CC BY
444
УДК 579.222.4:579.266:579.6
Л.М.ПАВЛОВА, Н.Г.КУИМОВА, О.В.РИМКЕВИЧ
Биотехнологический потенциал фосфатмобилизующих бактерий в процессах рекультивации посттехногенных ландшафтов
Показано, что почвенные бактерии осуществляют мобилизацию фосфора из его труднодоступных соединений, тем самым ускоряя процесс естественного восстановления почвенно-растительного покрова на техногенно-нарушенных территориях.
Ключевые слова: фосфатмобилизующие бактерии, техногенные почвогрунты, посттехногенные почвы, биотехнологический потенциал.
Biotechnological potential of phosphate-mobilizing bacteria in the processes of post-technogenic landscapes restoration. L.M.PAVLOVA (Institute of Geology and Nature Management FEB RAS, Blagoveschensk), N.G.KUIMOVA (Amur Branch of Botanical Garden-Institute FEB RAS, Blagoveschensk), O.V.RIMKEVICH (Institute of Geology and Nature Management FEB RAS, Blagoveschensk).
Soil bacteria mobilize phosphorus from its insoluble compounds, by that accelerating the process of natural recovery of soil-plant formation on technogenically disturbed lands.
Key words: phosphate-mobilizing bacteria, technogenic lands, post-technogenic soils, biotechnological potential.
Открытые горные работы на месторождениях россыпного золота сопровождаются образованием неблагоприятных форм техногенного рельефа. Естественное восстановление почвенно-растительного покрова на таких ландшафтах происходит достаточно медленно. Поэтому для регионов, в которых горнодобывающая отрасль имеет длительную историю развития, необходимость поиска экономически оправданных способов восстановления биологической продуктивности нарушенных территорий особенно актуальна. Традиционные рекультивационные технологии заключаются в первоначальной технической подготовке нарушенных площадей и последующей фиторемедиации. Положительный эффект от фиторемедиации основан на взаимодействии и совместном развитии корневой системы растений и микробного сообщества почвогрунтов, поскольку основные процессы почвообразования связаны с деятельностью микроорганизмов [4, 5]. Формирующиеся посттехногенные экосистемы характеризуются специфическими особенностями, в частности низким содержанием элементов питания в новообразованных почвогрунтах или их малодоступностью для растений.
Кларк минерального фосфора - одного из главных элементов, необходимых для роста и развития растений, в земной коре невысокий (около 0,1%). В свободном состоянии
ПАВЛОВА Людмила Михайловна - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, РИМКЕВИЧ Ольга Вячеславовна - младший научный сотрудник (Институт геологии и природопользования ДВО РАН, Благовещенск), КУИМОВА Наталья Григорьевна - кандидат биологических наук, ученый секретарь (Амурский филиал Ботанического сада-института, Благовещенск). E-mail: pav@asnet.ru
Работа выполнена при поддержке гранта ДВО РАН 06-III-B-06 «Стимуляция роста растений свободноживущими мобилизующими фосфор микроорганизмами».
фосфор в литосфере не встречается, он вовлекается в глобальную циркуляцию путем выщелачивания и растворения континентальными водами. В экосистемах суши подвижные формы фосфора частично поглощаются растениями, синтезирующими его органические соединения. Возвращающиеся в почву органофосфаты подвергаются микробной деструкции и превращаются в минеральные ортофосфаты, доступные для усвоения автотрофами. В круговороте фосфора существенную роль играют микроорганизмы, которые способствуют его поступлению в растения [1]. Специфичные бактерии и грибы, непосредственно мобилизующие фосфор, до настоящего времени не установлены. Предполагается, что в данных процессах они участвуют косвенно, синтезируя кислоты и ферменты, способствующие образованию доступных для растений фосфатов [7]. Активные организмы, мобилизующие фосфор, являются важной составляющей растительно-микробиального сообщества, способствующего образованию посттехногенных почв, что и определило цель данной работы - поиск бактерий с фосфатмобилизующими свойствами из техногенных почвогрунтов россыпной золотодобычи и определение их биотехнологического потенциала. Для достижения цели было необходимо выделить и идентифицировать фосфат-мобилизующие бактерии, определить их способность к биогенной мобилизации фосфора и влияние на прорастание семян пионерных растений.
Исследовали почвогрунты гале-эфельных отвалов Яснополянской россыпи (Дамбу-кинский золотоносный узел Амурской области), образованные 7-10 лет назад технологическими отходами россыпной золотодобычи. В разрезе отвалы представляют слабо-стратифицированный почвогрунт с преобладанием промытой крупной гальки и гравия, мелкозем составляет 10-30%. В местах, занятых растительностью, просматривается корнеобитаемый слой (10-15 см), морфологически мало отличающийся от нижележащих горизонтов.
Физико-химические показатели почвогрунтов и подвижные формы фосфора [3] определяли в образцах, отобранных на свободных от растительности отвалах. Фосфатмобили-зующие бактерии выделяли из почвогрунтов, ризосферы и ризопланы пионерных растений. Их учет вели на элективных средах из колоний, образующих зоны растворения фосфата. На среде Муромцева учитывали бактерии, растворяющие ортофосфаты кальция; на глюкозоаспарагиновом агаре (со свежеосажденными фосфатами А1 и Бе) - растворяющие ортофосфаты алюминия и железа, на среде Менкиной - осуществляющие ферментативное расщепление органических фосфатов [6, 8]. Идентификацию выделенных штаммов выполняли молекулярно-генетическими методами [12-14] с учетом фенотипических признаков [10].
Оценку биотехнологического потенциала выделенных штаммов проводили на основании их способности к мобилизации подвижных форм фосфора из почвогрунтов и растворов, изменению рН среды, а также с учетом характера их влияния на прорастание семян сосны обыкновенной [15, 16].
Результаты исследований. По физико-химическим показателям мелкозем почвогрунтов характеризуется минимальным содержанием гумуса (0,34%) и азота (0,019%), высокой обеспеченностью обменным калием (155-190 мг/кг). Количество общего фосфора значительное (340-380 мг/кг), подвижного - очень низкое (27-42 мг/кг), что свидетельствует о преобладании в грунтах минеральных фосфатов, наличии небольшой доли органического фосфора и соответствует низкому потенциальному плодородию почв [2].
Формы нахождения соединений фосфора в почве зависят от окислительновосстановительных условий среды. В почвах со щелочной или близкой к нейтральной реакцией среды (рН 6,0-8,0) основной формой минеральных фосфатов является ортофосфат кальция. В кислых почвах (рН 3,0-6,0) минеральный фосфор представлен ортофосфатами железа и алюминия. В исследуемых почвогрунтах наблюдалась близкая к нейтральной реакция среды (рН 6,6), вследствие чего поиск и выделение фосфатмобилизую-щих бактерий осуществляли на среде с ортофосфатом кальция. Количественный анализ
фосфатмобилизующих микроорганизмов показал, что их численность в корнеобитаемом слое пионерных растений достигала 3,5-7,9 тыс. КОЕ/г, в почвогрунтах - 8,3 тыс. КОЕ/г, что в целом составило 5-10% от общей численности учитываемых бактерий. Такое соотношение физиологических групп бактерий подтверждает данные агрохимического анализа о недостаточной обеспеченности почвогрунтов доступными подвижными соединениями фосфора, так как в почвах с удовлетворительным фосфатным режимом количество микроорганизмов данной группы обычно приближается к общей численности бактериального сообщества [11].
Всего в чистую культуру изолировано 11 штаммов (Р1-Р11) фосфатмобилизующих бактерий (см. таблицу): четыре штамма (Р1-Б4) - из почвогрунтов, свободных от корней растений, три (Б5-Р7) - из корневой зоны сосны обыкновенной, по два - из корневой зоны лиственницы Гмелина и березы даурской (Б8, Б9 и Б10, Б11 соответственно).
Образование зон растворения фосфатов на различных средах
Группа штаммов Источники фосфора
Место выделения* Штамм Видовая принадлежность ортофосфаты кальция ортофосфаты алюминия ортофосфаты железа о о ф о н 2 £ ра орф
i Почвогрунт F1 Acinetobacter lwoffii + - - +
ii - / - F2 Paenibacillus chitinolyticus + + + -
iii - / - F3 Arthrobacter nitroguaiacolicus + - - +
IV - / - Pinus sylvestris L. F4 Paracoccus aminovorans + + + +
V Гс F5 Brachybacterium rhamnosum + - - +
iii Рс F6 Arthrobacter nitroguaiacolicus + - - +
Vi Рп Larix gmelinii Rupr. F7 Staphylococcus saprophyticus + +
V Гс F8 Brachybacterium rhamnosum + - - +
V Рп Betula davurica Pall. F9 - / - + +
i Pc F10 Acinetobacter lwoffii + - - +
V Рп F11 Brachybacterium rhamnosum + - - +
* Гс - гистосфера, Рс - ризосфера, Рп - ризоплана.
Как известно, в процессе роста и развития микроорганизмы способны изменять кислотность среды, что в конечном итоге влияет на метаболическую активность растений. Исходя из предположения о том, что в природных экотопах присутствуют микроорганизмы, обладающие широким диапазоном адаптивных к рН среды свойств, определили способность выделенных штаммов к мобилизации фосфора из фосфатов алюминия и железа. Из 11 штаммов только два (Б2 и Б4) из почвогрунтов вне корневой зоны проявили способность к мобилизации фосфора из широкого спектра минеральных фосфатов (железа, алюминия, кальция).
Трансформацию фосфора бактерии осуществляют либо растворением минеральных фосфатов за счет образования метаболических кислот (литотрофная составляющая), либо за счет ферментативного дефосфорилирования его органических соединений (гетеротрофная составляющая). Считается, что большинство бактерий в природных условиях используют эти механизмы одновременно.
Изучение способности выделенных штаммов к мобилизации фосфора по второму механизму (на среде с органофосфатами) показало, что все штаммы, за исключением F2, обладали способностью к ферментативному растворению органических фосфатов. Поскольку у штамма F2 такая способность не обнаружена, можно предположить, что в природной среде обитания эти бактерии специализируются только на окислении минеральных фосфатов и относятся к группе хемолитотрофных фосфатмобилизующих организмов. Остальные штаммы обладали способностью к трансформации как органических, так и минеральных форм фосфора (см. таблицу).
Установлено, что выделенные штаммы принадлежат к шести видам бактерий, представляющим три класса: Arthrobacter nitroguaiacolius и Brachybacterium rhamnosum -класс Actinobacteria; Paenibacillus chitinolyticus и Staphylococcus saprophyticus - класс Bacilli; Paracoccus aminovorans и Acinetobacter lwoffii относятся к альфа- и гамма-подклассам Proteobacteria соответственно.
На окислении минеральных фосфатов специализируется только выделенный из почво-грунта P. chitinolyticus (штамм F2). Наибольшей мобильностью обладает P. aminovorans (штамм F4), который проявил способность к мобилизации фосфора из всех форм его соединений. Остальные штаммы, принадлежащие к 4 видам - A. nitroguaiacolius, B. rhamnosum,
S. saprophyticus, A. lwoffii - и выделенные из разных субстратов (почвогрунт, ризосфера, гистосфера и ризоплана пионерных растений), участвуют в процессах мобилизации фосфора из органических форм фосфатов и ортофосфата кальция.
Определение потенциальных технологических возможностей выделенных штаммов было следующей задачей, выполненной в лабораторных модельных экспериментах. Изучена фосфатмобилизующая способность чистых культур A. nitroguaiacolius, B. rhamnosum,
P. chitinolyticus, S. saprophyticus, P. aminovorans и A. lwoffii в жидкой среде, а также бактериальной ассоциации (БА), составленной из всех шести штаммов. По истечении 7 сут инкубации во всех вариантах было установлено достоверное увеличение растворимой формы фосфора (рис. 1). При неизмененном уровне содержания растворимого фосфора в стерильном контроле (885,2 мг/л) наблюдали увеличение его ко -личества в вариантах с B. rhamnosum (161,5 мг/л) > P. chitinolyticus (141,5) > БА (134,7) > P. aminovorans (107,0) > A. nitroguaiacolius (37,0) > S. saprophyticus (12,0) > A. lwoffii (7,0 мг/л).
Активность мобилизации фосфора коррелировала со способностью штаммов к кислото- и щелочеобразованию. Подкисление жидкой среды наблюдали в вариантах с использованием как бактериальной ассоциации, так и чистых культур B. rhamnosum, P. chitinolyticus, P. aminovorans, показавших достоверно максимальное увеличение подвижного фосфора (рис. 2). Минимальная фосфатмобилизующая способность штаммов A. nitroguaiacolius, S. saprophyticus и A. lwoffii коррелировала с увеличением рН жидкой среды.
Продолжительность опытов по изучению динамики накопления растворимого фосфора в почвогрунтах под действием фосфатмобилизующих бактерий (рис. 3) составила 90 сут, что соответствует длительности вегетационного периода в северных районах Амурской области, где в основном сосредоточены рудные и россыпные месторождения золота.
1 2
3
4
5
6
БА
800 850 900 950 1000 1050 Р205 мг/л
Рис. 1. Образование подвижных форм фосфора в жидкой среде. Светлая штриховка - контроль (885 мг/л), темная - увеличение Р2О5 в рабочих вариантах. Здесь и далее: 1 - Acinetobacter lwoffii, 2 - Paenibacillus chitinolyticus, 3 - Arthrobacter nitroguaiacolius, 4 - Paracoccus aminovorans, 5 -Brachybacterium rhamnosum, 6 - Staphylococcus saprophyticus, БА - ассоциативная культура бактерий
Через 7 сут инкубации в вариантах инокуляции навесок почвогрунта штаммами A. lwoffii, P. aminovorans, B. rhamnosum, S. saprophyticus и БА наблюдали значительное снижение количества растворимых форм фосфора. Данное обстоятельство, по-видимому, можно объяснить использованием подвижных фосфатов быстро нарастающей биомассой бактерий. Через 30-90 сут инкубации в вариантах почти со всеми штаммами, за исключением S. saprophyticus, количество подвижного фосфора увеличилось в 1,5-2 раза. Отсутствие фосфатмобилизующего эффекта для S. saprophyticus связано, скорее всего, с тем, что основным местообитанием указанного штамма является ризоплана сосны обыкновенной, а в почвогрунтах он не был обнаружен.
Уровень подвижного фосфора в варианте с P. chitinolyticus через 7 сут инкубации не изменился, однако по истечении 30 сут было установлено резкое возрастание его концентрации - с 63,1 до 100,1 мг/кг почвы. В дальнейшем (через 90 сут) произошло уменьшение подвижного фосфора до уровня его содержания в контрольном варианте.
В варианте с A. nitroguaiacolius через 7 сут наблюдали увеличение содержания подвижного фосфора по сравнению с контролем, но позднее уровень его содержания в почвенном растворе начал уменьшаться и по окончании инкубации практически соответствовал контрольному варианту. Возможно, это вызвано активным биологическим поглощением
Рис. 2. Изменение рН жидкой среды фосфатмоби-лизуютттими бактериями. Здесь и далее К - контроль
Рис. 3. Динамика образования подвижных форм фосфора фосфатмобилизующими бактериями в почвогрунтах (Р205, мг/кг почвы). Верхний столбик - продолжительность эксперимента 7 сут, средний - 30 сут, нижний - 90 сут
подвижного фосфора клетками микроорганизмов в закрытой системе лабораторного эксперимента.
Исследованиями установлено, что выделенные штаммы проявляют разную степень активности в процессах мобилизации фосфора. Высокой активностью характеризуются штаммы A. lwoffii, P. aminovorans и P. сЫйт^кш, выделенные из поч-вогрунта, а также B. rhamnosum из ризопланы сосны. Уровень подвижного фосфора под действием A. nitroguaiacolius увеличивается только на ранних сроках инкубации, а S. saprophyticus характеризуется полным отсутствием фосфатмобилизующих свойств. Исходя из полученных результатов можно предположить, что бактериальная мобилизация фосфора из труднодоступных соединений происходит поэтапно. Первоначально высвобождение закрепленного фосфора могут осуществлять бактерии A. nitroguaia-colius, способные к «быстрой» его мобилизации, далее в этот процесс включаются «медленные» виды - P. сhitinolyticus, A. lwoffii, B. rhamnosum, P. aminovorans, обеспечивающие высокий уровень доступного для растений фосфора на протяжении всего вегетационного периода.
Влияние выделенных фосфатмобилизующих штаммов на прорастание семян сосны обыкновенной (рис. 4) изучали в разных вариантах инокуляции: бактериальной суспензией, культуральной жидкостью и бактериальной биомассой, поскольку в растениеводстве в качестве бактериальных препаратов используют как микробную биомассу (живые клетки), так и их метаболиты, а в некоторых случаях - оба компонента в виде бактериальной суспензии.
При обработке семян бактериальной биомассой положительный эффект установлен в вариантах со штаммами A. lwoffii, P. chitinolyticus и P. aminovorans (повышение всхожести на 17; 26 и 36% по отношению к контролю соответственно). При обработке семян культуральной жидкостью положительное влияние на их всхожесть обнаружено только
Рис. 4. Влияние фосфатмобилизующих бактерий на прорастание семян сосны обыкновенной. Верхний столбик - семена, обработанные биомассой бактерий, средний - культуральной жидкостью, нижний - бактериальной суспензией. К1 - семена, обработанные водой, К2 - средой для выращивания бактерий
для B. rhamnosum (на 30% по отношению к контролю). Обработка семян бактериальной суспензией показала незначительный положительный эффект для P. chitinolyticus и A. nitroguaiacolius (всхожесть повысилась на 10 и 12% относительно контроля). Во всех вариантах опытов с использованием S. saprophyticus и БА стимулирующего прорастание семян эффекта не обнаружено.
Отсутствие «ассоциативного эффекта» БА по сравнению с активностью чистых культур у фосфатмобилизующих бактерий в отличие от ассоциаций азотфиксирующих микроорганизмов [9], по-видимому, связано с присутствием S. saprophyticus. Известно, что некоторые представители рода Staphylococcus являются продуцентами антибиотических веществ. В созданной нами бактериальной ассоциации, вероятно, S. saprophyticus ингибировал активность других штаммов.
В результате исследований выделены активные штаммы фосфатмобилизующих бактерий (P. aminovorans, P. chitinolyticus, B. rhamnosum, A. lwoffii), которые дают комплексный положительный эффект: улучшают режим фосфатного питания растений за счет мобилизации подвижных форм фосфора из его труднодоступных соединений, стимулируют прорастание семян. Высвобождение подвижного фосфора выделенные бактерии осуществляют с разной степенью активности: штамм A nitroguaiacolius обладает способностью к «быстрой», но краткосрочной мобилизации фосфора, а так называемые «медленные» виды - P. сЫйт^юш, A. lwoffii, B. rhamnosum, P. aminovorans - обеспечивают высокий уровень доступного для растений фосфора на протяжении всего вегетационного периода.
Таким образом, фосфатмобилизующая и средообразующая функции бактерий Paracoccus aminovorans, Paenibacillus chitinolyticus, Brachybacterium rhamnosum и Acinetobacter lwoffii в посттехногенных почвогрунтах определяют потенциальную возможность создания на их основе бактериальных препаратов для использования в технологических процессах рекультивации нарушенных территорий.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соровский образоват. журн. 1998. № 10. С. 25-31.
2. Голов ГВ. Почвы и экология агрофитоценозов Зейско-Вуреинской равнины. Владивосток: Дальнаука, 2001. 162 с.
3. ГОСТ 26207-84. Определение подвижных форм фосфора и калия. М.: Изд-во стандартов, 1984. 4 с.
4. Звягинцев Д.Г Почва и микроорганизмы. М.: МГУ, 1987. 256 с.
5. Крупская Л.Т. Охрана и рациональное использование земель на горных предприятиях Приамурья и Приморья. Хабаровск: ИГД ДВО РАН, 1992. 175 с.
6. Методы почвенной микробиологии и биохимии / отв. ред. Д.Г.Звягинцев. М.: МГУ, 1991. 303 с.
7. Рой А. А., Рева О.Н., Курдиш И.К., Смирнов В.В. Биологические свойства фосфатмобилизующего штамма Bacillus subtilis ИМВ В-7023 // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40, № 6. С. 551-557.
8. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева ГИ. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для вузов. М.: Дрофа, 2004. 256 с.
9. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: МГУ, 1986. 132 с.
10. Bergey’s manual of determinative bacteriology. 9th ed. / eds Holt J.G., Krieg N.R., Sneath PH., Staley J.T., Williams S.T. Baltimore; Philadelphia; Hong Hong; London; Munich; Sydney; Tokyo: Williams and Wilkins Co, 1994. 787 p.
11. Conrad R., Klose M., Claus P. Phosphate inhibits acetotrophic methanogenesis on Rice Roots // Appl. Environ. microbiol. 2000. Vol. 66, N 2. P. 828-831.
12. Garrity G.M., Winters M., Kuo A.W., Searles D.B. Taxonomic outline of the Procaryotes Bergey's manual of systematic bacteriology. 2nd ed. / ed. G.M.Garrity. N.Y.: Springer-Verlag, 2002. Vol. 1. 350 p.
13. GenBank: http://www.ncib.nlm.nih.gov.
14. Marmur J.A. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // J. Mol. Biol. 1961. Vol. 3. P. 208-214.
15. Rashid M., Khalil S., Ayub N. et al. Organic acids production and phosphate solubilization by phosphate solubilizing microorganisms (PSM) under in vitro conditions // Pakistan J. of Biol. Sci. 2004. Vol. 2, N 7. P. 187-196.
16. Schroth M.N., Hancock J.G. Disease-suppressive soil and root-colonizing bacteria // Science. 1982. Vol. 216. P. 1376-1381.
