CC BY
52
УДК 579.24
Даниленко С.Г. ©
1нститут продоволъчихресурав НААН, м.Кшв
БЮТЕХНОЛОГ1Я БАКТЕР1АЛЬНОГО ПРЕПАРАТУ «ЛЛР»
Створено бактер1алъний препарат "ЛРР" для ферментацИ м'яса птищ, до складу якого входятъ культуры eudie Lactobacillus rhamnosus та Kocuria rosea.
Бютехнолог1я цъого препарату складаетъся з постадшного внесения поавного матер1алу, двостадтного внесения глюкозы, перем1шування, урахування умов перюдичног нейтрал1зацИ кулътуралъног pidunu. Тривалктъ нарощування бюмаси становитъ 12-14 годин за температуры (32±1) °С за пер1одычногнейтрал1зацИ'кулътуралъного середовища.
Ключое1 слова: бактер1алъний препарат, бютехнолог1я, токулят, поживне середовище
Пошук та шдб1р культур при створенш бактер1ального препарату для ферментування м'яса - складний багатостадшний процес. I якщо рашше за мету ставили ушверсальшсть [1], то на сьогодш прийшло розумшня «кожному продуктов! CBoi' мшрооргашзми» [2]. Заквашувальш бактер1альш препарата складаються з культур м1крооргашзм1в, живих або у сташ анабюзу, як1 проявляють бажану метабол1чну актившсть на субстрат!, що ферментуеться. Для повноцшного функцюнування бактер1альш культури повинш бути адаптованими до певно! сировини та технологи, задовольняти органолептичш уподобання мюцевих споживач1в.
На думку W.P.Hammes, Leroy F., Talon R., оптимальний заквашувальний препарат для ферментування м'ясно! сировини повинен мютити не тальки молочнокисл! бактери, а й каталазопозитивш коки, серед яких перспективними вважаються непатогенш стафшококи, оскшьки доведено, що саме щ мжрооргашзми характеризуються широким спектром бюх1м1чно! активносп, що дозволяе отримати ферментоваш м'ясш вироби з традицшними органолептичними характеристиками [2-4].
Виробництво бактер1альних препарата залежить вщ особливостей технологи того чи шшого продукту, але мае так1 загальш стади: нацшена селекщя культур, тдб1р поживного середовища для нагромадження бюмаси, визначення дози nociBHoro матер1алу та послщовшсть його внесения в поживне середовище, опрацювання умов нарощування та збереження бюмаси, nifl6ip наповнювача та способу нормал1заци бактер1ального концентрату. Вихщ б1омаси залежить вщ таких фактор1в як склад поживного середовища, який враховуе харчов1 потреби кожного 3i складниюв заквашувально! композици, повноти опрацювання технолопчних операцш та постшного контролю за переб1гом культивування бюмаси [5-7].
© Даниленко С.Г., 2013
55
Композицш з лактобактерш та мжрококу ефективно нарощують на поживному середовищ!, яке мютить молочну сироватку, екстракт пекарських др1ждж1в, Ырчанокисл! магнш та марганець [8]. Доповнення поживних середовищ томатним соком, марганцем, еф1рами оцтово! або олешово! кислот, Твш-80, стимулюе picT бшьшост! вид1в молочнокислих бактерш. Вщомо, що молочнокисл! бактери (зокрема L. plantarum) добре розвиваються на рослинних вщварах i екстрактах (ячмшне та житне сусло, картопляний вщвар та овочев! i фруктово-ягщш соки) [9].
Важливим чинником для нагромадження бюмаси е кшьккний i якюний склад м1кроелемент1в у поживних середовищах. Зокрема, молочнокисл! бактери S. cremoris, L. citrovorum е чутливими до таких м1кроелемент1в як Mg, Mn, Cu, L. plantarum - до Fe, Mn, Mo, S. lactis - до Fe(+1), Cu, a S. lactis subsp. diacetilactis - до Mn, Fe(III) [10, 11]. Сол! марганцю також необхщш для стабшзаци бюмаси перед заморожуванням [12].
У бютехнологи надають перевагу гомогенним та синхронним культурам з низькою природною та пасажною мшливктю, оскшьки щ культури е стшкшими до технолопчних операцш та збер1гають сво! властивост! впродовж тривалого часу [5, 6]. Отримати таку культуру довол! нелегко нав1ть з одного штаму, а у pa3i культивування багатокомпонентних заквашувальних культур це завдання надзвичайно ускладнюеться. Одним i3 cnoco6iB досягнення максимально! синхрошзаци складниюв заквашувально! композици за в1ком та ф1зюлопчним станом вважаеться застосування постадшного культивування [12].
Як свщчить наведена вище шформащя, попри значний досвщ з культивування молочнокислих бактерш i !х композицш, завжди постае питания пошуку ефективних та економ1чно вигщних промислових середовищ та умов нагромадження бюмаси при створеш нових бактер1альних препаратсв.
Метою даног роботи було опрацювання бютехнологи отримання бактер1ального препарату прямого внесения «ЛРР» для виробництва ферментованих суцшьном'язових продукив i3 птиц!.
Об'ектами були штами молочнокислих бактерш L. rhamnosus, та Kocuria rosea з колекци промислових штам1в вщдшу бютехнологи 1нституту продовольчих pecypciB НААН.
У робот1 використовували традицшш та сучасш мжробюлопчш методи дослщження. Активну i титровну кислотшсть визначали згщно з ГОСТ 3624-92 [13].; вм1ст вуглевод1в - за методом високоефективно! рщинно! хроматограф!! на хроматограф! LC-5 (ф!рми "Shumadzu"). 1нтенсивн!сть розвитку заквашувально! культури у поживному середовищ! оцшювали за динамжою нагромадження кл!тин, оптичною густиною та зм!ною активно! кислотност![14].
Нагромадження бюмаси вели у перюдичному режим! за температури (32±1) °С упродовж (14±0,5) год, застосовуючи метод постадшного внесения компонент!в nociBHoro матер!алу.
56
Активну кислотшсть культурально! рщини пщтримували на piBHi (6,56,6) од. рН. Поавний матер1ал складниюв композици вирощували за температури (32±1)°С.
Критер1ями оцшки росту культур у поживних середовищах слугували: константа швидкост1 подшу кл1тин (v, год-1), тривалкть лаг-фази (Ti ) та термш генераци (g, год) [15].
Актившсть сухого бактер1ального концентрату та його препарату перев1ряли за чисельшстю окремих груп м1крооргашзм1в в 1 см3: - кшьккть молочнокислих бактерш - за ГОСТ 10444.11-89 [16], кшькють життездатних кл1тин мжрококу - шляхом вис!ву вщповщних сершних розведень у стерильному ф1зюлопчному розчиш на м'ясо-пептонний агар з 5 % NaCl.
Результати та ix обговорення
Оскшьки молочнокисл! бактери (МКБ) i мкрококи (МК) характеризуються р1зними вимогами до джерел живлення i енергп, для здшснення !х спшьного культивування необхщно пвдбрати такий склад середовища, що буде оптимальним для розвитку кожного з мжробних компонента.
Поживш середовища готували на вод1 з додаванням компонента, як1 необхщш для устшного розвитку бактерш - джерел вуглецю, азоту, мжроелементи.
Основу поживного середовища склали цитриновий та оцтовокислий натрш, мшеральш сол1 Mg i Mn, Твш-80, NaCl та пептон. Як джерело вуглецю та eHeprii' до середовища вносили сумш глюкози та лактози, у стввщношенш (1:1) i др1жджовий автол1зат (ДА) як джерело амшокислот та в1тамш1в та rnmi рктстимулювальш сполуки як-то аскорбшова кислота, сульфат зал1за, сухе знежирене молоко (СЗМ).
Шсля розчинення компонента в основ! встановлювали рН на piBHi (8,5±0,05) од. додаванням 25%-ного водного розчину ам1аку, стерил1зували за температури (121±1) °С упродовж (30,0±0,1) хв i охолоджували до температури (50±1) °С.
Кшькють nociBHoro матер1алу для бактер1ального препарату "ЛРР" становила 6 % вщ об'ему поживного середовища за сшввщношення м1ж двома штамами L. rhamnosus та Kocuria rosea як 2:2:2.
У приготовлене поживне середовище вносили поЫвний матер1ал для нагромадження бюмаси композицш "ЛРР"
1нокулят штам1в молочнокислих бактерш готували внесениям добових бульйонних культур у кшькост1 5 % до об'ему поживного середовища MRS i наступного вирощування впродовж (22±2) год.
1нокулят м!крокок!в готувати у такий cnoci6, за яким кл1тини мжрококу вирощують на поверхш м'ясо-пептонного агару (МПА) у матрацах площиною близько 800 см2 (бутилях типу PY) упродовж 46-48 год.
М1крококи композици "ЛРР", як аероби потребували бшьшого адаптацшного перюду перед активним ростом до 5,54 год. Фаза логарифм1чного росту для мжрокоюв у дослщному середовищ1, тривала вщ 6-i'
57
до 9-1 год культивування. Пщ час культивування термш генераци для мкрокоюв мав 5,26 год, а фаза затримки росту утах -0,23 год-1 становила до 12 год.
Пщ час спшьного росту молочнокислих бактерш з м1крококом за умов перемшування та перюдично! нейтрал1заци культурально! рщини константа швидкост1 подшу кл1тин композици "ЛРР" була бшьшою у 1,1-1,2 рази, шж у цьому середовищ1 за стацюнарних умов. Для композици "ЛРР" тривалкть фази (Г/) молочнокислих бактерш становила 2,19 год, а мжрокоюв - 2,82 год, 1 була коротша на 6 % та 32 %, вщповщно, пор1вняно з1 стацюнарними умовами (рис. 1, табл. 1).
Максимальну чисельшсть молочнокислих м1крооргашзм1в I мжрококу спостер1гали на 14 год культивування: 9,8 I 8,3 ^ КУО/см3, вщповщно. Настуина година культивування характеризувалася постшним р1внем чисельност1 молочнокислих бактерш та мжрокоюв та вщ'емними значениями константи швидкост1 подшу кл1тин.
Завдяки постадшному внесению шокуляту фаза логарифм1чного росту молочнокислих бактерш зб1галась з такою фазою мкрокоюв I тривала з 6 до 9 год культивування. У цей перюд константа швидкост1 подшу (V) була найбшьшою, як для молочнокислих бактерш, так I м1крокоюв, та становила V = 1,03 год-1 та 0,44 год-1, вщповщно (див. табл. 1). У перюд з 6 до 12 год константа швидкосп под1лу (V) становила для молочнокислих бактерш, I мшрокоюв, V = 0,87 год-1 та 0,42 год-1 вщповщно.
Таблиця 1
Основш параметри росту композицш "ЛРР" за р1зних умов _культивування_
Умови культивування Компонента ЗК X 109, КУО/см3 Умакс* год- V, год-1 Тъ год & год
стацюнарш умови, з перюдичною нейтрал1защею МКБ (4,0±0,3) 0,85 0,59 2,33 1,18
МК (0,1±0,1) 0,40 0,24 4,13 2,5
з перем1шуванням, з перюдичною неитрал1зац1ею МКБ (6,8±0,1) 1,03 0,64 2,19 0,97
МК (0,2±0,1) 0,44 0,27 2,82 2,27
МК (0,06±0,2) 0,42 0,29 1,40 2,38
з перем1шуванням, з перюдичною нейтрал1защею МКБ (3,0±0,2) 0,95 0,56 0 1,05
МК (0,08±0,2) 0,44 0,30 1,19 2,27
За весь перюд культивування константа швидкост1 подшу кл1тин МКБ та МК склала 0,64 год-1 та 0,27 год-1 вщповщно. Постадшне внесения шокуляту за умов перемшування та перюдично! нейтрал1заци середовища також забезпечувало прискорення тривалост1 генераци кл1тин (g) молочнокислих бактерш та мжрокоюв на 18 % \ 9 % вщповщно пор1вняно з1 стацюнарними умовами культивування. Як видно з рис. 1, теля 14 год культивування починалась стацюнарна фаза росту \ тому процес нагромадження бюмаси композици "ЛРР" припиняли.
58
10
и 4'Ы'
.г
2 4 6 8 10
Триватсть культивування, год
МК ГУ
12
14
МКБ -молочнокисл/ бактерп, МК - мгкрококи. Рис. 1. Динамжа розвитку композищ! "ЛРР'
1,25
1,00
- 0,75
0,50
0,25
16
9
8
0
7
0
Для пщвищення приросту бюмаси компонента композицп було застосоваио двостадшний спос1б дискретного внесения вуглеводного джерела глюкози, оскшьки внесения глюкози разом з лактозою не дали повно! утил1зацп вуглеводних компонента (рис. 2). Спочатку в поживне середовище вносили половину загально! кшькост1 глюкози (1 %) на 3 год вщ початку культивування разом з шокулятом молочнокислих бактерш, а решту (1 %) - через 7 год спшьного росту вс1х складник1в композици.
Експериментально було встановлено, що першу нейтрал1зацш культурального середовища слщ проводити через 6 год росту композици, доводячи рН культурально! рщини до 6,5-6,6 од. рН, а пот1м - через кожну годину. Максимальний приркт кислотност1 (А рН) та штенсивне споживання глюкози встановлено в перюд активного росту вщ 6 до 14 годин культивування (див. рис. 2).
Це дозволило пщвищити ефектившсть нагромадження бюмаси композици "ЛРР" майже в 2 рази та подовжити фазу активного росту на 3 год та забезпечити необхщне сшввщношення м1ж молочнокислими бактер1ями та мжрококами 2:1, вщповщно. За цей термш мшрооргашзмами було утил1зовано всю додану глюкозу (див. рис. 2).
Отже отримаш результати свщчать, що тривалкть процесу нагромадження бюмаси композици "ЛРР" не повинна перевищувати 15 годин.
59
12
10
Á 1 'А. Á
I
I
I
I
6 8 10 12 Триватсть культивування, год
14
16
8
6
4
2
0
0
0
2
4
Рис. 2. Прир1ст кислотн octí (1) та споживання глюкози (2) композицию "ЛРР" у поживному середовищь
Таким чином, опрацьоваш режими дозволили досягти виходу сиро! бюмаси бшя 7,0-7,5 г/дм3 ростового середовища та 4,5-5,5 г/дм3 сухого бактер1ального концентрату з чисельн1стю кл1тин молочнокислих бактер1Й 1,0-1011 КУО/г та м!крококу 1,0-109 КУО/г. Таю харатеристики е цшком достатн1ми для иромисловго виробництва препарату.
Висновки.
1. Розроблено рецептуру поживного середовищ для нагромадження б1омаси комплексно! заквашувально! композиц1й «ЛРР»,
2. Встановлено, процес нагромадження б1омаси композиц1ю "ЛРР" повинен використовувати постад1йне внесения nociBHoro матер1алу, з двостад1йним внесениям вуглеводу, перем1шуванням, урахуванням умов пер1одично1 нейтрал1заци культурально! р1дини, оптимальним сп1вв1дношення м1ж штамами 2:2:2 та к1льк1стю шокуляту 6 %.
3. Вих1д сиро! б1омаси композиц^ "ЛРР" становив 7,0-7,5 г/дм3 ростового середовища та 4,5-5,5 г/дм3 сухого бактер1ального концентрату з чисельшстю КЛ1ТИН молочнокислих бактер1й 1,0-Ю11 КУО/г та м1крококу 1,0-109 КУО/г.
Л1тература
1. Шиффнер Э. Бактериальные культуры в мясной промышленности / Э.Шиффнер, В. Хагедорн, К. Опель; Пер. с нем. - М.: Пищевая промышленность. - 1980. - 96 с.
2. Leroy F. Functional meat starter cultures for improved sausage fermentation / F. Leroy, J. Verluyten, L. De Vuyst // Int. J. Food Microbiol. - 2006. -Vol. 106, № 3. - P. 270-285.
60
3. Hammes W.P. New developments in meat starter culture / W.P. Hammes, C. Hertel // Meat Science - 1998. - Vol. 49, № Suppl. 1. - P. S125-S138.
4. Safety improvement and preservation of typical sensory qualities of traditional fermented sausages using autochthonous starter cultures / R. Talon, S. Leroy, L. Lebert L. et al. // Int. J. Food Microbiol. - 2008. - Vol. 126, № 1-2. - P. 227-234.
5. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Перт [пер. с англ., под ред. И.Л. Работновой]. - М.: Мир, 1978. - 331 с.
6. Биотехнология. Учебник / И.В. Тихонов, Е.А.Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; под ред. Е.С. Воронина. - СПб.: ГИОРД, 2008. - 704 с.
7. Промышленная микробиология / [З.А. Аркадьева, М.С. Безбородов, И.Н. Блохина и др.] под. ред. Н.С. Егорова. - М.: Высшая школа, 1989. - 688с.
8. Пат. 2083665 С1 РФ, МКИ 6 С 12 N 1/20, A 22C 11/00, (C 12 N 1/20, C 12 R 1:225), (C 12 N 1/10). Способ приготовления бактериального препаратадля приготовления мясных продуктов: Костенко Ю.Г., Солодовникова Г.И., Кузнецова Г.А., Спицына Д.Н., Самойленко В.А., Олейников P.P., Якшина Т.В. - № 951109757/13; Заявл. 13.06.95; Опубл. 10.07.97. - 3 с.
9. А.с. 798171 СССР, С 12 N 1/20, А 22 С 11/00. Штамм Lactobacterium plantarum L13, используемый в производстве сырокопченых, сыровяленых колбас и копченостей / Клаар Я.И., Элиас П., Рей М.К. Кирикалл В.В. - № 2737105/28-13; Заявл. 7.03.79; Опубл. 23.01.81., Бюл. №3. - 2 с.
10. Перфильев Г. Д., Гудков А.И., Григорьев НИ. Развитие молочнокислых бактерий в зависимости от содержания в среде микроэлементов // Молочная промышл. - 1982. -№ 6. - С. 30-31.
11. Raccach M., Marshall Pamela S. Effect of manganese ions on the fermentative activity of frozen- thawed lactobacilli // J. Food Sci. - 1985. - Vol. 50, № 3. - P. 665-668.
12. Пат. 51006 A UA, МКИ 6 c 12 N 1/20, F 23 C 9/12. Cnoci6 одержання бактер1ального концентрату БТП-Ф для виробництва кисломолочних продукта: Сресько Г.О., Потемська O.I., Тарадш Г.К., К1гель Н.Ф. - №2001117923; Заявл. 20.11.01; Опубл. 15.11.02, Бюл. № 11 - 4 с.
13. ГОСТ 3624-92. Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности М.: Изд-во стандартов, 1992.- 8 с.
14. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. / Ред. Хеншен А., Хупе К.П., Лотшпайх Ф., Вёльтер В. - М.: Мир, 1988. - 687с.
15. Пирог Т. П. Загальна м1кробюлогш: Шдручник. - К.: НУХТ, 2004. -
471 с.
16. ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислыхмикроорганизмов. - М.: Изд-во стандартов, 1989. - 13 с.
61
Summary Danylenko S.G.
BIOTECHNOLOGY OF BACTERIAL PREPARATION "LLR"
Was created a bacterial preparation "LRR" _ for the _ fermentation of poultry meat, which includes cultures of Lactobacillus rhamnosus andKocuria rosea.
Biotechnology of this preparation consists of a phased introduction of sowing material, the two-stage introduction of glucose, mixing, metering conditions periodic neutralization of cultural liquid. Duration of biomass growth is 12-14 hours at a temperature of (32±1) °C on a periodic neutralization of culture medium.
Key words: bacterial preparation, biotechnology, ynokulyat, pytatelnaya environment.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Буцяк B.I.
62
