CC BY
64
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЗАКОНОМЕРНОСТЬ ПОТЕНЦИРОВАНИЯ ИММУНОГЕННОЙ И ПРОТЕКТИВНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНАТОКСИН-ВАКЦИН
Д.А. Евглевский, А.О. Павленко, К.В. Татарников, С.А. Федосова, Д.И. Шахов
Аннотация. Научно-практически и биотехнологически обосновано повышение эффективности туберкулезного анатоксина, стафило-стрептококковой, стафи-ло-протейносинегнойной и колисальмонеллезной анатоксин-вакцины.
Ключевые слова: анатоксин-вакцина, стафилококки, стрептококки, E.coli, сальмонеллы.
Инфекционные болезни занимают особое место среди всех заболеваний животных и человека, несмотря на создание и применение эффективных диагностических, иммунопрофилактических биопрепаратов и лекарственных средств.
В структуре инфекционных болезней крупного рогатого скота первое место занимает лейкоз (40-60%), второе туберкулез (18-25%), а среди молодняка превалирует колидиарея-колибактериоз, сальмонеллез поросят, телят, птиц и стафило-стрептококковая инфекция (Рахманов А.М., Яременко Н.А., 2003).
Повышение протективной, иммуногенной активности анатоксинов и анатоксин-вакцин зависит от качества синтетических питательных сред для выращивания микроорганизмов вместо мясопептонного бульона с глицерином, средств, режима детоксикации, полимеризации токсинов, инактивации (обезвреживания) бактерий и вирусов.
В настоящее время производство стафилококковой, колисальмонеллезной и синегнойной анатоксин-вакцин основано на выращивании микроорганизмов на мясо-пептонном бульоне с глицерином с последующей детоксикацией токсинов 0,3-1,0% раствором формальдегида, который впервые был использован в 1923 г. для изготовления столбнячного и дифтерийного анатоксинов ветврачом и известным ученым французом Г. Рамоном.
В сообщении Покровского В.И. (1999г.) и Воробьева А.А. (1999 г.) указывается, что полная детоксикация, полимеризация и стабилизация стафилококкового токсина обеспечивается раствором этония, а не формальдегидом. Однако использование этония или других бисчетвертичных аммониевых соединений для детоксикации и полимеризации токсинов пока не имеет практического применения в биопромышленности.
Вышеизложенное определило актуальность и направления исследований.
Объектом исследования служили свежевыделенные и лабораторные культуры стафилококков, сальмонелл, кишечной палочки (E.coli) и микобактерии туберкулеза, синтетические питательные среды для их выращивания и получения экзо-, эндо- и супертоксино-аллергенов для получения анатоксин-вакцин.
Первоначальным этапом была разработка состава синтетической питательной среды. Проведенные исследования определили целесообразность одновременного использования в питательной среде лимонной и янтарной кислот и возможность снижения концентрации дорогостоящих и дефицитных аспарагина, цитрата аммония, глицина до 2-3г/л, при увеличении содержания сернокислого цинка до 0,3-0,5 г/л для образования биопленки микроорганизмов. Для выращивания стафилококков реакцию среды устанавливали 5-10% до слабощелочной рН-7,5-7,6 и увеличение хлористого натрия до 5-6 г/л.
Синтетическая среда не изменяла свои свойства как при последовательном растворении, так и после предварительного смешивания в сухом виде лимонной и
янтарной кислот, цитрата аммония, форфорнокислого 2-х замещенного натрия и калия, аспарагина, глицина, сернокислого железа, цинка, магния, хлористого натрия.
Жидкая синтетическая среда в разведении 1:1и 1:2 с 2,5% агаром с успехом использована вместо мясопеп-тонного агара для выделения стафилококков, сальмонелл, кишечной палочки и микобактерий туберкулеза после обработки патматериала 2-3% раствором лимонной и янтарной кислот взамен серной кислоты и едкого натрия.
Результаты роста и накопления микроорганизмов на синтетической среде в 2-х литровых биобутылях с объемом среды, равным 1 литру, представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Накопление бактериальной массы при
Из данных, представленных в таблице 1, следует, что накопление туберкулеза в 2-х литровых биобутылях с объемом среды, равным 1 литру, после двухмесячного выращивания и автоклавирования в отжатом виде через несколько слоев марли составляет 125±5,0 г, а концентрация стафилококков после 12-15-суточного выращивания достигает 10-12миллиардов в 1 мл, сальмонелл и кишечной палочки после 2-3х дневного выращивания составляет 65-70 миллиардов микробных клеток в 1 мл.
В дальнейшем установлено, что выделенные стафилококки, сальмонеллы и (E.coli) от павших животных в зоне железногорского комбината и после электромагнитного воздействия, а также в пищевых продуктах проявляли повышенную устойчивость на 1,0-1,5 минуты к температуре, дезинфицирующим веществам и на 5-6% к энрофлоксацину, тетрациклину, гентамици-ну, амоксициллину, линко-спектину и левомицетину.
Обеспечение полной детоксикации 0,9-0,1 мг/мл растворимых стафилококковых экзо-, эндо- и супер-этертоксинов в суспензии 10-12 млрд/мл стафилококков достигается вначале 0,2-0,3% раствором глутарово-го альдегида или 0,2-0,3% раствором формальдегида при 40°С в течение 2-3 суток, а затем 0,2-0,3% раствором этония или Биопага-Д. При этом культуральная жидкость отделенная фильтрацией от бакмассы авто-клавированных стафилококков обладала иммуноген-ным, протективным и лечебным действием при утрате-аллергенных и токсичных свойств.
выращивании микроорганизмов на синтетической среде
№ п/п Наименование микроорганизмов Сроки выращивания Накопление(концентрация) микроорганизмов
1 Микобактерии туберкулеза (бычьего вида) 30 суток 60 граммов авто-клавированной и отжатой бакмассы
60 суток 120 граммов авто-клавированной и отжатой бакмассы
2 Стафилококки (золотистый) 7 суток 7-8 мл/мл
12 суток 12±1,0 млрд/мл
3 Сальмонеллы 2-3 суток 70±10 млрд/мл
4 Кишечная палочка 2-3 суток 70±10 млрд/мл
5 Синегнойна палочка 2-3 суток Густая слизеподобная масса
6 Сенная палочка-Baccillus subtilis 2-3 суток Густая слизеподобная масса
7 Лактобактерии 2-3 суток Густая слизеподобная масса
Полученная по вышеуказанному способу стафилококковая анатоксин-вакцина проявила лечебно -профилактические свойства при стафилококкозе птиц, дерматите и экземе плотоядных, мастите коров и вызывала сокращение сроков заживления рванных и ожоговых ран.
Способы сенсибилизации морских свинок суспензий из автоклавированных стафилококков, а затем и убитыми микобактериями туберкулеза были использованы в качестве безопасных биологических моделей аллергии для контроля процесса инактивации и детоксикации стафилококковых и туберкулезных токсино-аллергенов.
Апробированные способы и средства детоксикации и полимеризации стафилококковых токсино-аллергенов были использованы для получения стафило-стрептококковой и стафило-протейносинегнойной, ко-лисальмонеллезной анатоксин-вакцин и туберкулезного анатоксина.
Полученные биопрепараты с использованием синтетической питательной среды для выращивания микроорганизмов вместо мясогидрализатного бульона, а в качестве детоксикаторов и полимеризаторов глутаро-вый альдегид, формальдегид с этонием, Биопагом-Д и алкилдиметилбензиламмония обладали повышенной иммуногенной и протективной активностью, а стафило-стрептококковая и стафилопротейно-синегнойной анатоксин-вакцины еще и лечебным действием.
Информация об авторах
Евглевский Дмитрий Анатольевич, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник Курского НИИ АПП.
Павленко Андрей Олегович, заведующий отделом, Департамент ветеринарии Украины.
Татарников Кирилл Викторович, аспирант ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».
Федосова Светлана Юрьевна, аспирант ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».
Шахов Дмитрий Иванович, аспирант ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».
