CC BY
3
УДК 550.47-550.378
Попова Н.М., Вишнякова А.В.
БИООБРАСТАНИЕ БАРЬЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ-НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ АНАММОКС-ПРОЦЕССА IN SITU ПРИ АЗОТНОМ ЗАГРЯЗНЕНИИ
Попова Надежда Михайловна - магистр, инженер лаборатории химии технеция Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119071, Москва, Ленинский проспект, 31, корп. 4, missis 96@mail.ru.
Вишнякова Анастасия Валерьевна - инженер-исследователь Лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Института микробиологии имени С. Н. Виноградского, 117312, Россия, г. Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.
В статье исследовано биообрастание минеральных и полимерных барьерных материалов микроорганизмами пластовых вод ЧМЗ в присутствии нитратного и аммонийного ионов. Проводилась оценка активности микроорганизмов с помощью МТТ-теста и расчетов изменения концентрации ионов, а также путем программной обработки ЛКСМ-микрофотографий. Выделены материалы, на которых развивались наиболее эффективные сообщества микроорганизмов.
Ключевые слова: биоремедиация, азотное загрязнение, барьерные материалы, микробные биопленки
BARRIER CARRIER MATERIALS BIOFOULING FOR THE IN SITU ANAMMOX PROCESS CREATION UNDER NITROGEN POLLUTION
Popova N.M.1, Visnyakova A.V.2
1 A.N. Frumkin Institute of physical chemistry and electrochemistry RAS, Moscow, Russian Federation 1 S.N. Vinogradsky Institute of Microbiology RAS, Moscow, Russian Federation
The fouling of mineral and polymeric barrier materials by microorganisms in the formation waters of ChMP with the presence of nitrate and ammonium ions investigation. The activity of microorganisms was assessed using the MTT test and calculations of changes in the concentration of ions, as well as by software processing of LKSM microphotographs. The materials with the most effective communities of microorganisms developed were identified. Keywords:bioremediation, nitrogen pollution, barrier materials, microbial biofilms
Введение
Загрязнение окружающей среды азотными соединениями может привести к ряду негативных последствий для почвы, гидросферы и здоровья человека. Попадание в подземные и поверхностные воды азотных загрязнений, преимущественно нитратных и аммонийных, происходит в результате деятельности как химических, так и сельскохозяйственных предприятий. Наиболее значимыми источниками загрязнения являются рассолы поверхностных хранилищ радиоактивных отходов предприятий добычи и переработки урановой руды. Попадание в подземные и приповерхностные воды происходит при инфильтрации растворимых соединений через стенки хранилищ и при поверхностных переливах в период снеготаяния. Таким образом, в ближней зоне хранилищ наблюдаются экстремально высокие концентрации нитрата и аммония (таблица 1).
Таблица 1 - Характеристики загрязнения скважин в ближней зоне шламохранилища АО _"Чепецкий механический завод"
Скважина рН SO42- NO3- NH4+
Х2 С-40 6,6 1180 130 81
Х1 V-6 7,3 970 4300 216
Перспективным, эффективным и недорогим средством очистки вод является биоремедиация in
situ, за счет использования метаболического потенциала микроорганизмов [1]. Однако при комплексном загрязнении различие в биохимических процессах удаления аммония и нитрата требует активации разных групп денитрифицирующих и нитрифицирующих бактерий, работающих в разных окислительно-восстановительных условиях. Одной из перспективных групп для удаления окисленных и восстановленных форм азота являются анаммокс-бактерии, осуществляющие процесс анаэробного окисления аммония нитритом [2]. Ввиду их медленного развития и существования преимущественно в биопленках, для эффективного протекания анаммокс процесса в подземных водах необходим оптимальный носитель для развития биопленки.
В подземных условиях для удаления загрязнителей применяется технология
проницаемого барьера на основе минеральных носителей для развития микробных биопленок при траншейном заложении материала на разных глубинах [3]. В качестве компонентов проницаемых барьеров могут служить различные недорогие природные минералы и материалы: керамзит, цеолит, вермикулит и др., а также сама материнская порода водоносного горизонта (пески, супеси, суглинки). Кроме минеральных носителей для микроорганизмов анаммокс широко известна способность к обрастанию полимерных материалов в условиях биореактора: различных ершей, войлоков,
полиэтиленовых материалов [4]. Выбор носителя для иммобилизации загрязнителей в биопленках в проницаемом барьере в подземном водоносном горизонте может заметно улучшить эффективность работы анаммокс бактерий при создании всех необходимых условий для их развития.
Целью данной работы является оценка возможностей образования биопленок
микроорганизмов цикла азота пластовых вод ЧМЗ на различных минеральных и полимерных носителях, перспективных для использования в проницаемых барьерах в подземных водах.
Материалы и методы
Ранее на нескольких исследуемых нашей научной группой объектах методом профилирования сообщества по генам 16S рРНК были обнаружены представители группы Р1апс1ошусе1в& (рисунок 1), осуществляющие процесс анаммокс в загрязненных подземных водах ЧМЗ, на глубинах 8-12 м. Для ремедиации территорий вблизи шламохранилища сооружение проницаемого барьера может быть перспективным, в связи с чем была проведена данная работа по апробации различных минеральных и полимерных материалов в качестве носителей для роста анаммокс-бактерий.
other
Vi dnamibact eral es Syntrophaceae Rh odo су cl aceae PIan с torn yce tota
Patescibacteria Omni trophace ae Nitrospirota Ni tros am anadaceae MBNT15
Ge mm atim an ada ceae Oallionell aceae I Gaiell ales
■ Elusimicrohia DTB120
Comaman ada cea e
■ Chlaroflexi Archaea
I Actinomarmales
■ Acidiferrobacteraceae
100 ~i
90 -
80 -
70 -
60 -
50 -
40 -
30 -
20 -
10 -
0 J
Other
Xanth amonadace ae Trueperaceae ТЪ erm omi crobi al es Sphin gob acteri ac eae Saprospiraceae Rh odocycl aceae Rh odobactera cea e Rh odanob acteraceae i Rhizobi aceae Ps eudamonadace ae Planctomvcetota Patescibacteria Ni tros om onadace ae i Microbacteriaceae i Methylococcaceae
Idi omarin aceae i Gallionell aceae i Dehalococcoidia
Comamanadaceae i Chlaroflexi i Cal dilinea ceae Buridi ol deri ac eae i Al cali gen aceae i Actinomarinales
Рис. 1 Состав микробного сообщества пластовых вод с территории АО "ЧМЗ" (слабое загрязнение - слева (скв.40),
азотным загрязнением вблизи шламохранилища на высокое нитратное и аммонийное - справа (скв. V-6))
Культивирование на носителях проводили в анаэробных условиях с использованием модельных и реальных подземных вод. Состав среды для культивирования описан в статье Ножевниковой и др. [5]. В среду добавляли аммонийный (50 мг/л) и нитритный (60 мг/ л) азот в молярном соотношении 1:1,2 [6]. В качестве источника микроорганизмов служиила смесь пластовых вод, отобранных на территории ЧМЗ.
Анализ минерального состава материалов определяли методом рентгеновской дифракции и элементного анализа рентгенофлоуресценцией. В процессе эксперимента проводили измерение нитрит, нитрат-ионов и ионов аммония на приборе
Капель-205, на основе которых вычисляли скорости потребления аммонийного азота и образования нитратного азота.
Для сравнения интенсивности развития прикрепленных биопленок был проведён тест дыхательной активности (МТТ-тест) [7].
Основным методом визуализации биопленок на поверхности материалов была лазерная конфокальная сканирующая микроскопия при использовании флуоресцентных красителей -Concanavalin А для окрашивания углеводов биопленки и SYBR Green II, связывающийся с нуклеиновыми кислотами. Полученные изображения были дополнительно обработаны программными
методами (ImageG с дополнением Comstat 2.1) для получения информации о параметрах биопленок.
Экспериментальная часть
Применение лазерной конфокальной
сканирующей микроскопии позволило достоверно установить, что биопленки развивались на всех образцах. Отмечены различия в морфологии биопленок: обрастание плотных минеральных и полимерных материалов происходит равномерно (материнской породы, цеолита "Трейд" и цеолитсодержащего трепела, керамзита, москитной сетки, материалов ПНД), тогда как обрастание более аморфных глинистых минералов происходило только на плотных кварцевых зернах.
Максимальная площадь обрастания микробной биопленкой наблюдалась на каолиновой глине Камалинского месторождения, цеолитах, на активированной бентонитовой глине и иллите. На образцах активированного угля с 20% содержанием оксида кремния и неактивированных бентонитовых глинах обрастание было минимальным.
Помимо визуальной оценки, была проведена оценка функциональной активности сообщества бактерий пластовых вод ЧМЗ. По анализу скорости потребления аммонийного и нитритного азота, соотношению продуцируемого нитратного азота и потребленного аммонийного был выделен ряд максимально подходящих материалов, среди которых иллит, хакасский бентонит, каолиновые глины Кантатского и Камалинского месторождения, а также цеолит "Трейд" (рисунок 2). Также для этих биопленок характерны большая площадь и дыхательная активность микроорганизмов. Средней эффективностью обладали сообщества,
развивающиеся керамзите, вермикулите,
цеолитсодержащем трейде и каолиновой глине Компановского месторождения.
Корреляция Спирмана (рис. 3), представлена в виде тепловой карты, демонстрирует большее число положительных корреляций для следующих минеральных составляющих - КПШ, каолинита и иллита. Для кварца и плагиоклаза число положительных корреляций было минимальным вследствие их высокой химической инертности. Мы полагаем, что развитие микроорганизмов на материалах обусловлено использованием элементов из структуры минералов материала; так, для калиевых полевых шпатов это обусловлено процессом биологического выветривания за счет воздействия биогенных хелатообразующих агентов, связывающих главным образом, Fe и А1, что, в конечном итоге, способствует большему обрастанию минералов шпатов. Также установлена прямая связь между физиологическими параметрами биопленки и биофильными элементами - фосфором, магнием, железом.
Spearman
v2 VI/V2
Carta,» af,%
Ef area by BET, m2 MTT by BET
1 00 - C- 75 050 025 000 -0.25 —0.50 -0.75 -1.00
и
а
Рис. 2 Обрастание минеральных материалов микроорганизмами пластовых вод ЧМЗ
Рис. 3 Коэффициент корреляции Спирмена параметров биопленки и минерального состава материалов
Биопленки анаммокс-бактерий на полимерных материалах значительно отличаются от таковых на минеральных. Так, для биопленок на полимерных материалах типа "ерш", сетка и войлок, характерна неоднородность обрастания материала, наличие локальных очагов прикрепления, также возможно прикрепление как вдоль, так и поперек волокон. Подобное расположение стало возможным благодаря проницаемости таких материалов для потока воды, что, в свою очередь, увеличивает эффективность процессов анаэробного окисления аммония нитритом.
Анализ обрастания полимерных материалов показал повышенную микробную активность и образование биопленок во многом из-за высокой удельной поверхности, позволяющей
микроорганизмам занимать большую площадь материала (рис. 4). Разброс показателей клеточного дыхания объясняется неоднородностью
распределения биомассы на материалах вследствие их физических и химических свойств (пористости, плотности, наличие функциональных групп и др.). Удаление азотных соединений наблюдалось, однако достижения процесса окисления аммония нитритом -то есть максимально эффективного способа
микробной очистки вод от азотного загрязнения - не произошло.
Рис. 4 Анализ биопленок на полимерных материалах
Заключение
Проведенная оценка возможности применения полимерных материалов, минеральных носителей, материнской породы и различных глин для биогеохимического барьера с использованием микроорганизмов пластовой воды ЧМЗ показала, что наилучшими показателями обладают иллит, хакасский бентонит, каолиновые глины Кантатского и Камалинского месторождения, а также цеолит "Трейд".
Особенности биообрастания и развития ключевых физиологических групп микроорганизмов связаны с морфологией, минеральным и элементным составом материала. Обнаружено повышенное обрастание отдельных минеральных фаз. Так, несмотря на то, что бентонитовые глины более богаты катионообменными элементами, они уступают каолиновым глинам по причине их аморфности в результате набухания. Обнаружено повышенное обрастание отдельных минеральных фаз, например, иллита, каолинита, плагиоклаза, КПШ. Последний, отличается менее устойчивой структурой и большей доступностью калия.
Полученные в работе данные можно использовать для прогнозирования развития анаммокс процесса в водоносных горизонтах, а также в выборе оптимальных материалов для проницаемого биогеохимического барьера.
Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 22-24-00701.
Список литературы
1. Microbial community and in situ bioremediation of groundwater by nitrate removal in the zone of a radioactive waste surface repository / A. V. Safonov, T. L. Babich, D. S. Sokolova et al. // Frontiers in microbiology. — 2018. — Vol. 9, no. 1985. — P. 2-17.
2. Biofilms of anammox bacteria on mineral carriers to establish a subterranean permeable barrier / N. Popova, A. Vishnyakova, G. Artemiev et al. // International Journal of Environmental Science and Technology. — 2022. DOI: 10.1007/s13762-022-04131-w.
3. Ammonium removal from groundwater using a zeolite permeable reactive barrier: A pilot-scale demonstration / Li Shengpin et al. // Water science and technology: a journal of the International Association on Water Pollution Research. —2014. —Vol. 70. — P. 1540-7. 10.2166/wst.2014.411.
4. Microbial Biofilms Formed in a Laboratory-Scale Anammox Bioreactor with Flexible Brush Carrier / E. Botchkova, Yu Litti, B. Kuznetsov, A. Nozhevnikova. // Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology. — 2014. — Vol. 05. — P. 76-82. 10.4236/jbnb.2014.52010.
5. Anaerobic ammonium oxidation (anammox) in immobilized activated sludge biofilms during the treatment of weak wastewater / A. N. Nozhevnikova, Y. V. Litti, V. K. Nekrasova et al. // Microbiology. — 2012. — Vol. 81, no. 1. — P. 25-34.
6. Physiological and kinetic characterization of a suspended cell anammox culture / T. Lotti [et al.] // Water Research. — 2014. — Vol. 60. — P. 1-14. https://doi.org/10.1016Zj.watres.2014.04.017.
7. Use of MTT assay for determination of the bioflm formation capacity of microorganisms in metalworking fluids / E.A. Trafny, R. Lewandowski, I. Zawistowska-Marciniak, M. St^pinska // World J Microbiol Biotechnol. — 2013. — Vol. 29. — P. 1635-1643. https://doi.org/10.1007/s11274-013-1326-0.
