CC BY
70
БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ УРОВНЯ ФЕРМЕНТОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА1
© Юлаев М.Ф.*, Комилов М.К.*
Самаркандский государственный медицинский институт, Республика Узбекистан, г. Самарканд
Разработаны электрохимические биосенсоры на каталазу, пероксида-зу, супероксиддисмутазу и ксантиноксидазу. Изучена кинетика ферментативных реакций и влияние различных факторов на процесс генерации сигнала биосенсоров. Разработаны два типа конструкций полярографических датчиков и проведены их испытания в биосенсорном контроле ферментов, регушрующих перекисное окисление в организме человека. Разработанные биосенсоры позволяют быстро, с высокой селективностью и чувствительностью проводить определение ферментов в микрообъемах биологических жидкостей.
Исследования выполнены в рамках гранта Комитета по координации развития науки и технологий Республики Узбекистан «Разработка биосенсоров для контроля уровня ферментов регушрующих перекисное окисление в организме человека».
В современной литературе биосенсоры для количественного определения ферментов упоминаются только в единичных публикациях [1]. В основном биосенсоры используются для определения субстратов, активаторов и ингибиторов ферментов. Данных о применении биосенсоров в клинической практике для определения каталазы, пероксидазы, суперок-сиддисмутазы (СОД) и ксантиноксидазы нами не обнаружено. Известен ряд методов количественного определения этих ферментов, но все они трудоемки, сложны, требуют большого объема проб, большого количества дорогостоящих реагентов и не поддаются автоматизации [2].
Принцип действия биосенсоров заключается в прямой или медиатор-ной (с использованием переносчиков электронов) трансформации энергии ферментативной реакции в электрический сигнал. Электрохимические биосенсоры позволяют быстро, с высокой чувствительностью и селективностью проводить количественное определение различных веществ в сложных по составу биологических жидкостях [3].
В данной работе проведены экспериментальные и теоретические исследования, направленные на разработку электрохимических биосенсоров
1 Исследования выполнены в рамках гранта Комитета по координации развития науки и технологий Республики Узбекистан «Разработка биосенсоров для контроля уровня ферментов регулирующих перекисное окисление в организме человека».
* Ведущий научный сотрудник кафедры Биологической химии, кандидат химических наук.
* Младший научный сотрудник кафедры Биологической химии.
для количественного определения СОД, каталазы, пероксидазы и ксанти-ноксидазы.
Материалы и методы
В работе использованы следующие методы и подходы. Кажущиеся константы Михаэлиса находили по методу Лайнуивера-Берка. Константы ингибирования рассчитывали методом Диксона [4].
Активность СОД определяли по степени ингибирования восстановления нитро синего тетразолия (НСТ) в присутствии НАДН и феназинмета-сульфата (ФМС). Состав реакционной смеси включал 1,2 мл фосфатного буферного раствора (0,15 М, pH 7,8), 0,1 мл 0,16 мМ ФМС, 0,3 мл 0,61 мМ НСТ, 0,2 мл 1 мМ НАДН и 0,3 мл слюны. Реакцию запускали добавлением НАДН и останавливали через 1 минуту добавлением 1 мл ледяной уксусной кислоты. Фотометрировали при длине волны 540 нм [5].
Активность каталазы определяли по скорости разложения перекиси водорода в реакционной среде, содержащей 1,9 мл фосфатного буфера (0,05 М, pH 8,0), 1 мл 30 мкМ перекись водорода и 0,1 мл пробы. Измеряли снижение оптической плотности в течение 1 минуты при длине волны 240 нм. Активность выражали как константу скорости реакции первого порядка [6].
Для получения эритроцитов кровь брали из вены натощак в количестве 1 мл в пробирку с 0,1 мл 3,8 % цитрата натрия и 1 мг ЭДТА. Эритроциты отмывали в физиологическом растворе. Для определения активности ферментов использовали гемолизат. Активность рассчитывали на 1 мг гемоглобина. Концентрацию гемоглобина находили по методу [7].
Слюну собирали в течении 10 минут натощак и после стимуляции 2 % лимонной кислотой, центрифугировали 15 мин при 3000 g. Для биохимических исследований использовали супернатант [8].
Активность пероксидазы определяли фотометрически, по скорости окисления о-фенилендиамина перекисью водорода [9].
В ходе определения активности ксантиноксидазы, в пробирку последовательно добавляли 2,6 мл раствора карбоната натрия, 0,1 мл раствора ЭДТА и
0,2 мл раствора нитротетразолевого синего. В опытную пробу добавляли
0,1 мл ксантина. Сыворотку добавляли в реакционную смесь непосредственно перед измерением. Измерение проводили на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 560 нм в течении 1 минуты. Разница ме^ду исследуемой и контрольной пробой является показателем активности ксантиноксидазы [10].
Исследования с электрохимическими биосенсорами выполняли на полярографе ИНТ-1, с использованием 2-х и 3-х электродных датчиков собственной конструкции.
Электрохимический биосенсор на каталазу: трехэлектродный полярографический датчик включающий графитовый рабочий, платиновый вспомогательный и хлорсеребрянный электрод сравнения, Объем рабочей ячейки 0,4 мл. Необходимый объем пробы крови 0,005мл, слюны 0,02 мл.
Электрохимический биосенсор на пероксидазу: проточно-инжекцион-ный двухэлектродный амперометрический датчик включающий рабочий проволочный платиновый электрод и хлоридсеребрянный вспомогательный электрод. Объем рабочей ячейки 0,05мл, Необходимый объем пробы крови 0,001 мл.
Электрохимический биосенсор на супероксиддисмутазу и ксантинок-сидазу: трехэлектродный полярогряфический датчик перекиси водорода включающий золотой рабочий электрод, платиновый вспомогательный электрод и хлоридсеребрянный электрод сравнения. Объем рабочей ячейки 0,2 мл. Необходимый объем пробы крови 0,03 мл.
Результаты и обсуждение
1. Разработка и исследование электрохимических биосенсоров на каталазу, пероксидазу и супероксиддисмутазу
В организме человека существует ферментная антиоксидантная система, включающая три наиболее важных фермента: каталазу, пероксидазу и СОД. Причем ключевым ферментом этой системы является СОД. Она катализирует реакцию ферментативной диссмутации супероксидного анион радикала:
Можно предположить, что в эритроцитах существует единая ферментная система: оксидоредукгазы акцептируют ионы водорода от метаболитов глюкозы и переносят его на супероксидный анион, из которого СОД синтезирует перекись водорода, каталаза и пероксидаза разлагают ее, а образующийся молекулярный кислород легче взаимодействует с гемоглобином, чем атомарный. Эту систему следует рассматривать не только как механизм для устранения перекисных радикалов, образующихся при метаболизме эритроцитов, но и как механизм, облегчающий оксигенацию гемоглобина.
При этом особое значение уделяется ферменту СОД, предназначение которой заключается в нейтрализации супероксидных анионов и преобразование их в перекись водорода, менее токсичное соединение. В эритроцитах СОД тормозит процесс окисления гемоглобина в метгемоглобин и предотвращает лизис эритроцитарных мембран вследствии ускорения пе-рекисного окисления липидов.
Дальнейший метаболизм перекиси водорода связан с ферментами ка-талазой и пероксидазой, поскольку накопление данного метаболита в организме является источником образования еще белее агрессивных радикалов в виде гидроперекисей и синглетного кислорода, в связи с чем в организме может сформироваться система утилизации перекиси водорода, в котором ведущая роль принадлежит ферментам каталазе и пероксидазе, которые разрушают перекись водорода до воды и кислорода (каталаза) или
вовлекают данный метаболит в процесс биоорганического окисления, в частности в системе фагоцитоза. Помимо этого каталаза может неспецифически стимулировать распад гидроперекисей липидов собственным негеммовым железом, а не только препятствовать образованию радикалов ОН, путем метаболического удаления перекиси водорода
Таким образом, так или иначе, все изучаемые ферменты катализируют реакции с участием перекиси водорода.
Наиболее оптимальным путем при разработке электрохимических биосенсоров, на наш взгляд, является использование принципов электрохимической детекции основанных на прямой или медиаторной регистрации перекиси водорода, участвующей во всех вышеуказанных ферментативных реакциях.
Показано, что полярографический датчик перекиси водорода имеет определенные преимущества, связанные с прямой регистрацией определяемого вещества, линейной зависимостью величины генерируемого тока от концентрации и слабым влиянием компонентов биосред.
Предел обнаружения перекиси водорода составляет 10-5 М, коэффициент вариации не превышает 4,5 %. Компоненты крови не оказывают влияния на аналитический сигнал при ее разведении 1/50 и выше.
Более высокой чувствительности удалось добиться, используя медиаторы - переносчики электронов от определяемого вещества к электродной поверх -ности. Разработанный нами проточно-инжекционный амперометрический датчик на йод позволяет проводить количественной определение перекиси водорода в интервале концентраций Г10-6-110-3 М. Компоненты сыворотки крови не влияют на процесс определения при ее разведении 1/500 и выше.
Одной из проблем, при разработке биосенсоров, являлось разделение мест реакций каждого из этих ферментов и их селективное определение в одной пробе.
Для решения этой проблемы мы использовали следующие подходы :
- выбор условий проведения реакций (pH, концентрации субстратов);
- использование медиаторов - переносчиков электронов от фермента на электрод;
- ингибирование мешающих определению ферментов;
- выбор селективной электрохимической системы детекции.
Было изучено влияние pH, ионной силы растворов электролита, природы медиаторов и ингибиторов на скорость ферментативных реакций и на процесс генерации электрического сигнала биосенсоров. Также определены кинетические константы и константы ингибирования для всех ферментов (табл. 1).
Показано, что до максимальной концентрации перекиси водорода (0,01 М) зависимость скорости каталазной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михуэлиса-Мэнтен, из спрямления кото-
рого в координатах Лайнуивера-Берка определяли Км, которая равна 0,009 М, что хорошо согласуется с литературными данными [9].
Таблица 1
Кинетические константы ферментов
Фермент Константа Михаэлиса Км, мМ Константа ингибирования КІ, мМ
Ингибитор
NN3 №2803 KCN
Пероксидаза 0,2 0,4 30 0,04
Каталаза 9 0,06 10 0,06
сод 0,002 0,04 10 0,06
Показано, что каталаза проявляет максимальную активность в интервале pH 7,5-8,5. Активность СОД в реакции дисмутации пероксидных радикалов, образующихся при взаимодействии феназинметасульфата с НАДН2, мало зависит от pH в интервале 5,0-9,5, но при pH 10,0 резко снижается. Пероксидаза катализирует реакцию между перекисью водорода и йодидом калия с образованием молекулярного йода с высокой скоростью в интервале pH 3,0-7,0.
Активность каталазы при pH 4,5 снижается в 800 раз. Таким образом, селективное определение пероксидазы в присутствии каталазы возможно при pH 4,5 и ниже.
Поскольку СОД и каталаза имеют близкий pH - оптимум, возможно, их взаимное мешающее влияние при количественном определении по уровню выделения или потребления перекиси водорода.
Показано, что влияние СОД и пероксидазы на селективное количественное определение каталазы в биологических жидкостях можно устранить, используя высокие концентрации субстрата - перекиси водорода, так как избыток перекиси ингибирует действие СОД и пероксидазы, не влияя на активность каталазы.
Так как при анализе СОД по наработке перекиси водорода в ходе дисмутации супероксидных радикалов, возможно мешающее влияние каталазы, которая разрушает образующуюся перекись водорода, нами изучена возможность инактивации каталазы с сохранением активности СОД. Из литературы известно, что наиболее сильными ингибиторами каталазной реакции являются цианиды, сульфиты и азиды. Однако, они одновременно являются и сильными ингибиторами СОД (табл. 1).
Другой путь: отделение СОД от каталазы методом ионообменной хроматографии - является слишком сложным и трудоемким.
Наиболее перспективный путь - это повышение чувствительности СОД-биосенсора. Поскольку, как нами было показано, Км каталазной реакции составляет 9 мМ, при более низких концентрациях перекиси водорода скорость ферментативной реакции резко снижается. В то время как фер-
ментативная дисмутация супероксидных радикалов идет при их концентрации на уровне 0,001 мМ. Активность же каталазы при концентрации перекиси 0,01 мМ снижается в 1200 раз по сравнению с максимальной.
Повысив чувствительность детекции перекиси водорода до 0,001 мМ нам удалось избежать мешающего влияние каталазы при определении СОД при помощи биосенсора.
При конструировании электрохимических биосенсоров были решены проблемы принципов детекции и конструкции электрохимических ячеек. Для всех трех биосенсоров были выбраны полярографические датчики.
Конструкция датчиков разработана таким образом, что они позволяют быстро (время измерения от 20с до 5 мин) проводить измерения в микрообъемах жидкостей (объем пробы 0,001-0,05 мл).
На основании теоретических и экспериментальных исследований нами разработаны биосенсоры на каталазу, пероксидазу и СОД. Разработанные биосенсоры позволяют быстро, с высокой селективностью и чувствительностью проводить определение ферментов в микрообъемах (0,02 мл) биологических жидкостей (кровь, слюна).
В настоящее время в физиологии и патологии большое значение придается сложной системе антиоксидантной защиты организма, которая представлены ферментными и неферментными компонентами.
Уровень ферментов антиоксидантной защиты может значительно отклонятся от нормы при бронхо-легочных, воспалительных заболеваниях, гипоксии, некоторых видах анемии. Контроль и количественное определение ферментов, регулирующих перекисное окисление в организме человека, позволяет судить о степени тяжести заболевания, а также прогнозировать и контролировать ход заболевания и лечения.
Электрохимические биосенсоры испытаны при определении ферментов в крови новорожденных с диагнозами пневмопатия и внутриутробная гипоксия мозга. Показано достоверное снижение уровня ферментов «защиты» - пероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы у новорожденных с диагнозом пневмопатия на 20-30 % по сравнению со здоровыми новорожденными. У новорожденных с диагнозом внутриутробная гипоксия мозга уровень ферментов снижается в 2-2,5 раза.
У детей в период разгара клинических проявлений пневмонии статистически достоверно снижается активность ферментов каталазы и пероксидазы по отношению к нормативным показателям. При улучшении состояния детей активности ферментов повышаются.
Ингибирование активности антиперекисных ферментов и снижение их содержания в крови пропорциональны тяжести нарушения различных систем гомеостаза.
Таким образом, количественное определение ферментов СОД, пероксидазы и каталазы является важным показателем, и может помочь в раскрытии механизмов заболеваний, а также в ходе контроля течения заболевания.
2. Разработка принципов биосенсорного контроля ксантиноксидазы
Ксантиноксидаза - сложный молибденофлавопротеин, является ферментом, который восстанавливается ксантином с образованием мочевой кислоты в качестве продукта реакции и окисляется молекулой кислорода с образованием пероксидного аниона. Фермент, таким образом, в естественных условиях, имеет возможность быстро восстанавливать равновесие между двумя своими активными центрами, которое, однако при патологических состояниях довольно часто нарушается, усугубляя патологические процессы, особенно связанные с резким усилением перекисного окисления в организме.
Поэтому разработка доступного диагностического метода определения активности ксантиноксидазы является важным для оценки тяжести патологических проявлений. Высокая активность ксантиноксидазы косвенно свидетельствует о наличии мембранно-деструктивного процесса в организме.
Для определения активности ксантиноксидазы использовали метод, основанный на определении количества отщепленного от субстрата ксан-тиноксидазой водорода по цветной реакции с нитротетразолевым синим. При этом образуется окрашенный продукт реакции - диформазан. Ксантиноксидаза сыворотки или плазмы крови предварительно активируется в термостате в течении не менее 1 часа (до 24 часов) при температуре 37 °С.
В ходе определения в пробирку последовательно добавляли 2,6 мл раствора карбоната натрия, 0,1 мл раствора ЭДТА и 0,2 мл раствора нит-ротетразолевого синего. В опытную пробу добавляли 0,1 мл ксантина. Сыворотку добавляли в реакционную смесь непосредственно перед измерением. Измерение проводили на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 560 нм в течении 1 минуты. Разница между исследуемой и контрольной пробой является показателем активности ксантиноксидазы.
Изучение кинетики ферментативной реакции показало, что ксантиноксидаза с наибольшей скоростью катализирует реакцию окисления ксантина до мочевой кислоты при pH 8,0-8,5. Константа Михаэлиса равна 4105 М-1. Максимальная скорость реакции наблюдается при концентрации субстрата от 110-4 М и выше.
В ходе окисления ксантина ксантиноксидазой генерируется перекись водорода, которую удается обнаружить полярографически при активности фермента на уровне 20 мкМ/л.с. Такая чувствительность вполне достаточна для обнаружения фермента в сыворотке крови. Поэтому нами проведены исследования, направленные на разработку полярографического биосенсора на ксантиноксидазу, основанного на регистрации количества перекиси водорода, выделившейся в ходе ферментативной реакции.
Биосенсор представляет собой двухкамерную трехэлектродную полярографическую ячейку. Ячейка изготовлена по типу полного вытеснения, объем рабочей камеры 0,4 мл. В качестве рабочего использовали золотой дисковый электрод. Вспомогательная камера включает платиновый вспо-
могательнай электрод и хлорееребрянный электрод сравнения. Измерения проводили в 0,05 М трис-НС1 буфере, pH 8,5, содержащем 0,03 мг/мл ксантина при потенциале рабочего электрода +1,5 В относительно хлорсе-ребрянного электрода.
При добавлении в реакционную смесь НАД+, перекись водорода не обнаруживается, поскольку активный центр фермента взаимодействует с НАД+, окисляет пурин и генерирует НАДН. Отрицательно сказывается на ходе ферментативной реакции присутствие ионов кальция или магния. Субстратная инактивация ксантиноксидазы в процессе работы наступает из-за образования продуктов реакции 02- и Н202. В отсутствии субстратов стабильность составляет 750 мин - в присутствии субстратов 22 мин. Иммобилизованная ксантиноксидаза более стабильна.
Отрицательное влияние на ход определения ксантиноксидазы оказывают каталаза и пероксидаза, разрушая образующуюся в ходе ферментативной реакции перекись водорода.
Таким образом, при разработке биосенсора на ксантиноксидазу необходимо исключить из реакционной смеси НАД+, ионы кальция и магния (путем введения ЭДТА), ингибиторы фермента. И, что наиболее сложно, отделить ксантиноксидазу от каталазы и пероксидазы, неизбежно присутствующих в анализируемых пробах.
Поскольку активность ксантиноксидазы в крови относительно невысокая, образующаяся в ходе ферментативной реакции окисления ксантина перекись водорода, разрушается каталазой, присутствующей в гемолизате крови в высокой концентрации.
Подобного не наблюдается при работе с образцами сыворотки крови, поскольку каталаза в сыворотке крови присутствует в следовых количествах. Содержание же ксантиноксидазы в сыворотке и цельной крови различается не столь значительно (табл. 2).
Таблица 2
Сравнительное содержание ксантиноксидазы и каталазы в сыворотке и цельной крови здоровых людей
Ксантиноксидаза Ед/мл Каталаза, Ед/мл
Цельная кровь Сыворотка крови Цельная кровь Сыворотка крови
65 42 170 3,8
57 27 139 4,0
64 36 154 4,3
49 24 221 6,5
56 25 137 4.4
59 39 143 4,4
70 34 178 5,6
78 43 139 5,0
49 27 146 4,2
67 38 130 3,2
Таким образом, мешающее влияние каталазы удается избежать используя для анализа пробы сыворотки крови. Диагностическая ценность теста при этом не изменяется, поскольку содержание ксантиноксидазы в сыворотке крови и в цельной крови изменяются пропорционально.
СОД также ввиду ее низкого содержания в сыворотке крови не оказывает влияния на процесс определения ксантиноксидазы.
Влияние же пероксидазы практически полностью невелируется при проведении определения при значениях pH превышающих 8,5.
Существенным отличием ксантиноксидазы от каталазы, пероксидазы и СОД, является то, что она является прооксидантным ферментом. То-есть в нормальных условиях в организме катализирует образование анион-радикалов и гидроперекисей. В этом заключается большая диагностическая ценность проведения анализов содержания этого фермента при различных патологических состояниях.
Проведено изучение содержания ксантиноксидазы у здоровых взрослых и у больных бронхиальной астмой в стадии обострения и в период хронического течения заболевания (табл. 3).
Таблица 3
Активность ксантиноксидазы сыворотки крови здоровых взрослых и больных бронхиальной астмой
№ Диагноз Активность Ксантиноксидазы, ед/мл
1. Здоров 16,4
2. - 12,8
3. - 18,0
4. - 12,2
5. - 17,5
6. - 10,0
1. Бронхиальная астма 14,6
2. - 19,8
3. - 12,7
4. - 11,3
5. - 14,1
6. - 18,0
7. - 20,4
8. - 11,0
9. - 13,7
1. Бронхиальная астма в стадии обострения 29,6
2. - 25,4
3. - 42,2
4. - 24,7
5. - 25,8
6. - 39,7
7. - 27,2
Показано, что в период хронического течения заболевания уровень ксантиноксидазы в сыворотке крови практически не изменяется по срав-
нению с здоровыми людьми. В период обострения бронхиальной астмы наблюдается резкое повышение уровня ксантиноксидазы в сыворотке крови, что свидетельствует о наличии мембрано-деструктивных процессов, связанных с усилением перекисного окисления, вызванного павышенным уровнем ксантиноксидазы [11].
Таким образом разработанные нами биосенсоры позволяют проводить количественное определение каталазы, пероксидазы, СОД и ксантиноксидазы с высокой чувствительностью в сложных по составу биологических жидкостях. Биосенсоры могут быть использованы для диагностирования различных заболеваний, контроля хода течения заболеваний и изучения биохимических механизмов патогенных процессов.
* * *
Разработаны и исследованы основные принципы изготовления функционирования электрохимических биосенсоров на каталазу, пероксидазу, супероксиддисмутазу и ксантиноксидазу. Обоснованы условия сопряжения ферментативной и электрохимической реакций на поверхности биосенсора. Изучена кинетика ферментативных реакций и влияние различных факторов (pH, активаторы, ингибиторы, компоненты биосред) на процесс генерации сигнала биосенсоров. Разработаны два типа конструкций полярографических датчиков и проведены их испытания в биосенсорном контроле ферментов, регулирующих перекисное окисление в организме человека.
На основании теоретических и экспериментальных исследований нами разработаны биосенсоры на каталазу, пероксидазу и СОД. Разработанные биосенсоры позволяют быстро, с высокой селективностью и чувствительностью проводить определение ферментов в микрообъемах (0,02 мл) биологических жидкостей (кровь, слюна).
Биосенсоры испытаны в клинических условиях в количественном определении каталаза, пероксидазы, СОД и ксантиноксидазы при ряде патологических процессов разной степени тяжести, Установлено достоверное изменение активностей ферментов при гипоксии, бронхо-легочных заболеваниях и воспалительных процессах.
Разработанные биосенсоры позволяют проводить количественное определение каталазы, пероксидазы, СОД и ксантиноксидазы с высокой чувствительностью в сложных по составу биологических жидкостях. Биосенсоры могут быть использованы для диагностирования различных заболеваний, контроля хода течения заболеваний и изучения биохимических механизмов патогенных процессов.
Список литературы:
1. Ивницкий Д.М., Юлаев М.Ф., Кашкин А.П. // Журнал аналитической химии. - 1989. - Т. 44, № 10. - С. 1868.
2. Monroe D. // Immunoassay Technol. - Berlin; N.Y., 1986. - V 2. - P. 56.
3. Березин И.В., Клесов A.A.. Практический курс химической и ферментативной кинетики. - М.: MTV, 1976.
4. Okahata Susumu // Хиросима дайчаку игаку дзасси, Med. J. - Hiroshima Univ. - 1979. - № 27, V 5. - P. 741-753.
5. Straus Ronald Y. et. all. // J. Lab. and Clin. Med. - 1980. - № 95, V 6. -P. 897-904.
6. Переслегина И.П. Активность антиоксидантных ферментов слюны здоровых детей // Лабораторное дело. - 1989. - № 11. - С. 20-22.
7. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - М.: Медицина, 1968. - С. 11-13.
8. Yerli Y.C., Beretta Z., Bianhi M., et all. // Scand. J. Haematol. - 1980. -№ 25, V 1. - P. 87-92.
9. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. - М.: Наука, 1986. - С. 106-108.
10. Шелепина Е.П., Антонов В.Г., Кожемякин Л.А. // Биохимия. - 1990.
- T. 55, № 9. - С. 1707-1712.
11. Султанов А.Т., Манунцева Э.А. // Педиатрия. - 1997. - № 1. - С. 19-23.
