Научная статья на тему 'Биоплёнки антибиотикорезистентных Propionibacterium acnes и их чувствительность к антибактериальным пептидам стафилококков'

Биоплёнки антибиотикорезистентных Propionibacterium acnes и их чувствительность к антибактериальным пептидам стафилококков Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
1068
137
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Антибиотики и химиотерапия
WOS
Scopus
ВАК
Область наук
Ключевые слова
PROPIONIBACTERIUM ACNES / АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ / РИФАМПИЦИН / ТЕТРАЦИКЛИН / БИОПЛЁНКИ / АДГЕЗИЯ / АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПЕПТИДЫ / СТАФИЛОКОККЦИНЫ / ANTIBIOTIC RESISTANCE / RIFAMPICIN / TETRACYCLINE / BIOFILMS / ADHESION / ANTIBACTERIAL PEPTIDES / STAPHYLOCOCCINS

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Полюдова Татьяна Вячеславовна, Ерошенко Дарья Владимировна, Коробов Владимир Павлович

Работа посвящена изучению биологических свойств антибиотикорезистентных бактерий Propionibacterium acnes и их чувствительности к антибактериальным катионным пептидам варнерину и хоминину. Селекционным путём получены устойчивые к рифампицину и тетрациклину штаммы P.acnes VKM Ac-1450. С помощью диско-диффузионного метода показано, что приобретение устойчивости к данным антибиотикам сопровождается снижением чувствительности бактерий к ряду других антибактериальных препаратов. В результате определения минимальных подавляющих концентраций катионных пептидов установлено, что чувствительность антибиотикоустойчивых штаммов P.acnes к варнерину и хоминину сохраняется на уровне чувствительности родительского штамма. Антибиотикорезистентные бактерии проявляют более выраженную способность к адгезии и биоплёнкообразованию по сравнению с бактериями родительского штамма, однако формирование биоплёнок может быть эффективно подавлено стафилококкцинами. Анализ кривых интенсивности образования биоплёнок P.acnes от содержания пептидов в среде позволил установить концентрации, вызывающие торможение роста биоплёнок на 50%. Несмотря на то, что полученные значения в 5-12 раз больше, чем значения МПК для планктонной культуры P.acnes, стафилококкцины представляют собой перспективные препараты для борьбы с инфекциями, вызванными пропионовыми бактериями.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Полюдова Татьяна Вячеславовна, Ерошенко Дарья Владимировна, Коробов Владимир Павлович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Biofilms of Antibiotic-Resistant Propionibacterium Acnes and Their Sensitivity to Antimicrobial Peptides of Staphylococci

The article Is devoted to the study of biological properties of antibiotic-resistant bacteria Propionibacterium acnes and their sensitivity to antibacterial cationic peptides varnerin and hominin. P.acnes Ac-1450 strain resistant to rifampicin and tetracycline were obtained by selection. With the help of the Kirby-Bauer disk diffusion test, it is shown that the acquisition of resistance to these antibiotics is accompanied by a decrease in the sensitivity of bacteria to a number of other antibacterial drugs. As a result of the determination of the minimum inhibitory concentrations of cationic peptides, it has been established that the sensitivity of antibiotic-resistant P.acnes strains to varnerin and hominin is maintained at the sensitivity level of the parent strain. Antibiotic-resistant bacteria show a more pronounced ability for adhesion and biofilm formation in comparison with the bacteria of the parent strain, however, the formation of biofilms can be effectively suppressed by staphylococcins. Analysis of the curves of the formation intensity of P.acnes biofilms, depending on the content of peptides in the medium, made it possible to establish concentrations that inhibit the growth of biofilms by 50%. Despite the fact that the values obtained were 5-12 times higher than the MIC values for planktonic culture of P.acnes, staphylococcins are promising drugs for combating infections caused by propionic bacteria.

Текст научной работы на тему «Биоплёнки антибиотикорезистентных Propionibacterium acnes и их чувствительность к антибактериальным пептидам стафилококков»

Биоплёнки антибиотикорезистентных Propionibacterium acnes и их чувствительность к антибактериальным пептидам стафилококков

*Т. В. ПОЛЮДОВА1'2, Д. В. ЕРОШЕНКО', В. П. КОРОБОВ'3

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН — филиал Пермского федерального исследовательского центра УрО РАН, Пермь

2 Пермский государственный аграрно-технологический университет им. акад. Д. Н. Прянишникова, Пермь

3 Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь

Biofilms of Antibiotic-Resistant Propionibacterium Acnes and Their Sensitivity to Antimicrobial Peptides of Staphylococci

*T. V. POLYUDOVA12, D. V. EROSHENKO1, V. P. KOROBOV13

1 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Perm

2 Perm State Agro-Technological University, Perm

3 Perm National Research Polytechnic University, Perm

Работа посвящена изучению биологических свойств антибиотикорезистентных бактерий Propionibacterium acnes и их чувствительности к антибактериальным катионныш пептидам варнерину и хоминину. Селекционным путём получены устойчивые к рифампицину и тетрациклину штаммы P.acnes VKM Ac-1450. С помощью диско-диффузионного метода показано, что приобретение устойчивости к данным антибиотикам сопровождается снижением чувствительности бактерий к ряду других антибактериальных препаратов. В результате определения минимальных подавляющих концентраций катион-ных пептидов установлено, что чувствительность антибиотикоустойчивык штаммов P.acnes к варнерину и хоминину сохраняется на уровне чувствительности родительского штамма. Антибиотикорезистентные бактерии проявляют более выраженную способность к адгезии и биоплёнкообразованию по сравнению с бактериями родительского штамма, однако формирование биоплёнок может быть эффективно подавлено стафилококкцинами. Анализ кривык интенсивности образования биоплёнок P.acnes от содержания пептидов в среде позволил установить концентрации, вынытающие торможение роста биоплёнок на 50%. Несмотря на то, что полученные значения в 5—12 раз больше, чем значения МПК для планктонной культуры P.acnes, стафилококкцины представляют собой перспективные препараты для борьбы с инфекциями, вызванными пропионовыми бактериями.

Ключевые слова: Propionibacterium acnes, антибиотикорезистентность, рифампицин, тетрациклин, биоплёнки, адгезия, антибактериальные пептиды, стафилококкцины.

The article is devoted to the study of biological properties of antibiotic-resistant bacteria Propionibacterium acnes and their sensitivity to antibacterial cationic peptides varnerin and hominin. P.acnes Ac-1450 strain resistant to rifampicin and tetracycline were obtained by selection. With the help of the Kirby-Bauer disk diffusion test, it is shown that the acquisition of resistance to these antibiotics is accompanied by a decrease in the sensitivity of bacteria to a number of other antibacterial drugs. As a result of the determination of the minimum inhibitory concentrations of cationic peptides, it has been established that the sensitivity of antibiotic-resistant P.acnes strains to varnerin and hominin is maintained at the sensitivity level of the parent strain. Antibiotic-resistant bacteria show a more pronounced ability for adhesion and biofilm formation in comparison with the bacteria of the parent strain, however, the formation of biofilms can be effectively suppressed by staphylococcus. Analysis of the curves of the formation intensity of P.acnes biofilms, depending on the content of peptides in the medium, made it possible to establish concentrations that inhibit the growth of biofilms by 50%. Despite the fact that the values obtained were 5—12 times higher than the MIC values for planktonic culture of P.acnes, staphylococcus are promising drugs for combating infections caused by propionic bacteria.

Keywords: Propionibacterium acnes, antibiotic resistance, rifampicin, tetracycline, biofilms, adhesion, antibacterial peptides, staphylococcins.

Введение

Микробно-воспалительные заболевания являются одной из острых проблем практического

© Коллектив авторов, 2018

*Адрес для корреспонденции: 614081 г. Пермь, ул. Голева, д.13. Институт экологии и генетики микроорганизмов

здравоохранения. Существование подобной ситуации обусловлено многими факторами, среди которых ведущими являются быстрый рост и распространение устойчивой к антибиотикам условно-патогенной микрофлоры [1, 2] и снижение иммунологической резистентности макроорганизма [3]. Высокий интерес исследователей к

бактериям Propionibacterium acnes, в первую очередь, обусловлен их ролью в механизме возникновения угревой болезни. При снижении содержания кислорода в кожных покровах бактерии P.acnes, являющиеся компонентом нормальной микрофлоры, становятся более агрессивными. В этом состоянии они вызывают разрушение клеток протоков сальных желез [4]. Иммунная система реагирует на вторжение P.acnes локальным воспалением с образованием гнойной пустулы. В связи с выявленными механизмами развития ак-не, современное лечение основано на использовании антибактериальных препаратов.

Необходимо отметить появление в последнее время данных о роли бактерий P.acnes в имплан-тат-ассоциированных инфекциях, однако механизмы адгезии и формирования биоплёнок про-пионовыми бактериями до сих пор не раскрыты. Также не определена и стратегия оптимальной антибактериальной терапии инфекций, вызванных P.acnes и связанных с использованием имплантируемых устройств [5].

Наиболее часто для лечения акне используются системные антибиотики, такие как тетрациклин, эритромицин и доксициклин, что может служить одной из причин возникновения резистентности P.acnes к этим препаратам [6]. В тоже время, рифампицин как самостоятельно, так и в синергизме с другими антибиотиками, эффективно используют в клинической практике для борьбы с грамположительными бактериями в составе биоплёнок, в частности, стафилококками [7]. Кроме того, показана его эффективность в лечение осложнённых имплантант-ассоцииро-ванных инфекций, вызванных P.acnes [5, 8].

Несмотря на огромное количество охарактеризованных низкомолекулярных катионных пептидов, выделенных как из бактерий, так и высших организмов, действие их на P.acnes показано лишь для некоторых дефенсинов земноводных и человека [9, 10]. Среди низкомолекулярных кати-онных пептидов бактерий, выраженная антимикробная активность в отношении P.acnes показана лишь для энтероцина из Enterococcus faecalis SL-5 [11]. В этой связи катионные пептиды сапрофитных стафилококков, могут стать перспективными агентами в борьбе с возбудителями угревой болезни, поскольку единство экологических ниш бактерий родов Staphylococcus и кожных Propionibacterium свидетельствует о том, что стафилококки являются естественными природными антагонистами пропионовых бактерий — обитателей кожных покровов животных и человека.

Цель работы — изучение биологических свойств антибиотикорезистентных бактерий P.acnes VKM Ас-1450 и их чувствительности к антибактериальным катионным пептидам варнери-ну и хоминину, выделенным из сред роста

Staphylococcus warneri KL-1 (DSMZ-16081) и S.hominis KLP-1, соответственно.

Материал и методы

Объектом исследования явился штамм бактерий P.acnes VKM Ac-1450 (Всероссийская коллекция микроорганизмов, г. Пущино), выделенный из фолликулярной пустулы. Для культивирования бактерий P.acnes использовали бульон Лу-риа-Бертани (LB), содержащий, г/л: триптон — 10, дрожжевой экстракт — 5, KCl — 6,4. Полученные культуры использовали в качестве инокулума для последующих экспериментов.

Антибиотикоустойчивые варианты штамма P.acnes VKM Ас-1450: P.acnes VKM Ас-1450 Rifr штамм, устойчивый к ри-фампицину и P.acnes VKM Ас-1450 Tetr штамм, устойчивый к тетрациклину, были получены селекционным путём с помощью многократных пересевов клеток исходного штамма P.acnes VKM Ас-1450 в жидкой среде LB с возрастающими концентрациями соответствующего антибиотика в течение 5 циклов, продолжительность каждого цикла 72 ч [12]. Начальная концентрация рифампицина и тетрациклина (НИЦФ, Россия) в среде роста бактерий составляла 0,2 мкг/мл, максимальная концентрация — 20 мкг/мл.

Лекарственная устойчивость определялась диско-диффузионным методом на агаре Мюллера—Хинтон с использованием дисков (НИЦФ, Россия) в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 [13].

Адгезивные свойства бактерий оценивали по способности сорбироваться на гидрофобной поверхности полистирола (чашки Петри, 40 мм, «Медполимер», Россия) или гидрофильной поверхности покровных стекол (24x24 мм2, «Мини-мед», Россия) во время инкубации при 37°С в течение 60 мин [14]. Количество связавшихся с поверхностью бактерий оценивали прямым подсчётом клеток в поле зрения после окрашивания их раствором кристаллического фиолетового (0,1%). Подсчёт адгезированных клеток проводили на микровизоре «^Viso-103» (Россия) не менее чем в 10 полях зрения при увеличении x1000.

Определение степени гидрофобности пропионовых бактерий проводили с помощью МАТН-теста (Microbial Adhesion to Hydrocarbons) с н-гексадеканом [15].

Антибактериальные пептиды варнерин (APD ID 02801 http://aps.unmc.edu/AP/main.php) и хоминин [16] были выделены и очищены с помощью ионообменной хроматографии из сред роста Staphylococcus warneri KL-1 (DSMZ-16081) и S.hominis KLP-1, соответственно, согласно методике [17].

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) вар-нерина и хоминина по отношению к P.acnes определяли методом микроразведений в бульоне Мюллера—Хинтон (Oxoid, США), согласно рекомендациям CLSI [18].

Для оценки динамики гибели бактерий P.acnes в присутствии антибактериальных пептидов варнерина и хоминина суспензию клеток P.acnes VKM Ac-1450 в 10 мM Трис-НС1 буфере (рН 7,2), содержащую 2x108 КОЕ/мл, смешивали в соотношении 1:1 с растворами варнерина или хоминина (1 мг/мл) в том же буфере и инкубировали при 37°С в течение 180 мин. В контрольном варианте бактериальную суспензию смешивали 1:1 с буфером, не содержащим пептидов. Количество живых клеток определяли через 15, 30, 60, 120 и 180 мин инкубации высевом десятичных разведений суспензий клеток P.acnes на плотную питательную среду с подсчётом количества выросших колоний.

Биоплёнки бактерии P.acnes выращивали классическим способом в 96-луночном плоскодонном полистироловом планшете (Медполимер, Россия) в среде LB с добавлением 0,5% глюкозы при 37°С в течение 48 ч. При засеве количество клеток P.acnes составляло ~107 КОЕ/мл. Биомассу образовавшихся плёнок определяли по оптической плотности спиртовых экстрактов на планшетном спектрофотометре Benchmark plus (BioRad, США) при длине волны 570 нм (0D570) после

Таблица 1. Чувствительность бактерий P.acnes VKM Ac-1450 и его антибиотикоустойчивых производных к антибиотикам

Антибиотик (концентрация на диске) Диаметр зон задержки роста бактерий, мм

P.acnes VKM Ас-1450 P.acnes VKM Ас-1450 Tetr P.acnes VKM Ас-1450 Rifr

Бензилпенициллин (10 ЕД) 34+1,20 34+1,55 36+1,50

Цефалексин (30 мкг) 30+0,85 26+1,20 24+0,85

Ванкомицин (30 мкг) 24+0,50 26+1,22 26+0,85

Оксациллин (10 мкг) 28+0,50 18+0,56 20+0,65

Тетрациклин (30 мкг) 30+1,30 14+1,00 26+0,68

Эритромицин (15 мкг) >40 >40 >40

Фузидин (10 мкг) >40 >40 >40

Левомицетин (30 мкг) >40 >40 >40

Гентамицин (10 мкг) 24+1,00 18+0,55 12+0,55

Линкомицин (15 мкг) 22+0,55 22+0,89 24+0,85

Рифампицин (5 мкг) 34+0,92 32+1,22 0

Ципрофлоксацин (5 мкг) 28+0,88 22+1,40 26+0,64

окрашивания биоплёнок кристаллическим фиолетовым (0,1%) в течение 20 мин [19].

Для изучения эффекта катионных пептидов на процессы плёнкообразования готовили серию двукратных разведений пептидов в диапазоне концентраций 8—512 мкг/мл в полистироловых планшетах в среде LB с 0,5% глюкозой (объём среды в лунке 100 мкл). В качестве контроля использовали среду LB с 0,5% глюкозой без добавления пептидов. Затем в лунки добавляли по 100 мкл суспензии бактерий, содержащей 10' КОЕ/мл, и культивировали аналогично указанной выше методике. Концентрацию пептидов, при которой наблюдали ингибирование биоплёнкообразования на 50% (IC50) определяли по кривой, отражающей зависимость интенсивности образования биоплёнок от содержания пептидов в среде роста P.acnes (доза—эффект) компьютерной программы GraphPad Prism 6.0 [20].

Статистическая обработка и анализ полученных результатов осуществлялись с использованием метода ANOVA с помощью компьютерной программы GraphPad Prism 6.0. Данные представляли в виде M±SD трёх независимых экспериментов. Различия оценивали как достоверные при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Известно, что бактерии обладают выраженной способностью адаптироваться к ингибирую-щему действию антибиотиков, что приводит к появлению новых биологических особенностей клеток, показанному нами, в частности, для S.epi-dermidis ГИСК 33 [21]. В связи с полученными данными, были проведены эксперименты по изучению возможностей формирования бактериями P.acnes VKM Ас-1450 резистентности к антибиотикам, широко используемым в медицинской практике, в частности, к рифампицину и тетрациклину, минимальные ингибирующие концентрации которых для бактерий P.acnes VKM Ас-1450 составляли 4 и 2 мкг/мл, соответственно. Путем селекции на жидкой среде с добавлением антибиотика были получены два штамма: P.acnes VKM Ас-1450 RiF, обладающие устойчивостью к рифампицину о чём свидетельствовало полное отсутствие зоны подавления роста вокруг диска с этим антибиотиком, а так же P.acnes VKM Ас-1450 Tetr, устойчивые к тетрациклину. Важно отметить, что приобретение устойчивости к указанным антибиотикам сопровождалось изменением чувствительности P.acnes VKM Ас-1450 к гента-

мицину и оксациллину (табл. 1). Культивирование полученных резистентных бактерий на питательных средах без добавления антибиотиков, не приводило к восстановлению чувствительности резистентных штаммов Р.аспгз УКМ Ас-1450 к данным антибиотическим агентам. Следует отметить, что полученные штаммы бактерий устойчивых к рифампицину и тетрациклину были адаптированны к содержанию антибиотиков в среде роста в концентрации 20 мкг/мл, что превышает содержание рифампицина в 1,5 раза, а тетрациклина почти в 3 раза по сравнению с концентрациями этих препаратов, достигаемых в сыворотке крови при терапии инфекционных заболеваний человека и животных [22, 23].

В настоящее время известно более 40 генов бактерий, ответственных за устойчивость к тетрациклину, антибактериальное действие которого основано на подавлении белкового синтеза [24]. Чаще гены устойчивости к данному антибиотику локализованы на мобильных генетических элементах. Один из механизмов устойчивости к тетрациклину связан с синтезом эффлюксных белков, которые ограничивают поступление тетрациклина в клетку. Другой вариант устойчивости подразумевает наличие защитных белков, препятствующих взаимодействию тетрациклина с 308-субъединицей рибосом [25]. В отличие от разнообразных механизмов резистентности бактерий к тетрациклину, устойчивость бактерий, в том числе и Р.аспг&, к рифампицину, чаще всего, обусловлена возникновением точечных мутаций в гене гроВ, кодирующем в-субъединицу ДНК-зависимой РНК-полимеразы. В результате возникающих изменений в строении фермента связывание антибиотика с данной субъединицей становится невозможным и не происходит инги-бирования транскрипции РНК [12]. Вместе с тем, формирование резистентности Р.аспг& УКМ Ас-1450 к антибиотикам сопровождалось повышением адгезионной активности бактерий (рис. 1, а, б). Так, с помощью МАТН-теста мы установили, что клетки антибиотикозистентных штаммов

к 150

£

X

О

а

о

® 100

о с

к

S

т £

5

50-

1Г*НГ*1

1

*

*

гЬ

ФБ LB

Р. acnes В КМ Ас-1450 I

б

к 150-1 £ 2.5-1

Ф а п 2.0-

Ф 100- о с ш > 6 1.5-

I f-tn о 1.0-

of 50- о

г 3 „. *гп * * 0.50.0-

*

ФБ

Р. acnes В КМ Ас-1450 Rifr

LB Биоплёнка

О Р. acnes В КМ Ас-1450 Tetr

Рис. 1. Адгезия бактерий P.acnes VKM Ac-1450, P.acnes VKM Ac-1450 Rifr и P.acnes VKM Ac-1450 Tetr на поверхностях полистирола (а) и стекла (б) и биомасса плёнок P.acnes, сформированных за 48 ч при инкубации в среде LB с 0,5% глюкозы (в).

* - достоверное отличие от родительского штамма.

проявляли большее сродство к и-гексадекану по сравнению с клетками исходного штамма (менее 3%), что свидетельствует о возрастании общей ги-дрофобности поверхности клеток до 8% для штамма P.аcnes УКМ Ас-1450 ШР и до 10% для P.acnes УКМ Ас-1450 ТеР.

Однако, несмотря на выраженную гидрофиль-ность клеточных оболочек пропионовыгх бактерий, их сорбция на смачиваемой поверхности, такой как стекло, оставалась незначительной (рис. 1, б). В то же время наблюдалась интенсивная адгезия исследуемых бактерий на поверхности полистирола при их инкубации в питательной среде ЬВ. Выявленный факт можно объяснить формированием кондиционной плёнки за счёт адсорбции на полистироле молекул нуклеотидов, пептидов, аминокислот и т. п., содержащихся в питательном бульоне, что способствовало необратимой адгезии бактерий [26]. Важно отметить, что адгезия к полистиролу клеток антибиотикорезис-тентных штаммов P.acnes в среде ЬВ в разы превышала таковую родительского штамма (рис. 1, а).

Аналогично увеличению адгезионной активности, существенно возрастала биомасса зрелых биоплёнок резистентных P.acnes Ас-1450 (рис. 1, в). Так, при инкубации пропионовых бактерий в планшетах в течение 48 ч в среде ЬВ, содержащей глюкозу, наблюдалось интенсивное образование биоплёнок на поверхности полистирола. После экстракции связавшегося с плёнками красителя, наибольшая биомасса выявлена у бактерий, резистентных к тетрациклину (рис. 1, в). Эффлюксный механизм устойчивости к тетрациклину основан на работе двукомпонентных сигналпроводящих регу-ляторных систем, которые могут активировать работу нескольких генов, в том числе ответственных за синтез поверхностных белков — адгезинов [27], а также генов биосинтеза внеклеточных полисахари-

дов или аутолизинов [28]. Активация аутолизинов может способствовать возрастанию адгезионной активности бактериальных клеток как за счёт прямого взаимодействия с полимерной поверхностью [29], так и опосредованно вследствие высвобождения внеклеточной ДНК при лизисе части клеток, что способствует образованию биоплёнок оставшейся частью популяции [30]. Возможно, что данные эффекты имели место в активации адгезионной активности и биоплёнкообразования бактерий P.acnes, устойчивых к тетрациклину.

Ранее было показано, что бактерии P.acnes VKM Ас-1450 чувствительны к действию антибактериальных катионных пептидов, выделенных из сред роста стафилококков [31]. Антагонистические отношения между родами Staphylococcus и Propionibacterium обусловлены единством их эко-топов и выраженной межвидовой конкуренцией. Чаще всего подавление ближайшего конкурентного окружения происходит посредством синтеза антибактериальных катионных пептидов [32]. Динамика гибели бактерий P.acnes VKM Ас-1450 под действием стафилококковых бактериоцинов вар-нерина и хоминина была изучена в настоящей работе. Установлено, что полная гибель бактерий родительского штамма происходила уже через 3 ч действия пептидов (рис. 2).

Исследование чувствительности P.acnes Ас-1450 Tetr и P.acnes Ас-1450 Rif к варнерину и хо-минину показало, что с приобретением устойчивости к антибиотикам у бактерий не изменился уровень чувствительности к стафилококкцинам. Как для исходных, так и для резистентных бактерий минимальная подавляющая концентрация (МПК) обоих антибактериальных пептидов составляла 8 мкг/мл.

При изучении роста биоплёнок пропионовых бактерий в присутствии варнерина и хоминина

Рис. 2. Динамика гибели бактерий P.acnes VKM 1450 под действием варнерина и хоминина.

Ас-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

показано, что подавление образования биоплёнок бактерий всех исследованных штаммов (minimal biofilm inhibitory concentration, MBIC) происходит при концентрациях варнерина и хоминина равный 256 мкг/мл (рис. 3). В то же время снижение биомассы плёнок происходит во всем диапазоне исследованных концентраций антибактериальны« пептидов (8—512 мкг/мл). При этом концентрация варнерина и хоминина, ингибирующая формирование биоплёнок на 50% по сравнению с максимально возможным, различалась как между пептидами, так и для разных штаммов пропионо-

Таблица 2. Концентрация пептидов (мкг/мл), ингибирующая развитие биоплёнок P.acnes на 50%

вых бактерий (табл. 2). Наибольший эффект выявлен в присутствии хоминина в отношении бактерий, резистентных к тетрациклину. Ингибиро-вание формирования биоплёнок бактериями Р.аспгз Ас-1450 Те^ наполовину происходило в присутствии 41,6 мкг/мл хоминина. Для варнерина данное значение было выше в 2,4 раза. Следует отметить, что различие значений 1С50 в отношении биоплёнок и соответствующей ей МПК планктонной культуры в 5—12 раз связано с большей устойчивостью бактерий в составе биоплёнки. Именно это отличие и следует учитывать при подборе лечения инфекций, связанных с образованием биоплёнок. Результаты проведённых исследований показали выраженную способность пропионовых бактерий к формированию биоплёнок, развитие которых замедляется в присутствии антибактериальных пептидов, выделенных из сред роста стафилококков.

Заключение

Таким образом, в работе показана возможность быстрой адаптации Р.аспг& к негативному действию антибиотиков рифампицина и тетрациклина, в частности. Появление резистентности приводит к увеличению способности бактерий адгезироваться на гидрофобной поверхности и формировать биоплёнки, что особенно выражено у бактерий, резистентных к тетрациклину. Полученные антибиотикорезистентные штаммы пропионовых бактерий обладают высокой чувствительностью к бактериоцинам стафилококков, представляющих собой низкомолекулярные катионные пептиды семейства лантиби-

Пептид Концентрация пептвда, взывающая торможение роста биоплёнок P.acnes на 50%, мкг/мл

P.acnes VKM Ac-1450 P.acnes VKM Ac-1450 Tetr P.acnes VKM Ac-1450 RiP

Варнерин 82,8+2,5 70,6+1,1 98,6+2,4

Хоминин 79,6+1,9 83,4+1,0 41,6+1,3

Рис. 3. Формирование биоплёнок P.acnes VKM Ac-1450, P.acnes VKM Ac-1450 Rifr и P.acnes VKM Ac-1450 Tetr на поверхностях полистирола в присутствии варнерина (а) и хоминина (б).

отиков [33]. Для всех изученных штаммов P.acnes МПК составляла 8 мкг/мл, однако MBIC была существенно выше — 256 мкг/мл. Выявленная в работе чувствительность P.acnes VKM Ас-1450 и его резистентных вариантов, а также процессов плёнкообразования к катионным пептидам стафилококков, основанная на явле-

ЛИТЕРАТУРА

1. Laxminarayan R, Duse A., Wattal C. et al. Antibiotic resistance-the need for global solutions. Lancet Infect Dis 2013; 13: 1057—1098.

2. Walsh T.R., Efthimiou J., Dreno B. Systematic review of antibiotic resistance in acne: An increasing topical and oral threat. Lancet Infect Dis 2016; 16: e23—33.

3. Sousa D, Justo I., Domínguez A. et al. Community-acquired pneumonia in immunocompromised older patients: incidence, causative organisms and outcome. Clin Microbiol Infect 2013; 19: 187—192.

4. Harder J., Tsuruta D, Murakami M, Kurokawa /.What is the role of antimicrobial peptides (AMP) in acne vulgaris? Exp Dermatol 2013; 22: 386-391.

5. Furustrand Tafin U, Corvec S, Betrisey B, Zimmerli W, Trampuz A. Role of rifampin against Propionibacterium acnes biofilm in vitro and in an experimental foreign-body infection model. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56: 1885—1891.

6. Oprica C, Nord C.E., Kalenic S. et al. European surveillance study on the antibiotic susceptibility of Propionibacterium acnes. Clin Microbiol Infect 2005; 11: 204—213.

7. Vergidis P., Rouse M.S., Euba G. et al. Treatment with linezolid or van-comycin in combination with rifampin is effective in an animal model of methicillin-resistant Staphylococcus aureus foreign body osteomyelitis. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55 (3): 1182—1186.

8. Soderquist B, Holmberg A., Unemo M. Propionibacterium acnes as an etiological agent of arthroplastic and osteosynthetic infections-two cases with specific clinical presentation including formation of draining fistu-lae. Anaerobe 2010; 16: 304—306.

9. Guarna M., Coulson R., Rubinchik E. Anti-inflammatory activity of cationic peptides: application to the treatment of acne vulgaris. FEMS Microbiol Lett 2006; 257: 1—6.

10. Popovic S., Urban E., Lukic M., Conlon J.M. Peptides with antimicrobial and anti-inflammatory activities that have therapeutic potential for treatment of acne vulgaris. Peptides 2012; 34 (2): 275—282.

11. Kang B.S., Seo J.-G, Lee G.-S. et al. Antimicrobial activity of enterocins from Enterococcus faecalis SL-5 against Propionibacterium acnes, the causative agent in acne vulgaris, and its therapeutic effect. J Microbiol 2009; 47 (1): 101-109.

12. Furustrand Tafin U, Trampuz A., Corvec S. In vitro emergence of rifampicin resistance in Propionibacterium acnes and molecular characterization of mutations in the rpoB gene. J Antimicrob Chemother 2013; 68: 523—528.

13. Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». 2004. / Metodicheskie ukazaniya MUK 4.2.1890-04 «Opredelenie chu-vstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam». 2004. [in Russian]

14. Ерошенко Д.В., Коробов В.П. Сравнительный анализ формирования и разрушения биоплёнок PIA-отрицательных бактерий Staphylococcus epidermidis под действием гидролитических факторов. Вестник ТГУ Биология. — 2015. — № 1. — С. 28—36. / Eroshenko D.V., Korobov V.P. Sravnitel'nyj analiz formirovaniya i razrusheniya bioplyonok PIA-otritsatel'nykh bakterij Staphylococcus epi-dermidis pod dejstviem gidroliticheskikh faktorov. Vestnik TGU Biologiya 2015; 1: 28—36. [in Russian]

15. Rosenberg M., Gutnick D., Rosenberg E. Adherence of bacteria to hydrocarbons: A simple method for measuring cell-surface hydrophobicity. FEMS Microbiol Lett 1980; 9: 29—33.

16. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В. Антибактериальный пептид хоминин klp-1 широкого спектра действия. Патент РФ № 2528055. — 2014. / Korobov V.P, Lemkina L.M., Polyudova T.V. Antibakterial'nyj peptid khominin klp-1 shirokogo spektra dejstviya. Patent RF № 2528055. 2014. [in Russian]

17. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В., Акименко В.К. Выделение и характеристика нового низкомолекулярного антибактериального пептида семейства лантибиотиков. Микробиология. — 2010. — Т. 79. — № 2. — С. 228—238. / Korobov V.P, Lemkina L.M., Polyudova T.V., Akimenko V.K. Vydelenie i kharakteristika novogo nizkomolekulyarnogo antibakterial'nogo peptida semejstva lantibi-otikov. Mikrobiologiya 2010; 79 (2): 228—238. [in Russian]

нии микробного антагонизма, представлялась вполне ожидаемой, поскольку стафилококки и P.acnes конкурируют за колонизацию смежных экологических ниш [32].

Работа поддержана комплексной программой Уральского отделения Российской академии наук № 18-7-8-8.

18. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-second informational supplement. CLSI document M100-S22. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2012.

19. Stepanovic S, Vukovic D, Hola V. et al. Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci. APMIS 2007; 115: 891—899.

20. Rautenbach M., Gerstner G.D., Vlok N.M., Kulenkampff J., Westerhoff H. V. Analyses of dose-response curves to compare the antimicrobial activity of model cationic a-helical peptides highlights the necessity for a minimum of two activity parameters. Anal Biochem 2006; 350: 81—90.

21. Коробов В.П., Полюдова T.B., Лемкина Л.М. Изучение биологических свойств антибиотикорезистентных бактерий Staphylococcus epidermidis 33 и их чувствительности к варнерину. Вестник ПГУ Биология. — 2015. — № 1. — С. 5—14. / Korobov V.P., Polyudova T.V., Lemkina L.M. Izuchenie biologicheskikh svo-jstv antibiotikorezistentnykh bakterij Staphylococcus epidermidis 33 i ikh chuvstvitel'nosti k varnerinu. Vestnik PGU Biologiya 2015; 1: 5—14. [in Russian]

22. Kumar R., Malik J.K. Some pharmacokinetic parameters and dosage regimens for a long-acting formulation of oxytetracycline in 6- to 8-month-old male calves. Vet Res Commun 1998; 22 (8): 533—544.

23. Shimomura H, Andachi S, Aono T. et al. Serum concentrations of clarithromycin and rifampicin in pulmonary Mycobacterium avium complex disease: long-term changes due to drug interactions and their association with clinical outcomes. J Pharm Health Care Sci 2015; 1: 32.

24. Селизарова H.O. Антибиотики, нарушающие синтез макромолекул. Обзоры по клинич. фармакол. и лек. терапии. — 2003. — Т. 2. — № 1. — С. 70—78. / Selizarova N.O. Antibiotiki, narushayushchie sintez makromolekul. Obzory po klinich. farmakol. i lek. terapii 2003; 2 (1): 70—78. [in Russian]

25. Ковалевская Н.П. Интегративные коньюгативные элементы: эволюция микробной резистентности к антибиотикам. Фундаментальные исследования. — 2015. — № 1. — С. 284—289. / Kovalevskaya N.P. Integrativnye kon'yugativnye elementy: evolyutsiya mikrobnoj rezistentnosti k antibiotikam. Fundamental'nye issledovaniya 2015; 1: 284-289. [in Russian]

26. Ishiguro R, Yokoyama Y, Maeda H, Shimamura A., Kameyama K, Hiramatsu K. Modes of conformational changes of proteins adsorbed on a planar hydrophobic polymer surface reflecting their adsorption behaviors. J Colloid Interface Sci 2005; 290: 91—101.

27. Crosby A.H., Schlievert M.P., Merriman J.A., King J.M., Salgado-Pabon W, Horswill A.R. The Staphylococcus aureus global regulator MgrA modulates clumping and virulence by controlling surface protein expression. PLoS Pathog 2016; 12 (5): e1005604.

28. Ding Y, Onodera Y, Lee J.C., Hooper D.C. NorB, an efflux pump in Staphylococcus aureus strain MW2, contributes to bacterial fitness in abscesses. J Bacteriol 2008; 190 (21): 7123—9.

29. Heilmann C, Hussain M, Peters G. et al. Evidence for autolysin-mediat-ed primary attachment of Staphylococcus epidermidis to a polystyrene surface. Mol Microbiol 1997; 24: 1013—1024.

30. Qin Z, Ou Y, Yang L. et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiol 2007; 153: 2083—2092.

31. Полюдова T.B., Коробов В.П., Зидина H.M. Сравнительный анализ формирования биоплёнок бактериями Propionibacterium acnes Ac-1450 на нативных и обработанных катионными пептидами поверхностях полистирола. Российский иммунологический журнал. Тематический выпуск, приуроченный к Пермскому научному форуму. — 2015. — Т. 9. — № 2. — С. 661—663. / Polyudova T.V., Korobov V.P., Zidina N.M. Sravnitel'nyj analiz formirovaniya bioplenok bakteriyami Propionibacterium acnes Ac-1450 na nativnykh i obrabotannykh kationnymi peptidami poverkhnostyakh polistirola. Rossijskij immunologicheskij zhurnal. Tematicheskij vypusk, pri-urochennyj k Permskomu nauchnomu forumu 2015; 9 (2): 661—663. [in Russian]

32. Christensen G.J.M., Scholz C.F.P., Enghild J. et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics 2016;17:152.

33. Полюдова ТВ, Лемкина Л.М., Лихацкая Г.Н., Коробов В.П. Оптимизация условий получения и моделирование 3Б-етруктуры нового антибактериального пептида семейства лантибиотиков. Приклад биохим и микробиол. — 2017. — Т. 53. — № 1. — С. 47—54. /

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Полюдова Татьяна Вячеславовна — к. б. н., научный сотрудник Лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru/); доцент кафедры экологии Пермского государственного аграрно-технологического университета им. акад. Д. Н. Прянишникова, член Межрегиональной общественной организации «Микробиологическое общество», Пермь

Ерошенко Дарья Владимировна — к. б. н., младший научный сотрудник Лаборатории биохимии развития микроорга-

Polyudova T.V., Lemkina L.M., Likhatskaya G.N.. Korobov V.P. Optimizatsiya uslovij polucheniya i modelirovanie 3D-ctruktury novogo antibakterial'nogo peptida semejstva lantibiotikov. Priklad biokhim i mikrobiol 2017; 53 (l): 47—54. [in Russian]

низмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, член Межрегиональной общественной организации «Микробиологическое общество», Пермь Коробов Владимир Павлович — к. м. н., заведующий Лабораторией биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН; доцент кафедры биотехнологии Пермского национального исследовательского политехнического университета, Пермь

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.