CC BY
67
БИОТЕСТИРОВАНИЕ ЗАГРЯЗНЕННОЙ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ ПОЧВЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНФУЗОРИЙ
1А.П. Баранов, 2Л.П. Воронина, д.б.н., 1М.И. Лунев, д.б.н.
1ВНИИ агрохимии им. Д.Н. Прянишникова, e-mail: [email protected] 2МГУ им. М.В. Ломоносова, e-mail: [email protected]
Рассмотрены вопросы оценки загрязнения почв с использованием биотестирования на инфузориях. Проведено обоснование необходимости использования комплекса биотестов элюатного и контактного типов. Метод оценки токсичности ТМ почвы на основе биотестирования водного экстракта из почвы с использованием инфузорий имеет существенные ограничения, связанные как с низким выходом ТМ в водный экстракт, так и с образованием в данном экстракте хе-латированных и комплексных соединений, не проявляющих токсических эффектов на данную тест-культуру в ходе 1-3-суточного биотестирования. Комплекс биотестов для определения почвенной токсичности должен включать как элюатный, так и контактный метод. Их совокупность позволяет давать объективную оценку хронического загрязнения почвы прочнозакреп-ленными или малорастворимыми токсикантами, создающими хроническую токсичность, такими как: тяжелые металлы, хлорорганические пестициды, полиароматические углеводороды, нефтепродукты и т.п.
Ключевые слова: загрязнение почвы, биотестирование, тяжелые металлы, хелатирование, токсичность, фульвокислоты, комплексные соединения.
BIOASSAY, SOIL CONTAMINATED WITH HEAVY METALS USING CILIATES
1A.P. Baranov, 2Dr. Sci. L.P. Voronina, lDr. Sci. M.I. Lunev
1ARSRI for Agrochemistry named after D.N. Pryanishnikov, e-mail: [email protected] 2Moscow Lomonosov State University, e-mail: [email protected]
The article deals with estimation of soil pollution using bioassay on the ciliates. Held the rationale for the use of complex bioassays eluate and contact types. Method for assessing the toxicity bioassay HM soil water extract from the soil with the use of ciliates has significant limitations associated both with low HM obtain an aqueous extract and to form a chelate complex and compound does not exhibit toxicity in 1-3 day bioassay. The complex bioassays to determine toxicity of the soil should include both the eluate and the contact method to give an objective assessment of the pollution caused by adsorbed or poorly soluble toxicants, creating chronic toxicity of soils, such as heavy metals, organochlorine pesticides, polyaromatic hydrocarbons, oil products pollution, etc.
Keywords: soil pollution, bioassay, heavy metals, chelation, toxicity, fulvic acids, complex compounds.
Инфузории могут служить идеальной моделью для различных токсикологических и экотоксиколо-гических экспериментов. Преимущества методов биотестирования на инфузориях в качестве тест-объектов связаны с простотой, низкой себестоимостью анализов и большой экспрессностью [1]. Значимость биотестирования почв с использованием инфузорий, прежде всего, заключается в экологическом аспекте получаемых результатов: с помощью инфузорий можно определять растворимые, т.е. подвижные фракции загрязнителей, представляющие опасность для окружающей среды. Уровень чувствительности инфузорий для оценки загрязнения окружающей среды экспериментально подтвержден и считается одной из основных причин широкого применения инфузорий рода Tetra-hymena и Paramecium в мониторинге тяжелых ме-
таллов [2, 3]. Однако в некоторых исследованиях почвы с содержанием тяжелых металлов (ТМ), многократно превышающем допустимые уровни загрязнений, при биотестировании с использованием инфузорий токсичность почвы не обнаруживалась. Эти биотесты, выполненные как в рамках широких мониторинговых исследований территорий, так и модельных опытов, очевидно показали отсутствие реакции инфузорий на металлы при уровнях загрязнения по 2п, РЬ и Cd соответственно 2000 мг/кг, 1000 мг/кг и 20 мг/кг [4]. Кроме того в исследованиях по сравнительному биотестированию почвы с использованием различных тест-культур отмечалось, что наименьшая чувствительность была выявлена у инфузорий [5].
Цель исследования - изучение возможных факторов снижения эффективности биотестирова-
ния с использованием инфузорий при оценке загрязнения почвы ТМ.
Объекты и методы. Для биотестирования использовали водные экстракты дерново-подзолистой, суглинистой почвы со следующими характеристиками: органическое вещество 1,89%, pHKCl 4,6, содержание фульвокислот 0,63% (С фульвокислот), ем-кость катионного обмена (ЕКО) 10,01 мг-экв/100 г почвы, содержание ТМ в аммиачно-ацетатном буфере (ААБ - 4,8), Cd 0,05 мг/кг, Pb 0,28 мг/кг, Си 1,02 мг/кг, содержание ТМ в водном экстракте - Сd 0,8 мкг/л, Pb 21,3 мкг/л, Си 18,3 мкг/л.
Для биотестирования готовили модельные образцы на основе исходной почвы с контрольным содержанием кадмия и свинца, соответственно 5 и 100 мг/кг почвы. Модельные растворы с фульвокислота-ми (ФК) готовили, применяя нативные ФК, предварительно выделенные из данной почвы по методике [6]. Модельные растворы со смесью низкомолекулярных органических кислот с концентрацией 30 цМ/л (уксусная, муравьиная, лимонная, яблочная) готовили в соотношении соответственно 4:1:1:1, с учетом данных по их содержанию в почвах.
Для приготовления тестируемых растворов были использованы соли тяжелых металлов -Cd(NOз)2, Pb(NOз)2, ШТ^Ь Получение почвенных зкстрактов для биотестирования с использованием инфузорий проводили по методике определения токсичности отходов ФР 1.39.2006.02.506.
В эксперименте по сравнению токсичности загрязнителей в воде и почвенном экстракте биотестирование почвенных экстрактов начинали не позднее чем через 30 мин. после введения в них солей ТМ. Для биотестирования использовали культуры Те^акутепа pyriformis, ТеШкутепа /кеторкИа c высокой плотностью популяции.
Культивирование проводили в условиях термостата при 28±0,5°С, рН 7,4-7,6. При соблюдении данных параметров продуктивность культуры тет-рахимен за 24 ч. составляла 1,5. Во всех опытах использовали трехсуточную культуру инфузорий, калиброванную по модельному токсиканту (K2Cr2O7). Подсчет результатов суточной экспозиции инфузорий проводили с использованием автоматизированной системы БиоЛаТ [7].
Результаты. В таблице 1 представлены данные биотестирования почвы, загрязненной ТМ и мета-фосом, выраженные как изменение количества живых клеток инфузорий, находящихся в почвенном экстракте исследуемых образцов в течение суток. Установлено, что численность клеток культуры в чистом почвенном экстракте в течение суток почти удваивается. Метафос оказывает острое токсическое действие, в то время как существенные дозы ТМ не оказывают влияния по сравнению с контролем.
1. Токсичность модельных образцов при
биотестировании с Те/гаИутепа pyriformis
Токсикант Содержание в Коэффициент суточного
почве, мг/кг роста культуры*
Контроль (без токсиканта) - 1,74±0,15
Метафос 1 0,33±0,09
Cd 5 1,76±0,24
РЬ 100 1,89±0,13
* отношение числа живых клеток: начало биотестирова-
ния/через сутки
Отсутствие реакций инфузорий при биотестировании ТМ в модельных образцах можно объяснить степенью их сорбции твердой фазой данной почвы при водной экстракции. Содержание кадмия в водном экстракте модельного образца почвы c внесенной дозой соли кадмия было определено методом атомно-абсорбционной спектрометрии и составило 0,9 цг/л, что вполне согласуется с литературными данными по распределению ТМ между фазами почвы, для разных типов почв [8]. При том, что показатель токсичности LD 50/2часа (гибель 50% популяции) по кадмию в воде для Те^акутепа руп-formis составляет 24 мг/л [9], очевидно, что концентрации ТМ в почвенном растворе не могут вызвать существенный для инфузорий токсический эффект. В то же время токсичность метафоса, внесенного в дозе 1 мг/кг, согласуется с уровнем его растворимости в воде 55 мг/л [10].
Следующий эксперимент по биотестированию почвенных экстрактов с непосредственно внесенными в них дозами токсикантов показал кратные уровни снижения токсичности для инфузорий в почвенном растворе по сравнению с токсичностью этих же концентраций в воде. Высокие дозы, значительно превышающие концентрации, присутствующие в почвенном растворе в естественных условиях, были взяты, чтобы наиболее очевидно показать влияние исследуемого фактора.
В таблице 2 показано значительное снижение токсичности в почвенном экстракте по величинам LD 50-24, рассчитанным по методу пробит-анализа. С учетом того, что в данном модельном опыте концентрации введенных металлов значительно превышают концентрации, реально присутствующие в почвенном растворе, можно судить о низкой эффективности биотестирования водного экстракта с использованием гидробионтов. Данные показывают различия в уровнях снижения ТМ и инсектицида.
В таблице 3 показаны величины суточного прироста клеток Те^акутепа /кеторкИа в средах c ФК и без них: воде (без ФК), почвенном экстракте (с ФК), почвенном экстракте (без ФК). Наиболее остро действие ФК проявилось в воде с высокой дозой кадмиевой соли 0,5 мг/л, приведшей к гибели культуры (лизису клеток) в воде. В результате де-токсицирующего действия ФК почвенного экстракта
состояние культуры характеризуется показателем 1,33. На эффект действия именно этой группы органических веществ почвенного экстракта указывает вариант с почвенным экстрактом без ФК. (В соответствии с методикой выделения ФК из почвы, все коэкстрактив-ные вещества были возвращены в почвенный экстракт, кроме очищенных ФК). Полученные результаты говорят о достоверной способности метаболизма инфузорий выдерживать большие нагрузки хелатированных токсикантов.
Сравнение вариантов с водой и вариантов почвенных экстрактов без ФК указывает на действие других детоксициру-ющих веществ почвенного экстракта.
В таблице 4 показано сравнительное влияние на токсичность металлов действия ФК, а также низкомолекулярных органических кислот, присутствующих в почве, и образующих с ТМ хелатные и комплексные соединения. Данные эксперимента демонстрирует разный уровень детоксицирующего действия ФК и НОК на ТМ и фосфорорганический инсектицид.
Причиной существенного снижения реакции инфузорий в процессе биотестирования загрязненных почв может служить как низкое содержание водорастворимых форм ТМ (0,1-1,0% от общего содержания их в почве [11]), так и их инертность в результате взаимодействия с растворимыми органическими соединениями почвы.
В работе Н.А. Куликовой с соавторами [12] на примере водной экстракции дерново-под-золистых почв показан уровень выхода в раствор не только фульвокислот, но и гуминовых кислот в объеме, достаточном для полного хела-тирования ТМ. Таким образом, металлы могут связываться и образовывать неактивные для гидробионтов соединения еще и в процессе подготовки почвенного образца в ходе водной экстракции.
Приведенные данные дают основания предполагать, что действие металлов не проявляется достаточно существенно при оценке интегральной токсичности почвы в случае биотестирования водного экстракта образца почвы с использованием инфузорий в рамках опыта по острой токсичности. В то же время биодоступность труднорастворимых прочносорбированных загрязните-
лей может быть более эффективно оценена контактным (ап-пликатным) методом биотестирования с использованием поч-вообитающих организмов для оценки хронической токсичности почв. Таким условиям вполне соответствует недавно утвержденная в федеральном реестре методика измерения токсичности почв по реакциям энхитреид (ФР 1.39.2014.18039.
Нельзя не отметить широкую практику применения контактных методов при оценке почвенных загрязнений в зарубежных мониторинговых системах, где наибольшее использование получили биотесты с педобионтами: дождевыми червями, энхитреидами, коллемболами, а также с высшими растениями [13].
Наибольшую эффективность метод контактного биотестирования имеет в условиях загрязнения адсорбированными веществами, ТМ или веществами, труднорастворимыми в водной среде, такими как полихлорированные бифенилы, диоксины, полиароматические углеводороды, хлорорганические пестициды, компоненты нефти и т.п. В этой связи нужно отметить, что большинство стандартизированных в РФ методик (внесенных в федеральный реестр (ФР) и реестр природоохранных нормативных документов (ПНД Ф)) используют для оценки токсичности почвы гидробионты или другие тест-культуры в водной почвенной вытяжке [14].
2. Сравнительная токсичность в воде и почвенном
экстракте солей ТМ и метафоса _для ТеЛгакутепа pyriformis_
Токсикант LD 50 (24 ч) LD 50 (24 ч) цМ/Ь Кратность снижения
цМ/Ь в воде в экстракте токсичности в экс-
П 6 п 6 тракте
Cd 4,2 42,3 10,7
Pb 105,7 861,8 8,1
^ 76,9 694,5 9,0
Метафос 0,093 0,32 3,4
3. Влияние фульвокислот на токсичность
водной вытяжки для ТеЛгакутепа ЛкегторкИе
Токсикант Концентрация, мг/л Коэффициент суточного роста культуры
вода экстракт экстракт (без ф/к)
1,59 1,78 1,1
Cd 0,1 0,79 1,79 0,95
0,5 гибель клеток 1,33 гибель клеток
Pb 5,0 1,22 1,56 1,34
25,0 1,31 1,02 1,25
4. Действие фульвокислот и низкомолекулярных
органических кислот на детоксикацию ТМ _для инфузорий ТеЛгакутепа ЛкегторкИе_
Токсикант Концентрация, мг/л Коэффициент суточного роста культур
вода деиони-зированная вода + ФК (50 мг/л) вода + смесь органических кислот (50 цМ/л)
1,67±0,04 1,78±0,06 1,55±0,08
Cd 0,6 0 1,12±0,10 1,66±0,09
0,8 1,04±0,11 1,96±0,07 1,65±0,04
Метафос 0,01 0,34±0,04 0,78±0,07 0,32±0,05
Таким образом, метод оценки токсичности ТМ Комплекс биотестов для определения почвен-почвы на основе биотестирования водного экс- ной токсичности должен включать как элюат-тракта из почвы с использованием инфузорий ный, так и контактный метод. Их совокупность имеет существенные ограничения, связанные позволяет давать объективную оценку загрязне-как с низким выходом ТМ в водный экстракт, ния почвы прочно закрепленными или малорас-так и с образованием в данном экстракте хелати- творимыми токсикантами, создающими хронированных и комплексных соединений, не прояв- ческую токсичность, такими как ТМ, хлорорга-ляющих токсических эффектов на данную тест- нические пестициды, полиароматические угле-культуру в ходе 1-3-суточного биотестования. водороды, продукты загрязнения нефтью и т.п.
Литература
1. Виноходов Д.О. Научные основы биотестирования с использованием инфузорий: автореф. дисс. д.б.н. - СПб., 2007. - С. 3-4.
2. Бурдина В.М., Терехова В.А. Анализ эффективности методик биотестирования в экологической оценке загрязненных почв и отходов различного происхождения / Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды. Материалы межд. конф., Саратов, 2005. - С. 125-126.
3. Nicolau A., Mota M., Lima N., Phisiologicl response of tetrahymena pyriformis to copper, zinc, cyclohexamide and Triton X-100 // FEMS Microbial Ecology, 1999, № 30. - рр. 209-216.
4. Karny A., POLLUMAA L., IVASK A., KASEMETS K., VIRTA M., FRANCOIS M., DUBOURGUIER H.C., DOU-AY F. Biotests and Biosensors in the Analysis of (eco)toxicological Risk of Soils Highly Polluted by Cadmium, Lead and Zinc: Bioavailable Fractions cause Toxic Hazard TRADE/WP.8 /AC.1/SEM.7/2002/4/.48p.
5. Malara A., Oleszezuk P. Application of battery of biotests for the determination of leachate toxicity to bacteria and invertebrates from sewage sludge-amended soil // Environ. Sci. Pollut Res., 2013, № 20. - рр. 3435-3446.
6. Легин Е.К., Трифонов Ю.И., Хохлов М.Л., Суглобов, Д.Н. Распределения европия между гелием и раствором фульвата железа (III) в области pH 1-9 // Радиохимия, 1998, Т. 40, № 2. - С. 183-188.
7. Черемных Е.Г., Покатаев А.С., Гридунова В.Н. Прибор для биологических исследований // Патент № 2361913 18.10.2006.
8. Kwon-Rae Kim. Chemodynamics of heavy metals in long-term contaminated soils: Metal speciation in soil solution // Journal of Environmental Sciences, Vol. 21, Issue 11, 2009. - РР. 1532-1540.
9. Luka CinovA A., J. MOJZIS, R. BENACKA, E. LOVASOVA, E. Hijova, F.NISTIAR. TETRAHYMENA PYRIFORMIS AS A VALUABLE UNICELLULAR ANIMAL MODEL ORGANISM FOR DETERMINATION OF XENOBI-OTICS Proceedings of 27th International Symposium „Industrial Toxicology 2007" Bratislava 30. May - 1. June 2007.
10. Мельников Н.И., Новожилов К.В, Белан С.Р. Справочник пестициды и регуляторы роста. - М., 1995. - 335 с.
11. Chubin, K.G., Steet, J.J., 1981. Adsorption of Cd on soil constituents in the presence of complexity ligands // J. Environ. Qual. 10. - РР. 225-228.
12. Куликова Н.А., Перминова И.В., Кудрявцев А.В. Сравнительная характеристика элементарного состава водорастворимых гуминовых веществ, гуминовых и фульвокислот дерново-подзолистых почв // Вестник московского университета. Почвоведение, 2010, № 4. - С. 20-23.
13. SOIL TOXICITY and BIOASSESSMENT TEST METHODS FOR ECOLOGICAL RISK ASSESSMENT. Toxicity Test Methods for Soil Microorganisms, Terrestrial Plants, Terrestrial Invertebrates and Terrestrial Vertebrates. California Environmental Protection Agency January, 2009.
14. Терехова В.А. Биотестирование почв: подходы и проблемы // Почвоведение, 2011, № 2. - С. 190-198.
ОБЩЕСТВЕННЫЕ СЛУШАНИЯ
26 января 2017 г. в 11:00 в здании администрации городского округа Серебряные Пруды, ул. Первомайская, д. 11, Московская обл. состоятся общественные обсуждения с гражданами и общественными организациями проектов документации, объектов Государственной экологической экспертизы: пестицида Гранулам, ВДГ (240 г/кг лямбда-цигалотрина), регистрант Сулфур Миллз Лимитид (Индия); агрохимиката МикроФид марки: Цинк, Бор, Комплекс, Азот, Профи, регистрант ООО «БИОФУД»; агрохимиката Магний сернокислый 7-водный (магниевое удобрение), регистрант АО «Химический завод им. Л.Я. Карпова»; агрохимиката «Минеральная добавка Натурал Грин», регистрант ООО «ХИМПЭКС». Пестицид и агрохимикаты как объекты ГЭЭ, рекомендуются к применению на территории России. Копии материалов доступны для рассмотрения с 26 декабря 2016 г. в ООО «Сельхозхимия», 142970, р.п. Серебряные Пруды, ул. Мичурина, д. 1. Тел.: 8 496 673 14 45. Письменные предложения направлять в ООО «Сельхозхимия». Приглашаются все желающие. При себе иметь паспорт. Проведение обсуждений обеспечивает Администрация городского округа Серебряные Пруды с вышеуказанными организациями.
