CC BY
19
Н.Б. Мельникова, В.М.Коробко
БИОМИМЕТИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БИС-НИТРОКСИДНОГО МЕТАНОФУЛЛЕРЕНА И ЦИТОХРОМА С
ФГБОУ ВО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
Изучен бис-нитроксидный малонатный метанофуллерен (NO^-МФ в качестве биомиметической модели его окислительно-восстановительного взаимодействия с цитохромом с. (NO'^-МФ может быть использован как адсорбат на силикагеле. Методами UV-vis и ЭПР-спектроскопии проведено сопоставление реакционной способности (NO^-МФ в реакциях с цитохромом с с действием нитроксидных частиц, таких как, газообразный монооксид азота, 2,2,6,6 - тетраметилпиперидин-1-оксил радикала (TEMnO). Было показано, что Fe(III) в цитохроме с под действием (NO'^-МФ восстанавливался до Fe(II), аналогично эффекту монооксида азота в водном растворе, тогда как, восстановление Fe(III) в геме цитохрома с под действием ТЕМПО было обратимым. Следовательно, состояние Fe-гема в цитохроме с может быть использован как индикатор взаимодействия цитохрома с с нитроксидными частицами in vitro.
Ключевые слова: бис-нитроксидный метанофуллерен, цитохром с
Bis-nitroxide malonate methanofullerene (NO)2-MF was studied as a biomimetic model of reduction-oxidation activity with cytochrome c. (NO)2-MF may be used as the adsorbate on silica gel. The activity of (NO)2-MF in the reaction with cyt c was compared with the effect of nitroxide species such as gaseous nitric oxide, 2,2,6,6 - tetramethylpiperidine-1-oxyl radical (TEMPO) by using UV-visible and EPR-spectra. It has been shown, that iron(III) in cyt c3+ under action (NO)2-MF was reduced up to iron(II), similar effect was observed under the influence of gaseous NO in aqueous solution, but reduction of iron(III) in heme cyt c was reversible in the presence of TEMPO. Therefore, the state of Fe-heme in cyt c can be used as the indicator of the interaction of cyt c with nitroxide species in vitro.
Key words: bis-nitroxides methanofullerene, cytochrome с
Введение. Нитроксидные соединения, содержащие в своем составе стабильные радикалы, такие как ТЕМПО (2,2,6,6 - тетраметилпиперидин-1-оксил радикал), например, ТЕМПО - НПВС, обладают свойствами, близкими к монооксиду азота.
Производные ТЕМПО являются эффективными антиоксидантами и могут быть использованы в качестве имитации супероксиддисмутазы и NO. Достоинством производных ТЕМПО, в отличие от NO-высвобождающих препаратов, является возможность изучения физико-химических закономерностей при создании новых ЛС, содержащих нитроксидные соединения, используя ТЕМПО как спиновую метку, на биомиметической модели red-ox процессов с участием NO частиц и ионов железа.
В настоящей работе исследована биомиметическая модель NO-радикальной активности с использованием бис-нитроксидного малонатного метанофуллерена (NO^-МФ и маркера redox процесса цитохрома с (Fe3+).
Изучение свойств нитрозильных комплексов цитохрома с (cyt c3+/cyt c2+), полученных под действием доступных нитро- и нитроксидсодержащих ЛВ в различных условиях, позволяет сформулировать требования для получения новых NO-высвобождающих ЛС [1,2].
Материалы и методы исследования. Цитохром с» (из сердца лошади) (>95%, lot STBB7839V, «Fluka» (USA) «Sigma-Aldrich»); (NO^-МФ был синтезирован и охарактеризован в КНЦ им. Арбузова.
Электронные спектры поглощения были получены на приборе «Bioline Specord S-100» (Analytik Jena, Germany) в области 190-600 нм; ЭПР-спектры регистрировали на Bruker EMX спектрометре при комнатной температуре.
Результаты работы и их обсуждение. UV-vis спектры раствора cyt с после его взаимодействия с ТЕМПО или (NO^-МФ, сорбированных на SiO2 изменялись во времени (рис. 1). В течение первых 30 минут появлялись полосы а- (550 нм) и ß- (520 нм), характерные для cyt c2+, а у-полоса изменила своё положение до 415 нм. В дальнейшем положение у-полосы в присутствии ТЕМПО указывало на быстрое окисление cyt c2+. В отличие от этого под
действием (NO^-МФ cyt c3+ медленно восстанавливался до cyt c2+, что характеризует (N0)2-МФ как сильный антиоксидант, red-ox потенциал которого меньше чем у cyt с.
2+
а)
б)
Рис. 1. Данные ИУ^б спектров раствора cyt с после обработки сорбированным ТЕМПО (пунктирная линия) или (КО)2-МФ (сплошная линия) на БЮ2. а) А=Г (X); б) X = { (т), где т - время взаимодействия cyt с с сорбентом.
Рис. 2. ЭПР спектры пленок (КО)2-МФ на кварце после погружения в раствор 410-5М cyt с во времени: раствора cyt с: 1-11 мин, 2 - 60 мин, 3 - 6 часов, 4 - 72 часа.
3470 3480
H, G
N=0 + Cyt <?*
(ЪГ=0)2-МФ
Изменения нитроксидного радикала в (КО)2-МФ подтверждали методом ЭПР тонких пленок (КО)2-МФ на кварце с последующим его погружением в раствор cyt с (рис. 2).
Интенсивность сигнала КО в ЭПР спектрах изменялась во времени и практически была равна нулю после 72 ч контакта, что доказывает исчезновение радикального фрагмента, подтверждая образование К-оксоаммониевого иона (рис. 2).
Заключение. Методами ЭПР и электронной спектроскопии доказана возможность использования бис-нитроксидного малонатного метанофуллерена как модели нитроксид-генерирующих веществ и монооксида азота на примере его взаимодействия с цитохромом с в
3430
3440
3450
3460
3490
3500
3510
3520
окисленной форме (cyt c3+), приводящее к восстановлению железа цитохрома с (cyt c2+) и образованию нитрозильного катиона.
Список литературы:
1. Melnikova N.B. Nitroxide methanofullerene as biomimetic model of interaction of nitroxide species with antioxidants / N.B. Melnikona, V.M. Korobko, M.V. Gulenova, G.M. Fazleeva, O.E. Zhiltsova, E.N. Kochetkov, A.I. Poddel'sky, I.A. Nuretdinov // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2015. - №136. P. 314-322.
2. Korobko V.M. The study of the complexes of nitromedicine with cytochrome c and NO-containing aqueous dosage form in the wound treatment of rats / V.M. Korobko, N.B. Melnikova, D A. Panteleev, A.K. Martusevich, S.P. Peretyagin // Nitric oxide. - 2014. - №42. - P. 62-69.
