CC BY
70
БИОМЕДИЦИНСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
БИОЦ ИМ В
ШНОГО 1Я ИСКРОВОГО РАЗРЯДА itro и in vivo
ав. научной группой физико-химических воздействий НИИ прикладной медицины;
, к.б.н., доцент кафедры микробиологии и иммунологии
одская государственная медицинская академия, Н. Новгород
Biocydic effect of the spark discharge non-coherent impulse radiation in experiments in vitro and in vivo
I.P. Ivanova, BD, head of a physicochemical effect scientific group of the SRI of applied and fundamental medicine;
M.I. Zaslavskaya, c.b.s., assistant professor of a microbiology and immunology chair Nizhny Novgorod state medical academy, N. Novgorod
The aim of work is investigation of the spark discharge plasma non-coherent impulse radiation (NCIR) use possibility as a factor capable of the microorganism growth and reproduction suppression in experiments in vitro and in vivo. The tasks of the bacteriostatic, bactericidal and fungicidal effect study, as well as the free-radical process level assessment in experiments in vitro and in vivo after the spark discharge plasma NCIR effect, were solving.
Materials and methods. A non-coherent impulse radiation in optical range of 180—800 nm was generated in a process of a highly energetic spark discharge initiation with a use of experimental device, created on a base of the ARSRIEPh (Sarov).
The microorganism cultures S. epidermidis, strain 51-1; E. coli, strain 18M and C. albicans, strain 601 from the NNSMA microbiology and immunology chair museum are used in work. The bacterial suspensions were irradiated in modes of 5 to 600s, there was inoculation of the corresponding selective media after treatment. The intact microorganism suspension was used as a control. An assessment of the free-radical reaction level after a NCIR treatment was made in the microorganism suspension with a method of induced chemiluminescence (Fe3+ and H2O2) at a biochemiluminometer BChL-6.
An assessment of fungicidal effect and free-radical homeostasis of animals after a non-coherent impulse radiation effect in experiments in vivo is made on 72 laboratory rat-males of the Wistar line with a mass of 200±10g by 12 samples in each series. All manipulations with animals were made with a use of ether anesthesia. The animals were divided into 6 series: the intact ones, effect of 100s, effect of 300s, contaminated C. albicans and effect of 100s, contaminated C. albicans and effect of 300s. The animals were infected perorally with a C. albicans suspension. The oral cavity irradiation with a NCIR has been made during 100 or 300s, in each 24 hours during 6 days after contamination. A concentration of C. albicans in the oral cavity was detected at the 7th day of contamination (in 24h after the last irradiation). An assessment of a free-radical homeostasis of animals after a NCIR treatment was made according to the blood plasma and erythrocyte free-radical reaction level, which was studied with a method of induced chemiluminescence.
Results. Both bacteriostatic and biocydic effects of the spark discharge gas discharge plasma NCIR, as well as an increase of the free-radical process level in experiments in vitro and in vivo are established. It is revealed, that a NCIR of the gas discharge plasma possesses of 100% of a bactericidal and fungicidal effect at the bacterial suspension treatment during 200s in experiments in vitro. A bacteriostatic effect of a NCIR is demonstrated in experiments in vivo. The free-radical process level after a NCIR effect was increased in the cell suspension in experiments in vitro, that radiation in a microorganism activates the free-radical processes at the erythrocyte membranes in the studied modes.
Key words: microorganisms, plasma of the spark discharge, biocidic effect.
* Иванова Ирина Павловна, тел. раб. 8(831) 465-42-81; e-mail: ivanova.ip@mail.ru
//////////////////////^^^^
28 СТМ i 2009 - 1 И.П. Иванова, М.И. Заславская
БИОМЕДИЦИНСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
В последние годы ведутся исследования, направленные на использование стерилизующего эффекта газоразрядной плазмы. При генерации высоковольтного импульсного разряда в воздухе генерируются заряженные частицы, активные продукты плазмохимических реакций, некогерентное излучение оптического диапазона [1—3]. Эти факторы способны инициировать окислительно-восстановительные процессы в воде и окислять органические вещества [4, 5]. Кинетическая энергия частиц, ионов, квантов в плазме разряда существенно превышает энергию, необходимую для инактивации как вирусов, так и микроорганизмов [6]. Стерилизующий эффект инвазивного воздействия газоразрядной плазмы на небиологические объекты представлен в литературе [7]. Однако до настоящего времени недостаточно изучены бактерицидные свойства и биологические эффекты некогерентного светового импульсного излучения (НИИ) газоразрядной плазмы в экспериментах in vitro и in vivo, когда воздействие осуществляется не плазмой разряда, а только излучением плазмы.
Цель работы — изучение возможности использования некогерентного импульсного излучения плазмы искрового разряда в качестве фактора, способного подавлять рост и размножение микроорганизмов в экспериментах in vitro и in vivo.
В задачи исследования входило изучение бакте-риостатического, бактерицидного и фунгицидного эффектов, а также оценка уровня свободно-радикальных процессов в экспериментах in vitro и in vivo после воздействия некогерентным импульсным излучением плазмы искрового разряда.
Материалы и методы. НИИ в оптическом диапазоне 180—800 нм генерировалось в процессе инициации высокоэнергетического искрового разряда при помощи экспериментального устройства, созданного на базе ВНИИЭФ (г. Саров). Частота генерации импульсов составляла 1 Гц, длительность одного импульса — 10—50 мкс, энергия одного импульса — 5 Дж. Воздействие НИИ на биологические субстраты и ротовую полость животных осуществляли в режимах от 5 до 600 с. Расстояние от источника излучения до объекта составляло 1,5—2,0 см.
Бактериальные суспензии S. epidermidis, штамм 51-1; E. coli, штамм 18М и C. albicans, штамм 601 (полученные из музея кафедры микробиологии и иммунологии НижГМА) облучали в режимах от 5 до 600 с, предварительно клетки ресуспендировали в забуференном физиологическом растворе до концентрации 5-104 кл./мл. После обработки НИИ бактериальной взвеси объемом 2 мл отбирали 0,1 мл для посева на желточно-солевой агар (S. epidermidis), агар Эндо (E. coli), агар Сабуро (C. аlbicans). В качестве контроля использовали интактную взвесь микроорганизмов. Чашки с посевами термостати-ровали (37°С, 24 ч), после чего подсчитывали количество колоний на агаре. Каждая серия экспериментов in vitro проведена пятикратно.
Оценку уровня свободно-радикальных реакций
после обработки НИИ проводили во взвеси C. albicans методом индуцированной хемилюминес-ценции (ХЛ) (Fe3+ и Н2О2) на биохемилюминометре БХЛ-6 [8].
Для оценки фунгицидного эффекта НИИ и свободно-радикального гомеостаза животных после воздействия НИИ в экспериментах in vivo были проведены исследования на 72 лабораторных крысах-самцах линии Wistar массой 200±10 г. Животные содержались в стационарных условиях вивария на стандартном рационе. Все манипуляции с животными проводили с применением эфирного наркоза. Животные были разбиты на следующие серии (по 12 штук): интактные — позитивный контроль, воздействие НИИ в течение 100 с, воздействие НИИ в течение 300 с, контаминированные C. albicans — негативный контроль, контаминированные C. albicans и воздействие НИИ в течение 100 с, контаминированные C. albicans и воздействие НИИ в течение 300 с.
Животных заражали перорально 0,2 мл суспензии C. albicans, штамм 601 в физиологическом растворе, концентрация микроорганизмов составляла 5-104 кл./мл [9, 10]. Выраженность фунгицидного эффекта НИИ (мазок из ротовой полости и посев на агар Сабуро) оценивали спустя 7 сут. Облучение ротовой полости НИИ проводили в течение 100 или 300 с через каждые 24 ч в течение 6 сут после заражения. Определяли концентрацию C. albicans в ротовой полости на 7-е сутки от момента заражения (через 24 ч после последнего облучения).
Оценку свободно-радикального гомеостаза животных после обработки НИИ проводили по уровню свободно-радикальных реакций плазмы крови и эритроцитов, который изучали методом индуцированной ХЛ [7].
результаты исследования. Во всех экспериментах после воздействия НИИ на взвесь исследуемых культур микроорганизмов наблюдалось снижение количества колоний. При обработке в течение 25 с НИИ угнетало рост микроорганизмов, в течение 200 с и более — приводило к отсутствию колоний на чашках по сравнению с контрольной серией. Отмечена высокая эффективность бактерицидного и фунгицидного эффектов НИИ (табл. 1), а также зависимость эффекта от дозы облучения.
Исследование уровня ХЛ кандид показало значительное его увеличение после воздействия НИИ в режимах до 100 с (см. рисунок), что указывало на активацию свободно-радикальных процессов в клетках. Однако после обработки суспензии C. albicans в течение 600 с ХЛ была ниже, чем в контроле. Более низкий уровень ХЛ после увеличения времени экспозиции НИИ, возможно, связан с рекомбинационными процессами свободно-радикальных продуктов.
Возрастание уровня ХЛ после воздействия НИИ свидетельствует об активации свободно-радикальных процессов в клетках. А возрастание уровня свободных радикалов, как известно, ведет к образо-
Биоцидный эффект некогерентного импульсного излучения искрового разряда в экспериментах in vitro и in vivo СТМ \ 2009 - 1 29
