Биотестирование, как инструмент принятия экологически обоснованных технологических решений Текст научной статьи по специальности «Химические технологии»

ИЗВЕСТИЯ

ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 25 2011

IZVESTIA

PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 25 2011

УДК 590

БИОТЕСТИРОВАНИЕ, КАК ИНСТРУМЕНТ ПРИНЯТИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИ ОБОСНОВАННЫХ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ

© К. Р. ТАРАНЦЕВА, Н. В. ФИРСОВА, М. А. МАРЫНОВА,

Пензенская государственная технологическая академия, кафедра биотехнологии и техносферная безопасность e-mail: krtar@bk.ru, firsova-nv@mail.ru, marynova-m.a@mail.ru

Таранцева К. Р., Фирсова Н. В., Марынова М. А. - Биотестирование, как инструмент принятия экологически обоснованных технологических решений // Известия ПГПУ им. В. Г. Белинского. 2011. № 25. С. 596-600. - На

примере сточных вод фармацевтического предприятия рассмотрена возможность применения метода биотестирования для оценки степени их потенциальной опасности. Сделан вывод о возможности использования Escherichia coli в качестве тест-объекта. Определены критерии оценки влияния сточных вод на тест-культуру.

Ключевые слова: биотестирование, сточные воды, токсичность, тест-объект, кривая выживания.

Tarantseva K.R., Firsova N.V., Marynova M.A. - Bioassay as a tool for making environmentally sound technological solutions // Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V.G. Belinskogo. 2011. № 25. Р. 596-600. - The example of wastewater pharmaceutical companies consider the possibility of applying the method of bioassays to assess their potential hazard. The conclusion about the possibility of using Escherichia coli as the test object. Defined the criteria for assessing the impact of sewage on the test culture.

Key words: bioassay, effluent toxicity, the test object, the curve of survival.

Критерием определения класса опасности стока является степень его вредного воздействия на окружающую природную среду при непосредственном или опосредованном воздействии на неё. Методологически для определения опасности стока используется расчётный или экспериментальный метод [1-3].

Расчётный метод предполагает суммировать показатели опасности веществ, содержащихся в сточных водах. Перечень компонентов отхода и их количественное содержание устанавливаются по составу исходного сырья и технологическим процессам его переработки или по результатам количественного химического анализа.

Экспериментальный метод основан на биотестировании. Биологические методы позволяют получить информацию об отклонении водной среды от жизненного оптимума, позволяя оценить стоки в целом, с учётом присутствия и взаимодействия в них как основных, так и минорных компонентов, содержание которых в изучаемых пробах может достигать нескольких десятков и определение каждого из них методически трудоёмко, невозможно или нецелесообразно. Таким образом,методыбиотестирования- необходимое звено в оценке кумулирующего, аддитивного, антагонистического и генетического эффекта присутствующих в сточной воде химико-фармацевтического производства соединений [4-6].

Производство антибиотиков - сложный технологический процесс, включающий стадии биосинтеза, фильтрации, выделения, очистки целевого продукта. Многостадийность производства обуславливает использование обширной номенклатуры сырья, неорганических и органических реагентов, и, как следствие, - образование многокомпонентных по составу технологических сточных вод (рис. 1). Степень их загрязнения оценивается с помощью количественных химических и физико-химических методов, при этом, содержание каждого изкомпонентовопределяетсяот-дельно, что не позволяет получить комплексное представление о потенциальной опасности тех или иных технологических стоков.

Как правило, стоки химико-фармацевтического производства обезвреживаются на биологических очистных сооружениях. В этой связи, несомненный интерес также представляет использование биотестов при выборе методов очистки сточных вод и оценки эф -фективности работы очистных сооружений [4, 7].

При биотестировании сточных вод производства антибиотиков необходимо решить две задачи: подбор тест-объектов и выбор критериев интерпретации данных биотестов. Сложность в проведении биотестов заключается в том, что нет стандартизированных для всех поллютантов методик с использованием единого тест-объекта и единого критерия оценки проявления тест-

Основные стаднії технологического процссся

Сталии биосввтгзл

Стадии вылеленпя и тимической очистки

Сталім химической трансформации

ПрОМЫВНЫе ВОДЫ с вспомогательных стадий подготовки сырья, реагентов и оборудования

ПрОМЫВНЫе ВОДЫ С в с немота тельных стадий подготовки сырья: реагентов и обору даванні

От рьіб отавный натжвный раствор

Техно логические промъгн-ки и маточники

Технологические маточники: промывные воды с основных и вспомогательных сталии, отработанные органические и неорганические агенты.

Рис. 1. Схема формирования сточных вод производства антибиотиков

ПРИКЛАДНАЯ ЭКОЛОГИЯ

реакции. Токсичность определяется по тест-объектам различных систематических групп (дафнии и инфузории, цериодафнии и бактерии или водоросли и т.п.), проявившим более высокую чувствительность к анализируемому отходу. таким образом, актуальным является подбор условий оценки токсичности сточных вод для каждого конкретного производственного процесса.

Целью нашего исследования являлось изучение возможности дифференциальной оценки токсичности сточных вод на стадии разработки пускового технологического регламента опытного производства полусин-тетических бета-лактамных антибиотиков (на примере производствасолицефалоспоринаС ). Исследовалиотра-ботанныйнативныйраствор,средне-пропорциональный сток и модельные растворы с содержанием различных количеств ацетона перед их усреднением и поступлением на биологические очистные сооружения.

В качестве экспресс-метода для выработки концепции оценки токсичности технологических стоков, образующихся на каждой из стадий производства, применяли биотестирование с использованием сани-тарно- показательных микроорганизмов Escherichia coli, Streptococcus faecalis. Критерием оценки данных, полученных с использованием биотестов, служила общая выживаемость микробной флоры.

Предложенные тест-организмы для оценки токсичности водной среды представляют интерес в связи с коротким циклом развития, апатогенностью, возможностью получения в любое время необходимого количества тест - культур, невысокой стоимостью анализа [1].

в эксперимент брались свежевыделенные из природного водоема штаммы, не адаптированные к сточным водам производства антибиотиков, типичные по своим культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам. Основой индикации токсичности технологических стоков являлась оценка стимуляции или угнетения процессов роста выбранных тест-микроорганизмов под действием испытуемых веществ. Объем опытных смесей составлял 5 литров.

Смеси выдерживались при комнатной температуре. Составы опытных смесей представлены в табл. 1.

Продолжительность эксперимента определялась исходя из задачи изучения длительности выживания тест-организмов под влиянием химических ингредиентов сточных вод. Высевы проводили в трёх параллельныхопределениях.Количественноеопреде-ление микробных колоний проводили мембранным методом,соответствующимобщепринятымвпрактике микробиологического контроля качества вод. Объем фильтруемых проб выбирался с таким расчётом, чтобы на фильтрах получить не более 30 изолированных колоний. Фильтрацию проводили под вакуумом на аппаратах Зейтца с использованием стерильных мембран с диаметром пор 0,45 мкм.

Определение количества колоний Esherichia coli

По окончании фильтрации фильтр в асептических условиях помещали на чашку Петри со средой Эндо. Инкубацию проводили при температуре 370С в течение 48 часов, затем подсчитывали количество колоний. При росте колоний, характерных для бактерий группы кишечной палочки (темно-красных с металлическим блеском ибез блеска, красных, розовых с тёмным центром), выполняли окраску по Г раму, окси-дазный тест и индольный тест. все колонии грамотри-цательных микроорганизмов, дающие отрицательную оксидазную реакцию и положительную индольную реакцию, учитывали как колонии E.coli и подсчитывали их. за окончательный результат принимали среднее значение, полученное при трёх параллельных определениях.

Определение количества колоний Streptococcus faecalis

Фильтры с посевами в асептических условиях помещали на модифицированную среду Сланеца-Бертли. Посевы инкубировали в течение 48 часов при температуре 370С. На модифицированной среде Сла-неца- Бертли подсчитывали колонии, характерные для энтерококков - выпуклые, с ровными краями, различной окраски: темно-вишневые, малиновые, розовые,

Таблица 1

Схема опытных смесей.

N опытных смесей Состав смесей

1 Автоклавированная природная вода - ацетон 0,2 г/л - Esherichia coli 20000 кол/мл

2 Автоклавированная природная вода - ацетон 0,4г/л - Esherichia coli 20000 кол/мл

3 Автоклавированная природная вода - ацетон 0,8г/л - Esherichia coli 20000 кол/мл

4 Автоклавированный средне-пропорциональный сток - Esherichia coli 20000 кол/мл

5 Автоклавированная природная вода - средне-пропорциональный сток производства Zn-соли цефалоспорина С (в разведении 1:200) - Esherichia coli 20000 кол/мл

6 Автоклавированный нативный раствор - Esherichia coli 20000 кол/мл

7 контроль для №1-6 Автоклавированная природная вода - Esherichia coli 20000 кол/мл

8 Автоклавированная природная вода - ацетон 0,2 г/л - Streptococcus faecalis 20000 кол/мл

9 Автоклавированная природная вода - ацетон 0,8 г/л - Streptococcus faecalis 20000 кол/мл

10 Автоклавированная природная вода - ацетон 1,4 г/л - Streptococcus faecalis 20000 кол/мл

11- контроль для №8-10 Автоклавированная природная вода - Streptococcus faecalis 20000 кол/мл

прикладная экология ►►►►►

светло-розовые,равномерноокрашенные или стемно-красным, нечетко оформленным центром. Как правило, все колонии, которые растут на этой среде, можно отнести к фекальным стрептококкам, имеющим индикаторное значение. Очень мелкие, плоские, на пределе видимости невооруженным глазом коло-нии не учитывали. Подтверждали принадлежность колоний к энтерококку после окраски по Граму и микроскопи-рования. Обнаружение в мазках грамположительных, полиморфных, со слегка заостренными концами клеток, соединенных попарно, являлось основанием отнести колонии к изучаемому виду. За окончательный результат принимали среднее значение, полученное при трёх параллельных определениях.

На основании полученных данных строили логарифмические кривые зависимости количества микробных колонийd в 1 мл ( ^ п) от характера стока и времени роста (^ (рис. 2-5).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В технологическом процессе получения бета-лактамных антибиотиков используются водно-ацетоновыерастворы.Остаточныеколичестваацетона после отгонки из технологических маточников попадают в стоки производства. для оценки влияния аце-

тона на тест-культуру Esherichia coli были проведены эксперименты с модельнымирастворами, содержащими различное количество ацетона (рис. 2).

Анализэкспериментальных данныхпоказал, что ацетон в дозе 0,8 г/л обладает выраженным бактерицидным действием на тест-культуру Esherichia coli по сравнению с контролем. Полное отмирание Esherichia coli в опытной пробе произошло через 10 часов после внесения тест-объекта в опытную пробу, тогда как в контроле отмечен постоянный рост коли-индекса

На рисунке 3 представлены кривые выживания тест-объекта Streptococcus faecalis в модельных растворах с содержанием ацетона 0,2г/л; 0,8г/л; 1,2г/л. Очевидно, что культура Streptococcus faecalis менее чувствительна к присутствию ацетона в опытных пробах и, в связи с этим, её использование в качестве биотеста менее перспективно.

средне-пропорциональный сток является многокомпонентным по составу. Он состоит из стоков образующихся на вспомогательных и основных стадиях производственного цикла (рис.1) и содержит остаточные количества различных органических растворителей, неорганических реагентов, продукты деструкции органических веществ.В связисэтим,определениеего токсичностипредставлялоособыйинтерес.Вкачестве

Рис. 2. Влияние различных концентраций ацетона на тест-культуру Esherichia coli, состав смесей приведен в таблице 1.

Рис. 4. Влияние средне-пропорционального стока различной концентрации на тест-культуру Esherichia coli, состав смесей приведен в табл. 1.

Рис. 3. Влияние различных концентраций ацетона на тест-культуру Streptococcus faecalis, состав смесей приведен в таблице 1.

Рис. 5. Влияние отработанного нативного раствора на тест-культуру Esherichia coli, состав смесей приведен в таблице 1.

тест-объекта использовали культуру Esherichia coli. Как видно из рисунка 4, средне-пропорциональный сток без разведения является остротоксичным. в первые два часа наблюдалась некоторая стимуляция роста. Но уже к шести часам культура Esherichia coli не высевалась.Такимобразом,можносделатьвыводоне-обходимостипроводитьегоразбавлениепередотправ-кой на биологические Оценку результатов влияния отработанного нативного раствора на тест-культуру Esherichia coli проводили по максимальному эффекту длительности выживания. Отработанный нативный раствор может содержать в своём составе остаточные количества компонентов питательной среды, часть из которых подверглась деструкции под воздействием ферментных систем продуцента, продукты лизиса самого продуцента, остаточные количества антибиотика и др. вещества. Дать качественную и количественную оценку всех составляющих отработанного нативного раствора не представляется возможным. Анализ кривых выживания выявил, что отработанный нативный раствор ускорил отмирание Esherichia coli по сравнению с контролем. Появление плато на кривой соответствует полной утилизации субстрата. Характер контрольной кривой выживания не отличается от опытной, однако, общее количество высеянных колоний в контроле на один-два порядка выше, что свидетельствует об ингибирующем влиянии нативного раствора на выживаемость бактерий изучаемого вида.

выводы

таким образом, информация, полученная в результате биотестирования, является инструментом принятия экологически обоснованных технологических решений на этапе разработки опытнопромышленного регламента. У гнетение и (или) гибель тест-объектаидетчерезфазустимуляцииростаифунк-циональной активности. степень угнетения роста напрямую зависит от степени потенциальной опасности стока для окружающей среды. Таким образом, оценка длительности выживания тест-объекта Escherichia coli может быть положена в основу экспресс-метода оценки степени токсичности многокомпонентных по составу сточных вод производства цинковой соли це-фалоспорина с.

Наначальномэтаперазработкитехнологических схем производства, одновременно с техническими решениями, позволяющими получать максимальный выход и заданную химическую чистоту целевого продукта, важно оценить степень токсичности стоков, образующихся на каждой из производственных стадий. Принятиерешенияоцелесообразностииспользования того или иного вида сырья и технологий, должно базироваться на данных оценки потенциальной опасности каждого из образующихся стоков, возможности его обезвреживания и отрицательных последствиях попадания в общий сток предприятия. Это позволит сэкономить значительные ресурсы наразработку природоохранных мероприятий при последующем освоении технологий производства химико-фармацевтических препаратов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Приказ Министерства природоохранных ресурсов России .№511 от 15.06.01г «Критерии отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды»

2. СтрогановН.С.Технологическийконтрользагрязнён-ности пресных водоёмов // Влияние загрязняющих веществ на гидробионтов и экосистемы водоёмов. Л.: Гидрометеоиздат, 1979. С. 221-224.

3. Веселов Е.А. Классификация сточных вод и их компонентов по их действию на водоемы и водные организмы // Критерий токсичности и принципы методик по водной токсикологии. М., 1971. С. 47-63.

4. Рабышко Э.В., Фирсова Н.В. Критерии оценки степени загрязнённости сточных вод производства антибиотиков. Пенза: Пензенский Всесоюзный научноисследовательский институт антибиоти-ков, 1986. С. 79.

5. Крайнюкова А.Н. Биотестирование в охране вод от загрязнения // Методы биотестирования вод. Сб. под ред. А.Н. Крайнюковой. Черноголовка, 1998. С. 4-14.

6. Виноходов Д.О. Научные основы биотестирования с

исполь-зованием инфузорий. Автореф. дисс_докт.

биол. наук. СПб, 2007. 40 с.

7. Таранцева К.Р., Фирсова Н.В. Влияние продуктов коррозии на токсичность промышленных стоков // Защита металлов. 2006. Т. 42. № 2. С. 1-6.