CC BY
119
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.281.8:578.825.11].076
Н. Д. Львов1, А. С. Бавыкин2, А. В. Мельниченко2, А. В. Карпухин2
Блокирование функций гена RS1 вируса простого герпеса 2-го типа малыми интерферирующими РНк - новые перспективы для направленного противовирусного воздействия
'ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва; ^Учреждение Российской академии медицинских
наук Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
Выявлена новая мишень для таргетной терапии вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ2). Мишень представляет собой мРнК гена RS1, активация которого является ключевым этапом в регуляции экспрессии ранних генов ВПг-2. Обнаружено, что направленное выключение функции этого гена при помощи малых интерферирующих РнК (siRNA/миРНК) приводит к полному подавлению инфекции ВПг-2. Созданные интерферирующие РНК способны взаимодействовать с обоими типами - ВПГ-1 и ВПГ-2. Получены результаты, свидетельствующие о защитных свойствах миРНК в отношении цитопатического действия ВПГ-2 и отсутствии токсичности для инфицированных клеток Vero.
Ключевые слова: вирус простого герпеса 2-го типа, РНК-интерференция, малые интерферирующие РНК (миРНК/small interfering RNA), блокирование репродукции ВПГ-2
The blocking effects of small interfering RNAs on RS-1 gene functions of herpes simplex virus type 2: new perspectives for targeted antiviral exposure
N. D. Lvov1, A. S. Bavykin2, A. V. Melnichenko1, A. V. Karpukhin2
1D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow; 2Medical Genetics Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
A new target has been revealed for therapy for herpes simplex type 2. The target is RS1 mRNA whose activation is a key stage in regulating the expression of the early genes of herpes simplex virus type 2 (HSV-2). The targeted knockdown of the function of this gene by small interfering RNAs (siRNAs) has been found to result in the complete suppression of HSV-2 infection. The designed interfering RNAs are able to interact with both HSV-1 and HSV-2. The findings suggest that siRNAs have protective properties against the cytopathic effect of HSV-2 and cause no toxicity to infected Vero cells.
Key words: influenza virus, reassortant, hemagglutinin, neuraminidase, pandemic
Вирусы простого герпеса человека ВПГ-1 и ВПГ-2 убиквитарны с преобладанием бессимптомных форм носительства. Будучи иммунодефицитными патогенами вирусы герпеса обусловливают прогрессирующее снижение иммунного тонуса организма, что предрасполагает к системной диссеминации и поражению тканей и органов макроорганизма. Пан-тропные возможности герпесвирусов, их способность легко преодолевать гематоэнцефалический барьер предопределяют развитие системных заболеваний ЦНС, суставов, системы кровообращения, респираторного тракта, желудочно-кишечной и мочеполовой систем. Поражаются зрительный, слуховоспринимающий аппарат, нейрогуморальная, гормональная и цитокиновая сферы организма [1, 2].
В России обязательная регистрация герпеса половых органов (ГПО) введена лишь в 1993 г. Заболеваемость в стране превышает 16,3, а в Москве - 74,8 на 100 тыс. населения; количество больных с клиническими проявлениями ГПО составляет приблизительно 0,5-1%, а в США и Европе - до 6-10% взрослого населения, причем в США ежегодно регистрируют до 6-10 млн случаев генитального герпеса.
Вышесказанное определяет как острую социальную значимость проблемы, так и необходимость продолжения поиска средств для более эффективного блоки-
рования герпетической инфекции (ГИ) человека.
При блистательных возможностях современной противовирусной химиотерапии (системное воздействие, селективное блокирование вирусспецифических процессов, способность преодолевать гематоэнцефалический барьер, относительно слабый токсический эффект) есть и серьезные минусы: постепенное и неуклонное формирование лекарственной устойчивости, подчас носящее перекрестный характер, некоторые побочные эффекты при долговременной терапии вносят ряд ограничений в прогнозирование результата.
Настоящее исследование посвящено изучению блокирующих герпесвирусную репродукцию возможностей малых интерферирующих РНК (миРНК/small interfering RNA) в качестве основы для нового тар-гетного противовирусного соединения. Уникальность данного метода - возможность подбора и синтеза миРНК, способных на основе достаточно высокой гомологии [7] геномов ВПГ-1 и ВПГ-2 комплементарно взаимодействовать с мРНК обоих вирусов.
Целью работы было исследование эффективности использования РНК-интерференции для подавления ГИ на модели ВПГ-2 in vitro. В плане перспективности применения миРНК в качестве нового противовирусного средства решались такие задачи, как подавление вирусной репликации в ранних стадиях инфекции
Контактная информация:
Мельниченко Анна Валерьевна, канд. мед. наук, вед. науч. сотр.; e-mail:annamel73@yandex.ru
14
и защита клеток от цитопатического действия (ЦПД) вируса. Проводилась также оценка цитотоксичности вновь синтезированных миРНК на культуре клеток.
Материалы и методы
Клетки. В работе использовали перевиваемую клеточную линию почек зеленой мартышки Vero, любезно предоставленную лабораторией культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Клетки культивировали в концентрации 250-500 тыс/ мл в среде Игла-DMEM (производство ФГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10% ЭТС (НПО «ПанЭко», Москва) в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 98% влажности при 37°C.
Вирус. Использовали вирус простого герпеса человека 2-го типа (ВПГ-2) штамм «ВН», инфекционный титр которого составил 5 lg ТЦД/мл.
Малые интерферирующие РНК (миРНК). Поскольку в клинике и патогенезе вирусы герпеса 1-го и 2-го типа тесно связаны друг с другом, мы впервые подобрали такие миРНК, которые могли быть использованы сразу для обоих вирусов. В ходе сравнительного анализа консервативных участков всех генов ВПГ-1 и ВПГ-2 были выявлены 2 гена, которые содержали идентичные (100%) участки, удобные для взаимодействия с миРНК. Таким образом, были отобраны следующие гены: UL32 (соответствует гену UL30 ДНК-полимеразы ВПГ-1) и RS1 (ген, отвечающий за активацию транскрипции ДНК ВПГ-2, является аналогом функции гена ICP4 ВПГ-1). Синтезированные миРНК для каждой мишени представляют собой 2 нити длиной в 21 пару оснований в виде смысловой и антисмысловой нитей. Перед проведением трансфекции из нитей получали дуплексы, которые обеспечивают устойчивость миРНК для внутриклеточных нуклеаз.
Трансфекция. Трансфекцию миРНК проводили с помощью липофектамина с использованием набора для трансфекции (RNAiMAX, “Invitrogen”) интерферирующих РНК, предназначенного для клеточных линий, живущих в монослое. Клетки Vero были рассеяны на 48-луночные плато в количестве 1,2 • 105 за сутки до трансфекции таким образом, чтобы на следующий день после трансфекции достигнуть 50% монослоя. За сутки перед трансфекцией клетки перевели на среду ИГЛА (НПО «ПанЭко», Москва) с пониженным содержанием сыворотки (1%), без антибиотиков. Лунки с клетками были разделены на контрольные, без миРНК, без вируса (контроль клеток); контрольные, с вирусом, без миРНК (контроль вируса); контрольные с миРНК, без вируса и клетки с миРНК (контроль препарата), предварительно инфицированные вирусом. В работе использовали серийные 10-кратные разведения вируса (10-1, 100-2 и т. д.). Множественность инфицирования составила 10 и 100 ТЦД50/лунка. За 1 ч до трансфекции миРНК клетки были инфицированы ВПГ-2. После адсорбции вируса на клетках (через 1 ч инкубации) из лунок удаляли супернатант, вносили смеси миРНК с липофектамином в режиме прямой трансфекции согласно протоколу набора (RNAiMAX, “Invitrogen”) и помещали в термостат при 5% CO2 и 37°C. Смеси миРНК с липофектамином готовили в соответствии с инструкцией набора. Конечная концентрация миРНК в лунках составляла от 8 до 50 нМ. Инкубацию клеток с миРНК проводили в течение 5
сут до полного лизиса клеток.
Результаты и обсуждение
Использование миРНК в современной медицине приобретает значительные масштабы благодаря простоте их синтеза и производства. Эти соединения удобны для химических модификаций и могут быть адаптированы к различным видам носителей (белковых, полиэтиленгликоля, липосом и др.) для терапевтической доставки в клетки [3, 4]. Кроме того, последовательности миРНК могут быть внедрены в состав экспрессирующих векторов с целью длительного поддержания их концентрации в клетках [5]. Основной особенностью и преимуществом интерферирующих РНК с точки зрения таргетной противовирусной терапии является целенаправленное использование миРНК для подавления экспрессии нужных вирусных белков. Сходство вирусных геномов ВПГ-1 и ВПГ-2 [7] позволило подобрать миРНК для наиболее консервативных участков в области двух генов. В результате сравнительного анализа последовательностей геномов ВПГ-1/2 были выбраны гены RS1 и UL32.
£ 100 -| 90 -
* о 80 -
ф § 70 -
.0 н о 60 -
о X 50 -
V0 О С) 40 -
о с С) 30 -
ф X со 20 -
X * 10 -
0 -
♦-----
*
1 сут 2 сут 5 сут
• RS1 UL32
Рис. 1. Жизнеспособность клеток Vero, инфицированных дозами 10 и 100 ТЦД/лунка ВПГ-2 в присутствии миРНК к генам RS1 и UL32.
Инкубация клеток в среде с добавлением миРНК продолжалась в течение 5 сут. При дозировке вируса 10 ТТ^р/лунка (а) кривая выживаемости клеток с подавленной экспрессией гена RS1 совпадает с таковой в отрицательном контроле (клетки без вируса - контроль клеток - КК). Цитопатическое действие препарата (КП, контроль препарата - клетки без вируса, с добавлением миРНК) не наблюдается и кривая выживаемости совпадает с кривыми КК и RS1. При дозе воздействия вируса 100 ТЦД^/лунка (б) защитные функции обеих миРНК практически не различаются. КВ - контроль вируса.
15
5 i
Рис. 2. Снижение инфекционности ВПГ-2 при воздействии миРНК к генам RS1 и UL32.
Анализ ЦПД интактных клеток Vero, обработанных дозами вируса 10 ТЦД50/лунка с последующим добавлением миРНК, проводили в течение 48 ч. КВ - контроль вируса, клетки, обработанные суспензией из КВ (10 ТЦД5о/лунка) - лунок первого этапа. Объяснение в тексте.
Основой выбора также послужило принятие в расчет значимости функций данных генов в репликации вирусов. Особенностью экспрессии генов ВПГ является очередность активации ранних и поздних генов. Ген RS1 обладает регуляторными функциями в отношении экспрессии ранних генов ВПГ-2 и служит ключевым фактором транскрипции. Ген UL32 соответствует по положению гену UL30 ВПГ-1, который кодирует большую субъединицу вирусной ДНК-полимеразы.
На первом этапе исследования оценивали цитотоксичность миРНК на клетках Vero, при этом токсичность для клеток при использовании различных концентраций (4-50 нМ) миРНК не обнаружена. Далее проводили исследования для оценки защитных свойств миРНК на жизнеспособность клеток Vero после инфицирования их ВПГ-2. Для этого предварительно инфицированные клетки (10 и 100 ТЦД50/лун-ка) были обработаны суспензией, содержащей 8 нМ миРНК-дуплексов (см. в разделе «Материалы и методы» киРНК) к генам RS1 и UL32 в составе липосом-ных частиц, липофектамина RNAiMAX (“Invitrogen”). Для достижения воспроизводимости результатов каждая экспериментальная лунка имела троекратный повтор. Инкубацию клеток осуществляли в течение 5 сут до достижения полного лизиса клеток вирусом в контрольных лунках. В результате эксперимента выявлена 100% защита от цитопатического действия вируса клеток Vero, которые трансфицировали миРНК к гену RS1. Защита клеток при использовании миРНК-UL32 в среде с дозой вируса 10 ТЦД50/лунка (рис. 1, а) оказалась менее выраженной. В случае использования дозировки ВПГ-2 100 ТЦД50/лунка защитные свойства миРНК RS1 и UL32 практически совпадают (см. рис. 1, б). Эти результаты свидетельствуют о более значимой роли гена RS1 для репликации ВПГ-2.
На следующем этапе оценивали инфекционность вируса после воздействия миРНК (определение инфекционного титра вируса). С этой целью отбирали вируссодержащую суспензию из всех лунок первого этапа с дозой 10 ТЦД50/лунка и инфицировали монослой клеток в 48-луночных плато для титрования вируса по классической методике. Титр ВПГ-2 определяли по ЦПД на клетках в логарифмических значениях тканевой цитопатической дозы (ТЦД50/мл) на каждые сутки (рис. 2). Было обнаружено, что нокдаун экспрес-
16
сии RS1 по сравнению с UL32 оказывает выраженное ингибирующее действие на титр ВПГ-2. Так, в первые 24 ч при действии миРНК-UL32 наблюдается снижение инфекционного титра вируса в 10 раз (титр составил 1 lg ТЦД50/мл) и полное ингибирование вирусной активности при использовании миРНК-RS!, в то время как в контроле титр вируса составил 2 lg ТЦД/мл. Через 48 ч титр вируса в присутствии миРНК-RS1 оставался на прежнем уровне (0 lg ТЦД50/мл) по сравнению с увеличенным до 2 lg ТЦД50/мл титром при миРНК-UL32. Титр ВПГ-2 в контроле вируса составил 5 lg ТЦД50/мл. Таким образом, показано, что выбранная последовательность гена RS1 является наиболее оптимальной мишенью для РНК-интерференции при любых использованных дозировках. Полученные нами результаты в определенной степени согласуются с опубликованными данными китайских ученых [6], которые свидетельствуют об успешном использовании миРНК, гомологичных гену ICP4, при работе с ВПГ-1. Однако миРНК к генам RS1 и UL32 на модели ВПГ-2 ранее не использовали. Кроме самостоятельного использования, миРНК может быть внедрена в терапию ВПГ-2 в комбинации с уже существующими препаратами химиотерапии. Так, при работе с раковыми клетками в результате ранее проведенных исследований у нас [8], а также за рубежом [9] было показано, что использование миРНК увеличивает чувствительность раковых клеток к гораздо меньшим концентрациям химиопрепарата. При этом наблюдается усиление терапевтического эффекта и может на порядок снижаться токсичность препарата. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о перспективной возможности применения миРНК для подавления инфекции ВПГ-1/2. Дальнейшие исследования будут направлены на индивидуальное применение миРНК, а также на совместное использование ее с известными противовирусными средствами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Львов Н. Д. Разработка лечебных противогерпетических препаратов и диагностических тест-систем: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - М., 1992.
2. ЛьвовН. Д. Герпесвирусы - лимфопролиферативная иммунодефицитная патология человека // Изучение эволюции вирусов в рамках проблем биобезопасности и социально значимых инфекций: Материалы науч. конф. (24 февраля 2011 г.). - М.: РАМН, 2011. - С. 108-121.
3. Bavykin A. S. A combination of anti-IAP interfering RNAs and chemotherapy induce efficient colon tumor cell apoptosis under drug small dozes // Eur. J. Hum. Genet. - 2010. - Vol. 18 (suppl. 1). - P. 129.
4. CarmonaS., JorgensenM. R., Kolii S. et al. Controlling HBV replication in vivo by intravenous administration of triggered PEGylated siRNA-nanoparticles // Mol. Pharm. - 2009. - Vol. 6. - P. 706-717.
5. Chen Y., Bathula R. B., Li J., Huang L. Multifunctional nanoparticles delivering small interfering RNA and doxorubicin overcome drug resistance in cancer // J. Biol. Chem. - 2010. - Vol. 285, N 29. - P. 22639-22650.
6. Dolan A., Jamieson F E., Cunningham C. et al. The genome sequence of herpes simplex virus type 2 // J. Virol. - 1998. - Vol. 72, N 3. - P. 2010-2021.
7. Liu Y. T., SongB., Wang Y. L. et al. Si RNA targeting ICP4 attenuates HSV-1 replication // Bing Du Xue Bao. - 2010. - Vol. 26, N 3. - P. 163-169.
8. McIntyre G. J., Arndt A. J., Gillespie K. M. et al. A comparison of multiple shRNA expression methods for combinatorial RNAi // Genet. Vaccines Ther. - 2011. - Vol. 9, N 9. - P. 9.
9. SurendraN., Nidhi G., Ramesh C. Strategies and advances in nanomedicine for targeted siRNA delivery // Nanomedicine. - 2011. -Vol. 6, N 4. - P. 729-746.
Поступила 29.09.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.281.8.03:616.36-002-022].015.44
В.. В. Зарубаев1, А. В. Слита1, А. К. Сироткин1, С. В. Беляевская1, В. Е. Небольсин2, Д. В. Рейхарт3,
О. И. Киселев1
Влияние Ингавирина® на ультраструктурные особенности морфогенеза аденовирусной инфекции in vivo
'ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург; 2ОАО «Валента Фарм», Москва;
3Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова
Целью настоящего исследования была оценка влияния Ингавирина® на морфологические особенности очагов аденовирусного гепатита у сирийских хомяков при помощи электронной микроскопии. Показано, что использование препарата приводит к существенному снижению интенсивности деструктивных процессов и воспалительных реакций в печени, нормализуя ее структуру на уровне организации как ткани в целом, так и отдельных гепатоцитов. Морфогенез аденовирусной инфекции в инфицированных гепа-тоцитах в присутствии Ингавирина® не отличается от такового в контроле, однако количество инфицированных клеток было меньше. Доля морфологически неполноценных вирионов на фоне Ингавирина® возрастала с 35 до 46%. Полученные результаты позволяют рассматривать Ингавирин® как эффективный препарат, оказывающий противовирусное, противовоспалительное и цитопротективное действие в очаге аденовирусного поражения ткани.
Ключевые слова: аденовирус, вирусный гепатит, Ингавирин®, противовирусные препараты, электронная микроскопия
Effect of Ingavirin® on the ultrastructure of the morphogenesis of adenovirus
infection in vivo
V. V. Zarubayev1, A. V. Slita1, A. K. Sirotkin1, S. V. Belyaevskaya1, V. E. Nebolsin2, D. V. Reikhart?,O. I. Kiselev1
'Research Institute of Influenza, Ministry of Health and Social Development of Russia, Saint Petersburg;
2OAO Valenta Pharm, Moscow; 3I. M. Sechenov First Moskow State Medical University
The goal of this study was to evaluate the effect of Ingavirin® on the morphological features of the foci of adenovirus hepatitis in Syrian hamsters by electron microscopy. the use of the drug was shown to cause a substantial reduction in the rate of destructive processes and inflammatory reactions in the liver, by normalizing its structure at the levels of both tissue and individual hepatocytes. After administration of Ingavirin®, the morphogenesis of adenovirus infection in the infected hepatocytes did not differ from that in the controls; however, the infected cells were fewer. the proportion of morphologically inadequate virions in the presence of Ingavirin® increased from 35 to 46%. the findings suggest that Ingavirin® is an effective drug that has antiviral, anti-inflammatory, and cytoprotective activities in the focus of adenovirus tissue involvement.
Key words: adenovirus infection, viral hepatitis, Ingavirin®, antivirals, electron microscopy
Проблема поиска химиопрепаратов, способных эффективно подавлять репродукцию аденовирусов и перспективных для практической медицины, весьма важна. Это обусловлено тем, что аденовирусы широко распространены, вызывают разнообразные по клиническим проявлениям и часто тяжело протекающие заболевания и, кроме того, устойчивы к большинству уже известных препаратов, эффективных в отношении других ДНК-геномных вирусов. У иммунокомпетентных пациентов аденовирусная инфекция протекает относительно легко, однако представляет серьезную угрозу для людей с иммунодефицитом, приводя к тяжелым последствиям вплоть до летального исхода [17].
Официально рекомендованные препараты для лечения аденовирусной инфекции в настоящее время отсутствуют [5]. Ряд аналогов нуклеотидов проявлял активность in vitro в отношении аденовируса [12, 13]. Данные о противовирусной активности широко распространенного препарата Рибавирина противоречивы и свидетельствуют о его активности [7, 29], слабой активности [14] или отсутствии антиаденовирусной активности [8, 22]. Ганцикловир проявлял эффективность как in vitro, так и in vivo [9, 30]. Цидо-
фовир, разработанный на основе ^)-1-(3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил) цитозина, характеризовался высоким уровнем противовирусной активности [16, 18-20, 26-28]. Все три нуклеотидных аналога были использованы для терапии аденовирусных патологий человека, включая гепатиты, циститы и пневмонии при иммунодефицитных состояниях у реципиентов органов [7-9, 29]. Серьезные побочные эффекты и появление устойчивых штаммов аденовируса ограничивают их использование [10, 16, 26].
Рост вируса в клеточной культуре может быть ингибирован катехинами зеленого чая [31], хотя и в высоких концентрациях. Другие классы соединений -имидазохинолинамины [25], липиды [21], акридоны [32], другие аналоги нуклеозидов [6, 12, 13, 23, 24, 33] - также обладают антиаденовирусной активностью.
В отношении препаратов интерферона следует сказать, что аденовирусы обладают эффективными механизмами подавления интерферониндуцированного ответа [34], поэтому устойчивы к действию интерферона и его индукторов и не могут считаться основным средством терапии при тяжелых случаях инфекции.
Ранее нами была продемонстрирована ингибирую-
Контактная информация:
Зарубаев Владимир Викторович, канд. биол. наук, зав. лаб.; e-mail:zarabaev@influenza.spb.ra
17
