CC BY
1107
Анатолий Лобанок
завлабораторией ферментов Института микробиологии НАН Беларуси, академик
Биотехнология микробных ферментов
Большинство реакций в живом организме катализируется в основном белковыми молекулами, называемыми ферментами. Они продуцируются в клетках и обеспечивают ускорение химических реакций в биологических системах при относительно низких температурах, при этом сами остаются практически неизменными. Во второй половине ХХ в. производство и применение ферментов получают широкое распространение. Социальные, экологические и экономические эффекты внедрения новых ферментных технологий огромны, и их значение трудно переоценить. Не будет преувеличением, если обозначить эти биотехнологии модным термином «прорывные».
Крупномасштабное производство микробных ферментов было организовано в 1960-х гг. и с тех пор устойчиво растет на 10% в год. Сегодня в производстве ферментов, как правило, задействованы генетически модифицированные микроорганизмы-продуценты для достижения максимальной продуктивности и получения ферментов с оптимизированными свойствами. Ферменты, используе-
мые для особых целей, например в медицинской диагностике или ДНК-технологиях, получают в высокоочи-щенном виде.
Уже давно биокатализ применяется в разнообразных технологических процессах. С его помощью получают этанол, растворители, уксусную кислоту, обеспечивается синтез ряда лекарств, антибиотиков, подобно полусинтетическому пенициллину, витаминов. Ферменты сегодня — это важная часть растущей биокаталитической промышленности, использующей в различных процессах, особенно в химических производствах, наряду с собственно изолированными ферментами также ферментные препараты в виде генетически оптимизированных живых, мертвых, а также иммобилизованных клеток микроорганизмов. Микробные ферменты применяют в промышленности в тонком химическом синтезе, для получения чистых хиральных аминокислот и редких сахаров, фруктозы и других соединений. Превращение глюкозы во фруктозу с помощью глюкозоизомеразы служит хорошим примером стереоспецифической биотрансформации — это важный фер-
мент, используемый в заключительной стадии переработки крахмала с целью получения подсластителей. В иммобилизованной форме в промышленных условиях фермент может сохранять каталитическую активность в течение двух лет. Годовое производство фруктозы для пищевой промышленности достигает 20 млн т.
Протеазы, липазы, лиазы и нитрилгидра-тазы используются в асимметрическом синтезе L-аспарагиновой кислоты и ряда ценных промежуточных продуктов метаболизма. Так, для получения акрилами-да из акрилонитрита и никотинамида применяют иммобилизованную бактериальную нитрилгидратазу. Акриламид далее полимеризуется в полиакриламид. Фирма «Новозайм» разработала технологию получения очень термостабильной липазы из дрожжей Candida antarctica, эффективную для осуществления специфических реакций в органических растворителях и широко применяемую в различных секторах химической промышленности. Важное направление — использование ферментов для синтеза олигосахаридов с целью применения в косметике, медицине и функциональных
БИОТЕХНОЛОГИИ
пищевых продуктах. энзиматический синтез потенциально превосходит химический и в ряде областей постепенно вытесняет его. «Зеленая альтернатива», основанная на биотехнологии, все более успешно заменяет традиционные химические процессы. Сегодня около 15 отраслей промышленности с успехом используют ферменты.
Мировой рынок этих белковых молекул оценивается более чем в 2 млн долл. и имеет тенденцию к дальнейшему росту. Около 75% производимых ферментов используются в промышленности для выпуска моющих средств (37%), текстиля (12%), крахмала (11%), хлебопечения (8%) и кормления животных (6%). Рынок ферментов достаточно стабилен.
Выделено и охарактеризовано более 2 тыс. ферментов. Информация, полученная в результате секвенирова-ния все большего числа микроорганизмов, позволяет охарактеризовать все ферменты организма на геномном уровне. Самый маленький из известных микроорганизмов — Mycoplasma genitalium — содержит 470 генов, из которых 145 относятся к репликации и транскрипции. Пекарские дрожжи имеют 7 тыс. генов, кодирующих 3 тыс. ферментов. Известны тысячи вариантов природных ферментов, а к 2000 г. уже была установлена структура 1300 различных белков. Однако только ограниченное число известных ферментов коммерчески доступно, и еще меньшее — используется в больших количествах. Около 50 промышленных ферментов доступны на рынке. Из них более 75% представлены гидролазами, протеиназы составляют около 40% всех продаж.
Ферменты, используемые в промышленности, сельском хозяйстве, медицине и научных исследованиях в зависимости от сферы применения должны соответствовать определенным требованиям: обладать специфичностью, скоростью реакции, pH- и температурными опти-
мумами, стабильностью, сродством к субстрату и другими свойствами; в бумажной и текстильной промышленности — не повреждать целлюлозное волокно; в кормах для животных — быть термостабильными, чтобы не инактивировать-ся в процесс приготовления кормов, и в то же время максимально активными при температуре тела животного; в промышленности — быть устойчивыми к тяжелым металлам и проявлять максимальную активность даже при низких концентрациях субстрата. Микроорганизмы — продуценты ферментов в идеале должны быть технологичными, безвредным и иметь GRAS-статус (Generally Regarded As Safe), продуцировать внеклеточные ферменты в достаточном количестве, обычно более 50 г/л. GRAS-статус особенно важен, если ферменты предназначены для пищевой промышленности.
Обычно в качестве продуцентов используют рекомбинантные штаммы известных грибов и бактерий родов Aspergillus, Trichoderma, Streptomyces, Bacillus и др. Рекомбинантные ДНК-технологии делают возможным перенос гена от одного организма в другой. Примером может служить технология получения детергентного фермента липолазы, производимого фирмой Novo Nordisk и предназначенного для удаления жирных пятен на тканях. Продукция этого фермента была обнаружена у гриба Humicola languinosa, однако в недостаточных количествах для коммерческих целей. Фрагмент ДНК-гена, кодирующий продукцию этого фермента, был клонирован в грибе Aspergillus oryzae, в результате чего был достигнут коммерческий уровень продукции эффективного и стабильного при стирке фермента. С одной стороны, рекомбинантные ДНК-технологии позволяют получать новые ферменты с использованием традиционных микроорганизмов- сверхпродуцентов, с другой — сами микробные ферменты являют собой важнейший
инструмент ДНК-технологий. это ре-стриктазы и ДНК-модифицирующие ферменты. Целый ряд их свойств может быть улучшен или изменен, включая выход фермента и его кинетику. Ферменты из опасных, не одобренных для использования или медленно растущих микроорганизмов, а также из растительных и животных тканей могут быть клонированы в безопасных и высокопродуктивных штаммах микроорганизмов. Количество продуцируемого фермента может быть также увеличено за счет увеличения числа копий гена, который кодирует этот фермент. Так, например, в случае амплификации с помощью плазмид гена пенициллин^-амидазы до 50 копий на клетку конститутивный синтез этого фермента у Escherichia coli был существенно увеличен. Могут быть также созданы новые конструкции ферментов с улучшенными свойствами уже существующих или проявляющие новые активности. Важные работы по белковой инженерии были выполнены для увеличения активности и стабильности субтилизина при повышенных температурах, рН и действию оксидантов, основных компонентов стиральных порошков. По законодательству производитель не обязан информировать потребителя, что данный фермент модифицированный. Однако следует все же отметить, что использование ферментов, продуцируемых рекомбинант-ными организмами, иногда является предметом некоторой озабоченности, так как неизвестно влияние этих ферментов в отдаленной перспективе на человека и экосистему.
Белковая инженерия позволяет модифицировать и улучшить существующие ферменты, а также конструировать искусственные, которые являются полимерами или олигомерами с каталитической активностью и называются синзимами. Технология модификации структуры ферментов или их каталитической активности позволяет создавать новые пути метабо-
лизма, а значит — новые ценные продукты, такие как химикалии, лекарства, топливо, добавки для пищевой промышленности и сельского хозяйства. Модификация химическим путем может быть проведена in vitro, иногда с получением совершенно нового фермента, иногда с созданием нового центра активности или модификации старого. Искусственно синтезированы мультиэнзимные системы, которые могут катализировать последовательные реакции во многих биотехнологических процессах. Для получения би- или полифункциональных биокатализаторов разработана технология слияния генов, контролирующих синтез двух или более ферментов.
Оптимизация процесса биосинтеза ферментов, выделение конечного продукта, достижение желаемой степени очистки и создание препаративной формы — сложный многоступенчатый процесс, требующий соответствующей аппаратуры. Необходимы определенные меры предосторожности, так как некоторые ферментные белки способны вызывать аллергические реакции.
Так как ферменты не всегда в полной мере обладают желательными свойствами, делающими возможным их эффективное производственное использование, в природной среде пытаются найти более подходящие. Более 30 лет проводится поиск перспективных ферментов микроорганизмов, обитающих в экстремальных природных условиях, но не всегда найденный фермент отвечает всему комплексу необходимых свойств.
Было установлено, что мутации могут улучшить и изменить такие свойства фермента, как селективность и активность, каталитическую активность и термостабильность. Стало возможным использование для этих целей направленной эволюции и белковой инженерии ферментов. Таким путем был создан ряд функционально улучшенных ферментов, в том числе про-теиназы, липазы, целлюлазы, амилазы
и глюкоамилазы. Хорошим примером в этой связи является ксиланаза гриба Тг'^обегта. В результате установления трехмерной структуры этого фермента путем направленного мутагенеза его термостабильность была существенно увеличена, а оптимум pH сдвинут в нужную сторону. Наиболее успешный подход к усилению стабильности ксиланазы включал стабилизацию ^концевого и участка альфа-спирали.
Особенно впечатляют исследования, связанные с целлюлазой гриба Нуро-сгва ]всоппа (анаморф Тг'^обегта мпбв, а затем Т. гееве). Хотя целлюло-литичесие ферменты этого гриба стали активно изучаться в 50-е гг. прошлого века, его биотехнологический и целлю-лолитический потенциал был в полной мере оценен только в конце 60-х гг. Были созданы несколько мутантных линий этого гриба, которые благодаря эффективной системе секреции и высокому уровню экспрессии целлюлаз и гемицеллюлаз используются для промышленного производства дешевых ферментов для получения бумажной пульпы и бумаги, текстильной и пищевой промышленности, а также конверсии растительной биомассы — получения сахаров и биоэтанола.
Потребность в производстве биоэтанола из лигноцеллюлозы привели к ренессансу в исследовании целлюлазы Тп^о-бвгша. Значительные успехи наметились, когда для получения улучшенных штаммов-продуцентов целлюлазы наряду с классическим мутагенезом и селекцией стало возможным использование методов молекулярной генетики. В результате анализа геномной последовательности Н.\есоппа выяснилось, что хотя набор ферментов, деградирующих растительную клеточную стенку у этого организма, значительно меньше, чем у других грибов, тем не менее Щесоппа превосходит другие грибы по способности продуцировать ферменты, разрушающие растительную клеточную
стенку, и является сегодня важнейшим промышленным продуцентом целлю-лаз, обладая высоким биотехнологическим потенциалом. В итоге стала очевидной необходимость исследования фундаментальных биохимических основ гиперпродукции, регуляторных принципов синтеза и секреции целлюлазы у Н.]есоппа. Группа ученых из Франции и Австрии работает над созданием карты мутаций и выяснением природы и механизма их реализации у Щесоппа. Всего у этого гриба выявлено более 200 мутаций в 60 генах, и стало возможным подойти к выяснению вопроса о том, какие мутации ответственны за повышенную продукцию целлюлазы, а какие — просто «багаж». Для успешного развития программы исследований в данном направлении важно также установить пределы биосинтетических возможностей этого организма.
Использование биокатализаторов в химических реакциях обычно ограничено мягкими значениями pН, температуры, давления и водной средой. Однако ферменты, выделенные из микроорганизмов, обитающих в экстремальных условиях рН, температуры, давления, присутствии органических растворителей, в меньшей степени ограничены условиями среды. эти ферменты, так называемые экстремозимы, могут проявлять свою активность при температурах как ниже точки замерзания, так и порядка 140 °С. Большинство из них продуцируют бактерии экстремофилы группы archea.
экстремозимы можно разделить на четыре основные группы:
• крайне психрофильные ферменты (проду-
цируются мезофиллами и функционируют в районе точки замерзания);
• крайне галофильные ферменты (функцио-
нируют в соленой среде);
• крайне те рмофильные ферменты;
• крайне барофильные ферменты (выделен-
ные из баро- и психрофильных микроорганизмов, обитающих на морских
глубинах).
БИОТЕхНОлОГИИ
Исследование экстремозимов позволяет получить информацию для улучшения активности, стабильности и специфичности других ферментов, используемых для биокатализа. Так, ряд генов, кодирующих экстремози-мы, были выделены из термофильных archea, клонированы и экспрессиро-ваны в E.coli. Данные о их пространственной структуре используются при создании более эффективных и стабильных версий других ферментов.
Самый простой способ применения ферментов — добавление в проточную систему, где они катализируют желаемую реакцию и постепенно инактивируются в течение процесса, например разжижение крахмала амилазами. В этом случае стоимость ферментов должна быть достаточно низкой. При иммобилизации ферментов возможно их повторное использование. Наиболее значимый пример в этом ряду — применение для получения фруктозных сиропов иммобилизованных клеток с глюкозоизомеразной активностью или же, как альтернатива, — иммобилизованной глюкозоизомера-зы, которую после инактивации можно заменить свежей порцией фермента. Другой способ основан на использовании ультрафильтрационных мембран: большие молекулы фермента через мембрану не проходят, а продукты реакции проникают. Система функционирует непрерывно. этот метод применяют для выделения хирально чистых аминокислот из рацемической смеси. Ферменты для аналитических целей, например глюкозооксидазы, могут быть иммобилизованы на мембранах. Разработан способ поперечной сшивки молекул ферментов с образованием активных нерастворимых форм. В этом случае не требуется несущий матрикс и размеры реактора минимальны по сравнению с традиционными иммобилизованными системами. этот метод применяется для разделения хиральных молекул и других специфических целей. Все это возможно благодаря тому, что кристаллы
фермента содержат воду, имеют поры, активный центр, гидрофобные участки и обладают ионными свойствами.
Специальные ферменты, которые, в отличие от промышленных, не должны иметь примесей и обладать сопутствующими ферментативными активностями, все шире используются в клинических аналитических методах. эти методы с применением ферментов базируются на автоматических анализаторах. Широкое распространение получили глю-козные биосенсоры, основанные на реакции катализируемой глюкозооксидазой. Реакции обычно связаны с изменением соотношения NAD(P)/NAD(P)H или выделением перекиси водорода, что может быть зарегистрировано спектрофото-метрически. этот принцип применим также для определения ряда других молекул. В некоторые зубные пасты включают глюкоамилазу и глюкозоокси-дазу: первая высвобождает глюкозу из олигомеров крахмала, образующихся под действием альфа-амилазы, а вторая превращает глюкозу в глюконовую кислоту и перекись водорода, действующие как дезинфектанты.
Еще одна важная область применения ферментов — животноводство. Так, фитаза из гриба Aspergillus niger служит для высвобождения фосфатов из фитиновой кислоты в кормах. Целлюлазы и гемицеллюлазы значительно улучшают переваримость грубых кормов. В результате снижается расход фосфатов и грубых кормов, что экономически выгодно и экологически целесообразно.
За последние годы в Институте микробиологии НАН Беларуси были разработаны и внедрены в производство химико-ферментатвные технологии получения ряда противовирусных и противоопухолевых лекарственных препаратов на основе трансформации компонентов нуклеиновых аминокислот
Изучен биогенез и разработаны способы получения и применения микробных
пектолитических, целлюлитических, дек-странолитических, эфиролитических, литических ферментов. Отобраны и изучены продуценты глюкозооксидазы, глюкозоизомеразы, каталазы, перокси-дазы, бета-галактозидазы, протеазы, хитиназы, установлены закономерности образования ферментов. Определена функциональная значимость глюкозо-оксидаз пенициллов как фактора адаптационной системы, обусловливающей конкурентоспособность и экологическую пластичность грибов. Выделены, охарактеризованы, амплифицированы и клонированы в гомо- и гетерокариотических организмах гены глюкозооизомеразы Arthrobacter nicotianae и глюкозооксидаз Реп1сШит в(1атекИ и Р. funiculosum. Созданы рекомбинантные штаммы — высокоактивные продуценты ферментов.
Разработаны методы получения препаратов глюкозооксидазы, глюкозоизо-меразы, каталазы, пероксидазы, бета-галактозидазы, протеазы, хитиназы различной степени очистки и способ иммобилизации клеток бактерий Arthrobacter п'ювИапае — продуцента глюкозоизо-меразы. Установлены основные каталитические свойства ферментных белков. Создана малоотходная технология производства ферментного препарата «Пектиназа Г20х» для получения плодово-ягодных соков и виноделия. Разработаны лабораторные регламенты на производство препаратов глюкозои-зомеразы и глюкозооксидазы. Показана эффективность использования глюко-зоизомеразы в производстве глюкозо-фруктозных сиропов, глюкозооксидазы — в качестве компонента амперометри-ческих, кондуктометрических и потенцио-метрических биосенсоров для определения содержания глюкозы в биологических жидкостях и продуктах питания.
Установлена перспективность использования каталазы в текстильной, а бета-галактозидазы — в пищевой промышленности. Препараты протеаз и хитиназ могут применяться для получения ги-дролизатов белков, хитина и хитозана.
