., Ashor Said Mahzar Z., Radiman S., Abdul Hamid A.M., Rahmani Khalilabad S. // Materials Letters. 2012. V. 72. P. 32-35.
41. Huaming Y., Mingzhu L., Jing O. // Applied Clay Sci.
2010. V. 47. P. 438-443.
42. Boumaza A., Favaro L., Lédion J., Sattonnay G., Bru-bach J.B., Berthet P., Huntz A.M., Roy P., Tétot R. // J. Solid State Chem. 2009. V. 182. P. 1171-1176.
43. Ibrahima D.M., Abu-Ayana Y.M. // Mater. Chem. Phys. 2008. V. 111. P. 326-330.
44. Li X., King T.A. // J. Non-Cryst. Solids. 1996. V. 204. P. 235-242.
45. Yang H., Liu M., Ouyang J. // Appl. Clay Sci. 2010. V. 47. P. 438-443.
46. Steiner G., Tunc S., Maitz M., Salze R. // Anal. Chem.
2007. V. 79. N 4. P. 1311-1316.
47. Lee D.C., Haris P.I., Chapman D., Mitchell R.C. // Bio-chem. 1990. V. 29. N 39. P. 9185-9193.
48. Lan E.H., Dave B.C., Fukuto J.M., Dunn B., Zink J.L, Valentine J.S. // J. Mater Chem. 1999. V. 9. P. 45-53.
49. Cho Y.W., Han S. // Bull. Korean. Chem. Soc. 1999. V. 20. P. 1363-1364.
50. Flora K., Brennan J.D. // Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 4505-4513.
51. Lan E.H., Dunn B., Zink J.I. // Chem. Mater. 2000. V. 12. P. 1874-1878.
