CC BY
190
УДК 633.81:57.085.2
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO ЦЕННЫХ ГЕНОТИПОВ РОЗЫ ЭФИРОМАСЛИЧНОЙ
И.В. Митрофанова, О.В. Митрофанова, В.А. Браилко, Н.П. Лесникова-Седошенко
ГБУ РК «Никитский ботанический сад - Национальный научный центр»,
298648, Россия, Республика Крым, г. Ялта, пгт Никита, Никитский спуск, 52, [email protected]
Сорта Фестивальная, Радуга, Лань, Кооператорка, Мичуринка, Искра являются наиболее ценными и перспективными эфиромасличными розами для выращивания на юге России. Целью настоящего исследования было изучение особенностей регенерации из меристемы растений розы эфиромас-личной и оценка их морфо-анатомических и физиологических параметров в процессе культивирования в условиях in vitro. Эксперименты проводились в Никитском ботаническом саду - Национальном научном центре. Определены сроки отбора исходных эксплантов. Проведена оценка влияния 6-бензиламинопурина (БАП) на индукцию побегообразования и формирование листьев. Экспланты культивировали на модифицированной питательной среде МС, дополненной 0; 0,5; 1,0; 1,5 мг/л БАП, 30 г/л сахарозы, 8 г/л агара. Для хемотерапии in vitro добавляли 2-25 мг/л рибавирина. Определяли среднее, отклонение от среднего, подсчитывая процент развившихся меристем, длину побегов, количество листьев. Проведено морфо-анатомическое исследование листьев. Достоверность различий между вариантами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Оводнен-ность тканей оценивали весовым методом. Рассчитывали переменную флуоресценцию, индекс жизнеспособности и фотосинтетическую активность. Более высокий процент развившихся меристем был получен в феврале-марте. Максимальная длина регенерировавших побегов была отмечена у сортов Искра и Кооператорка на начальном этапе культивирования. Максимальное количество листьев на микропобег формировали сорта Радуга, Искра и Фестивальная (4-7 листь-ев/эксплант). Высокий коэффициент размножения отмечен у сорта Фестивальная (1: 5-1: 6). По максимальному количеству листьев на побег, минимальному индексу формы листьев, по анатомическим характеристикам развитости палисадной ткани, количеству хлоропластов в клетках фотосинтезирующей ткани, развитию механической обкладки проводящего пучка выделился сорт Фестивальная. Однако максимальный интегральный показатель фотосинтетической активности, индекс жизнеспособности установлен у регенерантов сорта Лань. По результатам анализа
флуоресценции хлорофилла а физиологическое состояние листьев всех изученных регенерантов в условиях in vitro находится в норме. Ил. 5. Табл. 3. Библиогр. 24 назв.
Ключевые слова: роза эфиромасличная; меристема; микроразмножение; in vitro; морфо-анатомическая характеристика листа; флуоресценция.
BIOTECHNOLOGY AND PHYSIOLOGY FEATURES
OF VALUABLE GENOTYPES OF ESSENTIAL OIL ROSES IN VITRO CULTIVATION
I.V. Mitrofanova, O.V. Mitrofanova, V.A. Brailko, N.P. Lesnikova-Sedoshenko
Nikitsky Botanical Gardens - National Scientific Center,
52, Nikitsky Spusk St., Nikita, Yalta, Crimea Republic, 298648, Russia, [email protected]
Festivalnaya, Raduga, Lany, Kooperatorka, Michurinka, Iskra are the most important and perspective cultivars of essential oil roses for growing in the South of Russia. This study aimed to investigate the features of regeneration of essential oil rose plants from meristem and to evaluate of their morphological, anatomical and physiological parameters during the process of cultivation in vitro. The experiments were conducted at Nikitsky Botanical Gardens - National Scientific Center. The terms of initial explants selection were determined. Due to evaluate the process of induction of shoots and leaves formation the different concentration of 6-benzylaminopurine (BAP) were tested. Explants were cultured on a modified MS medium supplemented with 0; 0.5, 1.0; 1.5 mg - BAP, 30 g - sucrose, 8 g Г1 agar. During chemotherapy in vitro 2-25 mg Г1 Ribavirin to media were added. Means were determined, the percentage of developed meristems, shoot length, number of leaves were counted. A morphological and anatomical investigation of the leaves was done. The significance of differences between the variants was evaluated by using t-Student test. Hydration tissue was evaluated by the gravimetric method. Variable fluorescence, viability index and photosynthetic activity were counted. A higher percentage of developed meristems was obtained in February and March. The maximum length of regenerated shoots was observed in cultivars Iskra and Kooperatorka at the initial stage of cultivation. Cultivars Raduga, Iskra and Festivalnaya formed maximum number of leaves per microshoots (4-7 leaves/explant). Cultivar Festivalnaya was characterized by high multiplication rate (1: 5-1: 6). According to the maximum number of leaves on the shoot, the minimum index leaf shape, anatomical characteristics of the development of palisade tissue, the number of chloroplasts in photosynthetic tissue cells, and the development of mechanical vascular bundle sheath, the cultivar Festivalnaya was marked. However, the maximum integral indicator of photosynthetic activity, viability index at the regenerants of cultivar Lany were established. On the base of the results of chlorophyll fluorescence analysis the physiological state of leaves of all investigated regenerants in vitro was normal. 5 figures. 3 tables. 24 sources.
Key words: essential-oil rose; meristem; micropropagation; in vitro; morpho-anatomy characteristic of leaf; fluorescence.
ВВЕДЕНИЕ
Роза - одно из самых красиво цветущих растений, известных человечеству с древних времен благодаря своему декоративному и коммерческому значению. Особое место в роду Rosa L. занимает роза эфиромасличная, которая выращивается в России с XIX века, а в Крыму первые ее посадки были произведены в 1877-1894 гг. Розовое масло, розовая вода и другая продукция из розы эфиромасличной имеют важное коммерческое значение на международном рынке и используются в пищевой, парфюмерно-косметической и медицинской промышленностях.
Традиционное размножение розы проводят
черенками, прививкой или окулировкой, которые являются сложными и трудоемкими процессами. При таком способе размножения чаще всего вирусные, бактериальные и грибные инфекции передаются от растения к растению, активно распространяясь, значительно повышая степень поражаемости розы эфиромасличной [2,13]. Использование биотехнологических методов стало альтернативой вегетативному способу размножения розы [8,13,17]. Успешность применения методов культуры органов и тканей зависит от генотипа растения, трофических, гормональных и физических факторов, влияя на процессы регенерации, укоре-
нения эксплантов, адаптации и депонирования регенерантов [11,12]. Вместе с тем, необходимо проводить изучение морфо-анатомических и физиологических процессов при длительном культивировании растительного материала in vitro для последующей разработки методов мониторинга жизнедеятельности растений и определения среди изучаемых генотипов сортов с наиболее высокой потенциальной адаптивностью к условиям водного стресса.
Целью настоящего исследования было изучение особенностей регенерации из меристемы растений розы эфиромасличной и оценка их морфо-анатомических и физиологических параметров в процессе культивирования в условиях in vitro.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследования проводили в отделе биологии развития растений, биотехнологии и биобезопасности ГБУ РК «Никитский ботанический сад - Национальный научный центр». Растительный материал изучаемых сортов розы эфиромасличной (Фестивальная, Искра, Мичу-ринка, Кооператорка - селекции ГБУ РК «НБС-ННЦ» и Радуга, Лань - селекции ГБУ РК «Институт сельского хозяйства Крыма») был отобран с пятилетних растений из селекционно-коллекционного участка Никитского ботанического сада. В работе применяли общепринятые и разработанные в отделе биотехнологии методы культуры органов и тканей [3,4,7,12,20]. В качестве эксплантов для размножения в условиях in vitro использовали сегменты побега с вегетативной почкой, отобранные в верхней, средней и нижней частях интактного растения. Экспланты промывали проточной водопроводной водой в течение 10 мин., подсушивали с помощью фильтровальной бумаги и стерилизовали. Стерилизацию проводили последовательным погружением эксплантов в 70%-й этанол на 30 сек, 1%-й раствор Thimerosal («MERCK», Германия) на 7-10 мин., 2-3%-й раствор NaClO на 15-17 мин. с 4-5-кратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. Для повышения эффективности стерилизации в растворы добавляли 2-3 капли детергента «Tween-80».
Выделение и введение меристематических тканей в культуральные сосуды на питательную среду осуществляли в асептических условиях ламинарного бокса (Fatran Lf, Чехия). Меристемы размером 0,2-0,4 мм выделяли из вегетативных почек под бинокулярным микроскопом Discovery 12 (Zeiss, Германия) и помещали в культуральные сосуды на модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга [21], до-
полненную 0,1 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК), 0,5 мг/л гибберелловой кислоты (ГК3) и 0; 0,5; 1,0 и 1,5 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 30 г/л сахарозы, 8 г/л агара. рН питательной среды доводили до 5,6 с помощью 1 н. раствора NaOH. Для хемотерапии in vitro в питательные среды добавляли вироцид рибавирин (ви-разол, 1 -бета^-Рибофуранозил-1Н-1,2,4-триа-зол-карбоксамид, «Sigma», США) в концентрации 2-25 мг/л. БАП вносили в среду до авто-клавирования при 121 °С в течение 20 мин. ГК3 добавляли в среду непосредственно после ав-токлавирования. Экспланты помещали в климатическую камеру с температурой 24 ± 1 °С, интенсивностью освещения 2,5 клк и 16-часовым фотопериодом. Опыты проводили трижды в десятикратной повторности, определяли среднее, отклонение от среднего, подсчитывая процент развившихся меристем, длину побегов, количество листьев и микропобегов.
Для определения линейных размеров микропобегов брали по 3-5 растений каждого сорта, морфометрию листьев для расчета индекса формы листовых пластин проводили с 10-кратной повторностью [5]. Анатомические микропрепараты изготавливали по общепринятой методике. Гисто-анатомическое изучение листьев трех сортов розы эфиромасличной («Радуга», «Лань», «Фестивальная») было проведено с помощью светового микроскопа AxioScope
A.1 (Zeiss, Германия) и программного приложения Axio Vision Rel. 4.8.2. Морфометрические измерения проводили в 10 полях зрения для каждого препарата. Для статистической обработки полученных измерений использовали программное приложение Statistica 6.0, с помощью которого определяли среднее арифметическое значение (M), стандартную ошибку среднего (m), стандартное отклонение (а). Достоверность различий между вариантами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента на 5% уровне значимости, обеспечивающем 95% доверительную вероятность.
Оводненность тканей оценивали весовым методом, фракционный состав воды определяли по методу Маринчика-Гусева [9].
Параметры фотосинтетической активности (ФА) измеряли при помощи портативного флуо-риметра «Флоротест» (Институт кибернетики им.
B.М. Глушкова НАН Украины). В ходе экспериментов регистрировали следующие показатели: начальный уровень флуоресценции после облучения (F0), максимальное (Fm) и стационарное (Fst) значения флуоресценции после световой адаптации. Рассчитывали переменную флуоресценцию, индекс жизнеспособности и фотосинтетическую активность [1,10,24].
а» н о
S
а»
к о X S
3 m s
m п га ü
о m
80
60
40
20
-
^ГЬ.
лйКшД
III IV V VI VII VIII IX Сроки отбора эксплантов, мес
X
XI
XII
Ш Радуга □ Лань ■ Фестивальная И Мичуринка □ Кооператорка И Искра
Рис. 1. Влияние сроков отбора эксплантов 6 сортов розы эфиромасличной на их развитие
в условиях in vitro
0
I
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Дифференциация и развитие меристема-тических тканей в значительной мере зависели от срока отбора эксплантов, генотипа и содержания регуляторов роста в питательной среде.
В условиях Южного берега Крыма лучшим сроком отбора и введения меристематических тканей всех изучаемых сортов розы эфиромас-личной in vitro были февраль-март (рис. 1). Частота развития эксплантов достигала 92-100% и зависела от сорта. При этом нами учитывалась зараженность растительного материала вирусной инфекцией.
В зимне-весенний период удавалось изолировать меристему, и, используя метод хемоте-рапии in vitro, легче было оздоровить растение. Отбирая исходные экспланты в летне-осенний период, высока вероятность получения вирусных растений в связи с накоплением в донорном растительном материале вирусной инфекции (Tobacco mosaic virus, Rose streak virus, Rose wilt virus, Tomato spotted wilt virus, Tobacco necrosis virus, Tomato ringspot virus, Arabis mosaic virus и др.).
В процессе исследования нами отмечено, что изолированные меристемы размером 2-4 мм развивались на модифицированных питательных средах, дополненных БАП в разных концентрациях. На питательных средах без ци-токинина (контроль) экспланты погибали на 21 сут. культивирования. Культивирование изолированных меристем на модифицированных питательных средах, дополненных БАП в разных концентрациях, показало, что содержание данного цитокинина в питательной среде зна-
чительно увеличивало регенерацию микропобегов и формирование листьев. В этих же условиях добавление в среду ГК3 индуцировало развитие меристем и образование микропобегов. Это согласуется с данными, представленными в работе T. Elavazhagan и K.D. Arunachalam [19]. Через 21 сут. культивирования на средах с БАП у всех изучаемых сортов розы эфиромасличной отмечали регенерацию одного микропобега с 1-4 сложными листьями. Эти побеги переносили на свежеприготовленную среду.
На рис. 2 представлены результаты роста микропобегов культивируемых сортов розы эфиромасличной после 48 сут. на средах с 0,51,5 мг/л БАП. Активное увеличение длины микропобега наблюдали у сорта Искра при концентрации БАП 0,5 и 1,5 мг/л, у сорта Кооператорка - в присутствии 1,0 мг/л цитокинина. Микропобеги имели зеленую окраску и не были овод-ненными.
Для оценки морфогенной способности сортов розы эфиромасличной в условиях in vitro нами было проанализировано количество сформировавшихся листьев. Учет количества листьев показал, что такие сорта, как Радуга, Искра, Фестивальная образовывали в среднем от 4 до 7 листьев на микропобег (рис. 3). Количество листьев способствовало повышению пластичности того или иного сорта и его дальнейшей адаптивности к различным факторам культивирования. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Е.Б. Кириченко и его сотрудников [8].
На этапе собственно микроразмножения
Рис. 2. Зависимость роста микропобегов розы эфиромасличной от генотипа и концентрации БАП в питательной среде: 1 - Радуга; 2 - Лань; 3 - Фестивальная; 4 - Искра; 5 - Мичуринка; 6 - Кооператорка
основной задачей является индукция множественного побегообразования, что чаще всего лимитируется как самим сортом, так и триггерами биотехнологического процесса. Было установлено, что частота регенерации микропобегов зависела от концентрации БАП в питательной среде и количества субкультивирований. Так, после 2 и 3 субкультивирования на этапе собст-
венно микроразмножения количество микропобегов в среднем по сортам достигало 4 ± 0,1 шт./эксплант. У сортов Кооператорка, Радуга и Лань коэффициент размножения составил 1 : 4, у сортов Мичуринка и Искра -1 : 3. Высокий коэффициент размножения отме-чали у сорта Фестивальная (1 : 5-1 : 6). На рис. 4 представлены результаты побегообразования сортов
к
о х
О ш
ш га
V ш
^ О п га о. ю о
8 6 4 2 0
6
4
3 Сорт
0,5
1
1,5
Концентрация БАП, мг/л
Рис. 3. Зависимость образования листьев на микропобегах розы эфиромасличной от генотипа и концентрации БАП в питательной среде: 1 - Радуга; 2 - Лань; 3 - Фестивальная; 4 - Искра; 5 - Мичуринка; 6 - Кооператорка
Рис. 4. Регенерация множественных микропобегов сортов розы эфиромасличной: а - Фестивальная; б - Радуга; в - Лань (масштаб 1 см)
Фестивальная, Радуга и Лань. В процессе микроразмножения наблюдали спонтанное укоренение микропобегов, что в литературе трактуется как «гормональная автономность» растительных клеток в условиях in vitro [16].
Для дальнейшего получения полноценных регенерантов микропобеги и микрочеренки высаживали на среды для корнеобразования.
Культивируемые регенеранты розы в условиях in vitro достигали высоты от 2,4 до 5,6 см (табл. 1). Сравнивая данные по этому показателю у трех сортов розы эфиромасличной, можно сказать, что наибольшая высота микропобегов характерна для сорта Лань (3,64,2 см), наименьшая - для сорта Радуга (2,43,2 см). Листья тройчатосложные, жилкование перистое, край листовой пластины - пильчатый. Среднее количество листьев на микропобеге составило 6 ± 2 шт. у сортов Лань и Радуга, 7 ± 2 шт. - у сорта Фестивальная. Наиболее крупные листья характерны для сорта Лань (0,63 х 0,87 см). Самый высокий индекс формы листа характерен также для этого сорта (0,73), что указывает на округлую форму. Этот показатель опосредованно характеризует количество поглощенной световой энергии. Таким образом, генотип с меньшим индексом будет эффективно использовать освещение, необходимое для фотосинтетических процессов, так как удлиненные листья не будут перекрывать друг другу поток световой энергии.
Исследованные растения в асептической культуре отличались также по цвету листьев: темно-зеленые листья без хлорозов и некротических повреждений были у сорта Радуга; на латеральных краях листовых пластин у сортов Фестивальная и Лань отмечена темно-красная пигментация.
Листовые пластинки у розы эфиромаслич-ной in vitro бифациального типа, имеют как общие, так и специфические анатомические характеристики. Листья тонкие, средняя их толщина составляет от 79,30 ± 9,35 мкм (сорт Лань) до 121,52 ± 19,69 мкм (сорт Радуга). Общими для всех исследованных образцов являются: однослойный верхний и нижний эпидермис, гипостоматический тип листа (устьица располагаются на адаксиальной стороне), усть-ичные аппараты аномоцитного типа. Клетки верхнего эпидермиса крупнее, чем нижнего, имеют неправильную извилистую форму. Кути-кулярный слой и железистые волоски отсутствуют. Благодаря анализу слепков покровных тканей листьев, сделанных сразу после открытия культуральных сосудов, видно, что большая часть устьиц находится в открытом состоянии, так как в условиях in vitro постоянно поддерживается высокий уровень относительной влажности (более 90%), температура и освещенность не подвержены перепадам, поскольку растения находятся в контролируемых условиях. Толщина адаксиальной эпидермы или рав-
Таблица 1
Морфологические показатели микропобегов и листьев розы
эфиромасличной во время культивирования in vitro_
Сорт Высота растений, мм Количество листьев на микропобеге, шт. (M ± m) Ширина простого листа, мм (M ± m) Длина простого листа, мм (M ± m) Индекс формы листа
Радуга 24-32 6 ± 2 4,3 ± 0,3 6,3 ± 0,4 0,68
Фестивальная 35-38 6 ± 2 4,4 ± 0,2 6,7 ± 0,3 0,65
Лань 36-42 7 ± 2 6,3 ± 0,5 8,7 ± 0,5 0,73
Таблица 2
Количественные показатели анатомической структуры листьев некоторых сортов розы _эфиромасличной, культивируемых в условиях in vitro (M ± m, мкм)_
Показатели анатомической структуры/ Сорта Радуга Фестивальная Лань
Толщина листовой пластины Толщина адаксиальной эпидермы 121,52 ± 19,69 13,70 ± 1,24 107,69 ± 4,22* 12,56 ± 0,60 79,30 ± 9,35* 11,83 ± 0,51
Толщина мезофилла Палисадного Губчатого 34,58 ± 8,28 57,28 ± 12,83 37,24 ± 4,55* 38,09 ± 4,69 20,11 ± 3,11* 36,03 ± 5,43
Коэффициент палисадности Толщина абаксиальной эпидермы 0,37 15,89 ± 1,19* 0,50 12,01 ± 0,78* 0,36 9,85 ± 0,97*
Показатели анатомического строения эпидермиса листовых пластин
Верхний эпидермис Высота клеток Ширина клеток 27,96 ± 1,93 18,48 ± 1,78 27,52 ± 2,80 16,56 ± 1,53 20,80 ± 2,87 19,16 ± 1,94
Нижний эпидермис Высота клеток Ширина клеток 20,20 ± 1,74 16,76 ± 0,91 30,41 ± 6,29 15,20 ± 1,88 27,01 ± 4,94 22,99 ± 6,72
Размер устьичной щели (длинахширина) Количество устьиц на 1 мм2 поверхности 19,17 х 4,66 87,78 ± 15,50 20,14 х 7,24 79,82 ± 4,00 19,00 х 7,94 76,61 ± 5,63
Установлено достоверное различие при Р = 0,95.
на, или немного превышает толщину абакси-альной (табл. 2).
Под эпидермой располагается мезофилл, который дифференцирован на палисадную и губчатую ткань. Не смотря на то, что хлоренхи-ма билатеральная, клетки расположенырыхло. На срезах видны большие воздухоносные полости, особенно их локализация отмечена в губчатой паренхиме.
Палисадный мезофилл образован одним (редко двумя) слоями цилиндрических клеток, расположенных более плотно, чем в губчатом слое. Высота палисадного слоя составляет от 20,11 ± 3,11 до 37,24 ± 4,55 мкм. Интегральный уровень фотосинтетической активности листа конкретного генотипа характеризуется пластид-ным аппаратом благодаря подсчету хлоропла-стов в клетках мезофилла [14]. Расположение хлоропластов - диффузное или пристенное, форма овальная. Анализируя количественные показатели хлоренхимы листьев, нами подсчитано среднее количество хлоропластов в одной клетке палисады. По данному показателю достоверные различия наблюдались между сортами Радуга и Фестивальная (9,62 и 8,56 шт./кл. соответственно) и сортом Лань (8,0 шт./кл.). Так как количество хлоропластов в клетке формирует потенциал фотосинтеза, более высокое содержание пластид можно рассматривать, как признак мощной фотосинтетической системы, обеспечивающий значительную продуктивность данному генотипу.
Губчатый мезофилл изученных сортов розы эфиромасличной состоит из двух-трех слоев клеток, межклетники довольно большие. Клетки вытянутой или округлой формы, расположены горизонтально, внутри клеток заметна ориентация хлоропластов к адаксиальной стороне.
Толщина губчатой паренхимы у всех сортов превышает толщину палисады. У сорта Лань, не смотря на меньшую толщину губчатого слоя, клетки расположены более компактно, и количество слоев достигает 4-х. Установлены также достоверные различия в топографическом распределении ассимилирующей ткани листовых пластин. Особенно это касается толщины палисадного мезофилла: одно-двурядная палисада листьев сорта Фестивальная - 37,24 ± 4,55 мкм обеспечивает максимальное значение коэффициента палисадности (0,50), который представляет отношение толщины палисады к общему мезофиллу.
Главная жилка листа представляет собой закрытый коллатеральный пучок. Сосуды ксилемы располагаются правильными рядами, окружены механической и паренхимной обкладками, у сорта Радуга и Фестивальная сверху и снизу пучка видны зачатки угловой колленхимы. Устьица мелкие, их длина составляет 19,0020,14 мкм. Результаты подсчетов устьиц на единицу площади (1 мм2) не показали наличия достоверных различий между сортами, однако наибольшее количество устьиц отмечено у сорта Радуга (87,78 ± 15,50 устьиц/мм2). Большое количество объектов in vitro имеют недоразвитые устьичные аппараты. По мнению ряда ученых [18,22], их работа в условиях асептической культуры несовершенна в силу нарушения механизма в их открытии и закрытии. Однако стоит изменить условия культивирования, как последует реакция устьиц механизмом закрытия [23]. Таким образом, меньшее количество устьиц с одной стороны может свидетельствовать о меньшей испаряемости воды листьями, а с другой - о низкой способности регулировать транспирацию при возникновении гидротерми-
О
а
о
I-
о
m
4 о m
о m
I-
о ф
т
5
ц
о ы
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1
2
3
□ Общее количество воды,%
□ Количество менее упорядоченой воды, % от сырого веса листьев
□ Количество упорядоченой воды,%
Рис. 5. Анализ фракционного состава воды сортов розы эфиромасличной: 1 - Радуга; 2 - Фестивальная; 3 - Лань
ческого и светового стрессов, который может быть спровоцирован адаптацией регенерантов к условиям in vivo.
Относительная оводненность тканей листа довольно высокая: от 82,50 до 88,89% воды к сырому весу (рис. 5). Так как поведение воды в клетке определяется не количеством, а активностью и ее термодинамическим состоянием [15], нами изучен ее фракционный состав в культивируемых растениях. На долю относительно свободной воды (капиллярной и осмотически-поглощенной) приходится 25,6436,45% от ее общего содержания. Однако в транспорте воды через мембрану большую роль играет гидратная вода. При положительной гидратации растворенные вещества ограничивают подвижность воды, а при отрицательном - усиливают [15]. Соответственно на долю фракции воды, упорядоченной низко- и высокомолекулярными соединениями, приходится 63,55-74,36% от общего содержания. Большей водоудерживающей способностью отличается сорт Радуга.
Известно, что фотосинтез, как основной жизненный процесс экологически очень лабильный [1,14]. В результате адаптационной деятельности растений к условиям культивиро-
вания достигается необходимая интенсивность продуктивного процесса [24]. С количественными показателями пластидного аппарата, описанного выше, тесно связана фотосинтетическая активность, определяемая методом индукции флуоресценции хлорофилла (ИФХ) по анализу кривой Каутского.
В табл. 3 представлены значения основных параметров флуоресценции изученных растений. Рост флуоресцентного сигнала от F0 до Fm отражается в значениях переменной флуоресценции По ее отношению к максимальному уровню можно судить о фотоингибировании на уровне светособирающих комплексов фотосистемы 2. Значения данного показателя у изученных сортов находятся в пределах нормы (от 0,53 отн. ед. у сорта Лань до 0,68 - у сорта Радуга). По мнению ряда авторов [6,10,23] существует связь между кинетикой иФх и фотосинтетической ассимиляцией углекислоты, благодаря чему фотосинтетическая активность может быть оценена при помощи выражения ^ - Fst) / Fm. В норме ее величина составляет 0,6 и выше, при патологиях различного происхождения снижается пропорционально ослаблению фотосинтетической функции [6]. Этот показатель в норме у сорта Лань и несколько занижен у сортов
Таблица 3
Параметры индукции флуоресценции хлорофилла листьев у регенерантов _розы эфиромасличной, культивируемых в условиях in vitro_
Сорт Fo Fm Fst Fv ФА Fm/Fst Fv/Fm
Радуга 224 696 336 472 0,52 2,07 0,68
Фестивальная 208 672 328 464 0,51 2,05 0,69
Лань 336 720 280 384 0,61 2,57 0,53
Радуга и Фестивальная. Индекс жизнеспособности - Fm / Fst составил 2,05-2,57 отн. ед. Все эти данные свидетельствуют о нормальном функциональном состоянии фотосинтетических аппаратов изученных сортов розы в условиях in vitro.
Исследования пигментного комплекса у разных генотипов розы эфиромасличной позволяет определить степень изменчивости и устойчивости фотосинтетического аппарата и факторы, активизирующие его работу, а именно - специфический состав среды и сроки культивирования. Такой подход дает возможность установить зависимость между анатомическими и физиологическими показателями, а также составить характеристику соответствующих реакций на влияние экзо-и эндогенных факторов. Это позволяет разработать физиологические основы оптимизации работы фотосинтетического аппарата, которые возможно смоделировать в условиях теплиц при адаптации посадочного материала из условий in vitro в in vivo и in situ.
ВЫВОДЫ
Таким образом, нами изучены морфогене-тические способности меристематических тканей 6 сортов розы эфиромасличной.
Показано, что оптимальным сроком отбора исходных эксплантов является февраль-март, при котором количество развившихся меристем в среднем достигает 92-100% и зависит от генотипа донорного растения.
Выявлен высокий морфогенетический потенциал сортов Искра и Кооператорка на начальных этапах культивирования. Продемонстрировано, что применение БАП в концентрации 1,5 мг/л индуцирует формирование в среднем от 4 до 7 листьев/микропобег у таких сортов как Радуга, Искра и Фестивальная.
Вместе с тем отмечен высокий коэффициент размножения у сорта Фестивальная (1 : 51 : 6) и у сортов Кооператорка, Радуга и Лань (1 : 4) после 2-3 субкультивирований на свежеприготовленные питательные среды и спонтанное укоренение микропобегов.
Разработаны отдельные этапы клонально-го микроразмножения безвирусных растений 6 сортов розы эфиромасличной.
Морфо-анатомические и физиологические исследования регенерантов 3 сортов розы эфиромасличной, являясь составной частью комплекса биотехнологических исследований, позволили выявить информативные структурные индикаторы адаптивности и устойчивости растений к воздействию стрессовых факторов при культивировании в условиях in vitro. Проведение сравнительного анализа морфологических параметров регенерантов (количество листьев на микропобег и индекс формы листа) позволило выделить сорт Фестивальная. По анатомическим характеристикам развитости палисадной ткани, количеству хлоропластов в клетках фотосинтезирующей ткани, развитию механической обкладки проводящего пучка также лидирует сорт Фестивальная. Вместе с тем установлено, что у данного сорта доля связанной воды от общего ее содержания в тканях листа выше по сравнению с другими сортами. Данный показатель имеет минимальное значение у сорта Радуга.
Максимальные значения интегрального показателя фотосинтетической активности и индекса жизнеспособности выявлены у регене-рантов сорта Лань.
По данным сравнительного анализа индукции флуоресценции хлорофилла а физиологическое состояние листьев всех изученных регене-рантов находится в норме.
Исследования выполнены при поддержке гранта Российского научного фонда № 14-50-00079.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Байрон О.В., Корнеев Д.Ю., Снегур О.О., Китаев О.И. Инструментальное изучение фотосинтетического аппарата с помощью индукции флуоресценции хлорофилла: метод. указания. Киев, 2000. 11 с.
2. Бойко А.Л. Вирусы и вирусные заболевания хмеля и розы эфиромасличной. Киев: Наукова Думка, 1976. 72 с.
3. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 272 с.
4. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учеб. пособ. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.
5. Злобин Ю.А., Скляр В.Г., Бондарева Л.М., Кирильчук К.С. Концеп^я морфометрп у сучаснш боташц // Черноморский ботанический журнал. 2009. № 5 (1). С. 5-22.
6. Иванова Л.А., Иванов Л.А., Ронжина Д.А., Пьянков В.И. Структурные параметры мезофилла листа при затенении растений разных функциональных типов // Физиология растений. 2008. Т. 55, № 2. С. 230-239.
7. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наук. думка, 1980. 488 с.
8. Кириченко Е.Б., Фернандо Ш.С., Кузь-
мина Т.А., Чернядьев И.И. Особенности органогенеза эфиромасличных роз при клональном микроразмножении // Бюлл. ГБС. 1993. Вып. 167. С. 96-102.
9. Кушниренко М.Д., Печерская С.Н. Физиология водообмена и засухоустойчивости растений. Кишинев: Штиинца, 1991. 305 с.
10. Лысенко В.С., Вардуни Т.В., Сойер В.Г., Краснов В.П. Флуоресценция хлорофилла растений как показатель экологического стресса: теоретические основы применение метода // Фундаментальные исследования. Биологические науки. 2013. № 4. С. 112-120.
11. Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур. Киев: Аграрна наука, 2011. 344 с.
12. Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Иванова Н.Н. Применение биотехнологических методов в оздоровлении растений и размножении безвирусного посадочного материала перспективных цветочно-декоративных культур // Методология биотехнологических и вирусологических исследований ценных многолетних культур: Сб. науч. трудов ГНБС. 2014. Т. 138. С. 5-56.
13. Митрофанова О.В., Михайлов А.П., Чехов А.В. Биотехнологические аспекты освобождения от вирусов и клональное микроразмножение некоторых экономически важных многолетних культур // Биотехнологические исследования садовых и других ценных многолетних культур: Сб. науч. трудов ГНБС. 1997. Т. 119. С. 7-34.
14. Мокроносов А.Т., Шмакова Т.В. Сравнительный анализ мезоструктуры фотосинтетического аппарата у мезофитных и ксерофитных растений // Мезоструктура и функциональная активность фотосинтетического аппарата. Свердловск: УрГУ, 1978. С. 103-107.
15. Сулейманов И.Г. Состояние воды и
водный обмен у культурных растений. М.: Наука, 1971. С. 256-261.
16. Физиология растений: учебник для студ. вузов / Н.Д. Алехина, Ю.В. Балнокин, В.Ф. Гавриленко, Т.В. Жигалова, Н.Р. Мейчик, А.М. Носов, О.Г. Полесская, Е.В. Харитонашвили, В.В. Чуб; под ред. И.П. Ермакова. - 2-е изд., испр. М.: Издательский центр «Академия», 2007. 640 с.
17. Baig M.M.Q., Hafiz I. A., Hussain A., Ahmad T., Abbasi N.A. An efficient protocol for in vitro propagation of Rosa gruss an teplitz and Rosa centifolia // African J. Biotechnology. 2011. Vol. 10 (22). P. 4564-4573. doi: 10.5897/ajb10.2051
18. Bunning E., Sagromsky H. Die Bildung des Spaltoffnungs musters in der Blattepidermis // Z. Naturf. 1948. Vol. 36. P. 203-216.
19. Elavazhagan T., Arunachalam K.D. In vitro callus induction and shoot multiplication from nodal explants and leaves of Memecylon edule // Asian J. Biotechnol. 2010. Vol. 2. P. 110-119.
20. Kyte L. Plant from test tubes. An Introduction to Micropropagation. Portland: Oregon: Timber Press, 1987. 160 p.
21. Murashige T., Skoog F.A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, N 13. P. 473-493.
22. Penfound W.T. Plant anatomy as conditioned by light intensity and soil moisture // Am. J. Bot. 1931. Vol. 18. P. 558-572.
23. Smith M.A., Palta J.P., McCown B.H. Comparative Anatomy and Physiology of Microcultured, Seedling and Greenhouse grown Asian White Birch // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1986. Vol. 111, N 3. P. 437-442.
24. Stirbet A. and Govindjee. On the relation between the Kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and Photosystem II: Basics and applications of the OJIP fluorescence transient // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2011. Vol. 104, N 1-2. P. 236-257. doi:10.1016/j.jphotobiol.2010.12.010.
1. Bairon O.V., Korneev D.Yu., Snegur O.O., Kitaev O.I. Instrumental'noe izuchenie fotosinte-ticheskogo apparata s pomoshch'yu induktsii fluorestsentsii khlorofilla. Metodicheskie ukazaniya [Instrumental study of photosynthetic apparatus by chlorophyll fluorescence induction. Methodological guidelines]. Kiev, 2000, 11 p. (In Russ.)
2. Boiko A.L. Virusy i virusnye zabolevaniya khmelya i rozy efiromaslichnoi [Virus and virus disease of hope and essential-oil rose]. Kiev, Naukova Dumka Publ., 1976, 72 p. (In Russ.)
3. Butenko R.G. Kul'tura izolirovannykh tkanei i fiziologiya morfogeneza rastenii [Culture of isolated tissues and physiology of plant morphogenesis].
Moscow, Nauka Publ., 1964, 272 p.
4. Butenko R.G. Biologiya kletok vysshikh rastenii in vitro i biotekhnologii na ikh osnove. Uchebnoe posobie [Cell biology of higher plants in vitro and biotechnology on their base. Training manual]. Moscow, FBK-PRESS Publ., 1999, 160 p.
5. Zlobin Yu.A., Sklyar V.G., Bondareva L.M., Kiril'chuk K.S. Kontseptsiya morfometriï u suchasnii botanitsi [Morphometric conception at modern botany]. Chernomors'kii botanicheskii zhurnal - Chorno-morski Botanical Journal, 2009, no. 5(1), pp. 5-22. (In Russ.)
6. Ivanova L.A., Ivanov L.A., Ronzhina D.A., P'yankov V.I. Strukturnye parametry mezofilla lista pri
zatenenii rastenii raznykh funktsional'nykh tipov [Structural parameters of leaf mesophyll under shading of plants with different functional types]. Fiziologiya rastenii - Russian Journal of Plant Physiology, 2008. vol. 55, no. 2, pp. 230-239.
7. Kalinin F.L., Sarnatskaya V.V., Polishchuk V.E. Metody kul'tury tkanei v fiziologii i biokhimii rastenii [Methods of tissue culture in plant physiology and biochemistry]. Kiev, Naukova dumka Publ.,1980, 488 p. (in Russ.)
8. Kirichenko E.B., Fernando Sh.S., Kuz'mina T.A., Chernyad'ev I.I. Osobennosti organogeneza efiromaslichnykh roz pri klonal'nom mikrorazmnozhenii [Features of essential-oil roses organogenesis during clonal micropropagation]. Byulleten' GBS - Bulletin of the Main Botanical Garden, 1993, no. 167. pp. 96-102.
9. Kushnirenko M.D., Pecherskaya S.N. Fiziologiya vodoobmena i zasukhoustoichivosti rastenii [Physiology of plants water exchange and drought resistance]. Kishinev, Shtiintsa Publ., 1991, 305 p. (In Russ.)
10. Lysenko V.S., Varduni T.V., Soier V.G., Krasnov V.P. Fluorestsentsiya khlorofilla rastenii kak pokazatel' ekologicheskogo stressa: teoreticheskie osnovy primeneniya metoda [The fluorescence of plants chlorophyll as an indicator of environmental stress: the theoretical foundations of method using]. Fundamental'nye issledovaniya. Biologicheskie nauki - Fundamental Research. Biological Science, 2013, no. 4, pp. 112-120.
11. Mitrofanova I.V. Somaticheskii embrioge-nez i organogenez kak osnova biotekhnologii polucheniya i sokhraneniya mnogoletnikh sadovykh kultur [Somatic embryogenesis and organogenesis as a base of biotechnology of perennial horticultural plants obtaining and conservation]. Kiev, Agrarna nauka Publ., 2011, 344 p. (In Russ.)
12. Mitrofanova O.V., Mitrofanova I.V., Lesnikova-Sedoshenko N.P., Ivanova N.N. Prime-nenie biotekhnologicheskikh metodov v ozdorovlenii rastenii i razmnozhenii bezvirusnogo posadochnogo materiala perspektivnykh tsvetochno-dekorativnykh kul'tur [Using of biotechnology methods for plants improvement and propagation of virus-free planting material of perspective ornamental plants]. In: Metodologiya biotekhnologicheskikh i virusologi-cheskikh issledovanii tsennyh mnogoletnikh kul'tur: Sb. nauch. trudov GNBS [Methodology of biotechno-logical and virological investigations in valuable perennial plants: Works of the State Nikitsky Botanical Garden], 2014, vol. 138, pp. 5-56.
13. Mitrofanova O.V., Mikhailov A.P., Chekhov A.V. Biotekhnologicheskie aspekty osvobozhdeniya ot virusov i klonal'noe mikrorazmnozhenie nekotorykh ekonomicheski vazhnykh mnogoletnikh kultur [Biotechnology aspects of elimination of viruses and clonal micropropagation in some economically im-
portant perennial crops]. In: Biotekhnologicheskie issledovaniya sadovykh i drugikh tsennykh mnogoletnikh kultur: Sb. nauch. trudov GNBS [Biotechnology researches of horticultural and other valuable perennial cultures. Works of the State Nikitsky Botanical Garden]. 1997, vol. 119, pp. 7-34.
14. Mokronosov A.T., Shmakova T.V. Sravnitel'nyi analiz mezostruktury fotosinteticheskogo apparata u mezofitnykh i kserofitnykh rastenii [Comparative analysis of the mesostructure of the photosynthetic apparatus in mesophytic and xerophytic plants]. In: Mezostruktura i funktsio-nal'naya aktivnost' fotosinteticheskogo apparata [Mesostructure and functional activity of the photosynthetic apparatus]. Sverdlovsk, Ural State University Publ., 1978, pp. 103-107.
15. Suleimanov I.G. Sostoyanie vody i vodnyi obmen u kul'turnykh rastenii [Status of water and water metabolism in cultivated plants]. Moscow, Nauka Publ., 1971, pp. 256-261.
16. Alekhina N.D., Balnokin Yu.V., Gavrilenko V.F., Zhigalova T.V., Meichik N.R., Nosov A.M., Polesskaya O.G., Haritonashvili E.V., Chub V.V. Fiziologiya rastenii: uchebnik dlya stud. vuzov [Plant physiology: manual for university students]. Under the editorship of I.P. Ermakova. Second publ. correct. Moscow, Akademiya Publ., 2007, 640 p.
17. Baig M.M.Q., Hafiz I. A., Hussain A., Ahmad T., Abbasi N.A. An efficient protocol for in vitro propagation of Rosa gruss an teplitz and Rosa centifolia. African J. Biotechnology, 2011, vol. 10 (22), pp. 4564-4573. doi: 10.5897/ajb10.2051
18. Bunning E., Sagromsky H. Die Bildung des Spaltoffnungs musters in der Blattepidermis. Z. Naturf., 1948, vol. 36, pp. 203-216.
19. Elavazhagan T., Arunachalam K.D. In vitro callus induction and shoot multiplication from nodal explants and leaves of Memecylon edule. Asian J. Biotechnol., 2010, vol. 2, no. 2, pp. 110-119. doi: 10.3923/ajbkr.2010.110.119
20. Kyte L. Plant from test tubes. An Introduction to Micropropagation. Portland: Oregon, Timber Press, 1987, 160 p.
21. Murashige T., Skoog F.A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant., 1962, vol. 15, no. 13, pp. 473-493.
22. Penfound W.T. Plant anatomy as conditioned by light intensity and soil moisture. Am. J. Bot., 1931, vol. 18, pp. 558-572.
23. Smith M.A., Palta J.P., McCown B.H. Comparative Anatomy and Physiology of Microcultured, Seedling and Greenhouse grown Asian White Birch. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 1986, vol. 111, no. 3, pp. 437-442.
24. Stirbet, A. and Govindjee. On the relation between the Kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and Photosystem II: Basics and ap-
plications of the OJIP fluorescence transient. J. 2, pp. 236-257. doi:10.1016/j.jphotobiol.2010.12.010. Photochem. Photobiol. B: Biol., 2011, vol. 104, no. 1-
Поступила в редакцию 2 апреля 2015 г. После переработки 17 апреля 2015 г.
