CC BY
80
УДК 541.13:577.112.087
БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНІ БАКТЕРІЇ ЯК СЕНСОРНІ ЕЛЕМЕНТИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ
А. М. Задорожняя
Т. Г. Грузіна Інститут біоколоїдної хімії ім Ф. Д. Овчаренка НАН України, Київ
С. М. Дибкова
З. Р. Ульберг E-mail: [email protected]
Виявлено дозозалежний ефект інгібування іонами золота інтенсивності природної люмінесценції штаму Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+). Клітини цих бактерій можуть слугувати сенсорним елементом біолюмінесцентного аналізатора для визначення вмісту іонного золота, наприклад у стічних водах золотодобувних та золотопереробних підприємств, з метою контролю додержання технологічних процесів.
У результаті кон’югативного схрещування отримано клітини транскон’югату Pseudomonas fragi T2(5), що містять гібридну плазміду (ZnRlux+) і здатні високоспецифічно випромінювати світло під час контакту з іонами цинку. Це уможливлює використання їх як чутливого елемента в біолюмінесцентному високоспецифічному визначенні якісного та кількісного вмісту цього металу в об’єктах довкілля.
Ключові слова: бактерії, природна біолюмінесценція, індукована біолюмінесценція, визначення, золото, цинк, кон’югативне схрещування.
Однією з основних проблем швидкої індустріалізації є значне підвищення вмісту важких металів та їхніх сполук у ґрунтах, природних водоймах і стічних водах промислових підприємств. Залучення цих забруднювачів до трофічної ланки може стати причиною виникнення тяжких захворювань людини [1-3]. Той факт, що важкі метали здатні, навіть у мікроконцентраціях, призводити до локальних порушень цілісності ДНК, робить їх особливо небезпечними [4].
Відомо декілька «рядів небезпеки» іонів важких металів. До одного з найбільш небезпечних для біосфери належать: Аи, Ag, Zn, Са, Сг, Ня, Мп, РЬ, БЬ, Би, Те, W [5]. Тож за сучасних умов розвитку промисловості та стану очисних споруд постійний моніторинг об’єктів довкілля, зокрема водного середовища, з метою контролю вмісту цих забруднювачів є вкрай актуальним завданням.
Найпоширенішими методами визначення важких металів є атомна абсорбція, рентгенівська та емісійна спектроскопія [6, 7]. Однак ці методи є високовартісними, потребують багато часу й, окрім цього, не спроможні визначити саме токсичну частку забруднювача, оскільки відомо, що важкі метали можуть утворювати стійкі комплекси з природними сполуками, які, у свою чергу, не виявляють токсичної дії на біосистеми.
Усіх цих недоліків позбавлені біосенсорні аналітичні системи для визначення вмісту важких металів, у яких сенсорним елементом слугує бактеріальна біолюмінесценція. До основних переваг клітинних біосенсор-них аналізаторів слід віднести високу чутливість, здатність до визначення біотоксич-ної частки забруднювача, специфічність, швидкість реакції-відповіді, простоту використання, економічність [8].
Окрім використання як аналітичного сигналу природної здатності бактерій до біо-люмінесценції, останнім часом набуває стрімкого розвитку напрям зі створення ви-сокоспецифічних генетично модифікованих штамів, здатних до індукованої біолюмінес-ценції певними важкими металами [9-12].
З огляду на вищезазначене метою роботи було розроблення сенсорних елементів для визначення іонів важких металів в об’єктах довкілля на основі природних та генетично модифікованих біолюмінесцентних штамів бактерій.
Матеріали і методи
Для створення сенсорних елементів було використано бактеріальний штам Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+) із колекції морських люмінесцентних бактерій
Кримського медичного інституту ім. С. І. Геор-гієвського та штам Pseudomonas fragi T2(5) із колекції Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф. Д. Овчаренка НАН України.
Вплив іонів важких металів на інтенсивність природної біолюмінесценції клітин вивчали на штамі Photobacterium phospho-reum В7071 (lux+). Бактеріальні клітини цього штаму культивували протягом 1б-18 год при 22 0С у живильному середовищі такого складу (г/дм3): пептон — 5; дріжджовий екстракт — 5; NaCl — 30; K2HPO4-7H2O — 15; (NH4)2HPO4 — 0,5; MgSO4 — 0,1; CaCO3 —
0,2; гліцерол — 3 мл/л.
Концентрацію клітин контролювали спектрофотометрично (спектрофотометр СФ-4б, «Ломо», Росія) за довжини хвилі б40 нм.
Для аналізу було використано три метали у різних концентраціях: цинк, кобальт та золото. Цинк та кобальт застосовували у вигляді солей: ZnSO4-7H2O та CoC126H20 кваліфікації ч.д.а. виробництва Merck (Німеччина), готуючи вихідні 1 М розчини. Золото використовували у формі золотохло-ристоводневої кислоти (HAuCl4) (Sigma, США), з вихідною концентрацією б0 мкг/мл за металом.
Клітини бактерій перед аналізом осаджували із середовища росту центрифугуванням (б 000 об/хв, 10 хв) та ресуспендували в середовищі А такого складу: 50 мМ трис-амінометанмалат-NaOH буфер, 2,5% NaCl, pH 7 до кінцевої концентрації (D640 = 0,5), що відповідає 1-10® кл/мл або 0,5 мг/мл сухої маси.
Інтенсивність біолюмінесценції бактерій Ph. phosphoreum В7071 реєстрували на експериментальному хемілюмінометрі при температурі 23 0С. Хемілюменометр являє собою комп’ютер, у корпус якого вмонтовано вимірювальну комірку, яка контактує з фотопомножувачем (вимірювальний модуль). Реєстрацію біолюмінесценції та обробку отриманих даних проводили за допомогою спеціально розробленої програми. Прилад дозволяє визначати біолюмінесценцію в кінетичному режимі з реєстрацією відгуку через кожні 5-10 с. Контролем слугували суспензії клітин, які не містили важких металів.
Для вивчення впливу іонів важких металів на інтенсивність біолюмінесценції бактерій Ph. phosphoreum В7071 у кюветі хемілюменометра змішували 0,8 мл суспензії вихідних клітин у середовищі А та відповідні аліквоти металів. Об’єм проби становив 1 мл, час інкубації — 30 хв, час виміру — 10 с. Обраний час інкубації був оп-
тимальним для прояву інгібуючого впливу ксенобіотиків на біолюмінесценцію [13].
Для дослідження кінетики інгібування люмінесценції важкими металами 10 мл суспензії клітин у середовищі А, що містять відповідні концентрації металу, інкубували в колбах на магнітній мішалці. При цьому через певні проміжки часу відбирали проби по 1 мл і вимірювали інтенсивність їхньої біолюмінесценції.
Штам Pseudomonas fragi T2(5) було виділено з дерново-підзолистого ґрунту, забрудненого важкими металами (промисловий район м. Києва), охарактеризовано за куль-турально-біохімічними ознаками та рівнем стійкості до важких металів з використанням методу посіву на агаризованому трис-мінімальному глюконатвмісному середовищі з концентрацією металів: Zn — 0,8-2 мМ, Co — 1-2 мМ, Ni — 0,8-2мМ, Cu — 0,8-1 мМ, Cd — 0,8 мМ, CrOf — 0,20-0,25 мМ; а також на багатому середовищі з концентрацією металів: Zn — 3-10 мМ, Co — 3-4 мМ, Ni — 3-5мМ, Cu — 1-2 мМ, Cd — 1 мМ.
Аналітично чисті солі важких металів — ZnSO47H2O, CoCl26H2O, NiCl26H2O, Cu(NO3)2, CdCl26H2O, K2CrO4 (Merck, Німеччина) готували у вигляді 1М стокових розчинів, стерилізували автоклавуванням та додавали у середовища після їх стерилізації.
Аналіз плазмідної ДНК штамів бактерій проводили за методом Екгардта [14]. Виділення плазмідної ДНК здійснювали лужним лізисом за методом Бірнбойма-Долі [15]. RAPD-аналіз плазмідних ДНК виконували за методом [16] з використанням праймерів 0PA-06 та OPP-12. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) тривала 45 циклів (94 0С — 40 с; 35 0С — 40 с; 72 0С — 1 хв 30 с). Електрофорез плазмідних ДНК здійснювали в 0,8%-му агарозному гелі відповідно до методики [17].
Як стандарт для визначення розміру плазмід використовували нативну ДНК фага X.
З метою кон’югативного схрещування застосовували прекультури штамів Ps. fragi T2(5) та Ph. phosphoreum В7071, які вирощували протягом 14 год у 5 мл рідкого живильного середовища Luria-Bertani (LB-бульйо-ну). Клітини кожної культури осаджували центрифугуванням (6 000 об/хв, 10 хв), ресуспендували в 5 мл 0,01 М розчині MgSO4. Схрещування проводили на LB-агарі, змішуючи по 100 мкл суспензій донора та реципієнта з густиною 108 кл/мл. Культивували протягом 5 год при 28 0С, після чого висівали на селективне трис-мінімальне глюконат-вмісне середовище з додаванням 20 мкг/мл тетрацикліну, 0,3 мМ Zn та 3% NaCl. Як
контроль на це саме середовище висівали клітини донора та реципієнта. Результати кон’югативного схрещування аналізували після культивування культур протягом 24 год при 28 0С.
Для підтвердження наявності генів (ZnRlux+) у гібридній плазміді одержаних транскон’югатів проводили її елімінацію з використанням інтеркалюючого барвника — бромистого етидію [18, 19], кінцева концентрація якого в середовищі становила 100 мкг/мл.
Тестування елімінантів на чутливість до іонів цинку здійснювали шляхом висівання на трис-мінімальне середовище з концентрацією цинку 0,1-1,0 мМ.
Інтенсивність металіндукованої біолюмі-несценції клітин штаму-транскон’югату оцінювали за описаною раніше методикою [20].
У роботі було використано трис-гідро-ксиметиламінометан (Gibco BRL, Шотландія); LB-середовище, пептон, глюконат Na, дріжджовий екстракт, агарозу, бромистий етидій (Sigma, СТТТА); праймери: 0PA-06 и OPP-12 (Operon LTD, СТТТА). Інші реактиви були вітчизняного виробництва, кваліфікації х. ч. та ч. д. а.
Статистичну обробку результатів експерименту здійснювали згідно [21] з використанням критерію Стьюдента (р < 0,05).
Результати та обговорення
Можливість розроблення сенсорних елементів з використанням природної та індукованої здатності бактеріальних клітин реагувати на присутність забруднювачів зміною інтенсивності люмінесценції інтенсивно вивчається останнім часом [22].
Нами було проведено комплексні дослідження щодо можливостей розроблення сенсорних елементів з використанням як аналітичного сигналу зміни інтенсивності біолюмінесценції мікроорганізмів під дією важких металів в іонному стані.
Було вивчено вплив іонів важких металів на інтенсивність природної люмінесценції штаму Ph. phosphoreum В7071.
Показано, що іони важких металів (Zn, Co та Au) справляють інгібуючий вплив на біолюмінесценцію клітин досліджуваного штаму. При цьому встановлено, що найбільш виражена концентраційно-залежна здатність інгібувати інтенсивність люмінесценції бактеріальних клітин притаманна іонам золота: чутливість штаму до дії золота в іонному стані у концентрації 1 та 2,5 мкМ була значно більш вираженою, ніж чут-
ливість до дії іонів Zn та Co у максимально діючій концентрації — 100 мкM (рис. 1).
• тпоув
90 -і 80 -
50 40 -
30 -
0 +
Рис. 1. Ступінь інгібування природної люмінесценції клітин РкоіоЬаеівгіит рковркогвит В7071 (Іих+) іонами важких металів:
1 — іони Аи концентрацією 0,2 мкг/мл (1,0 мкМ);
2 — іони Аи концентрацією 0,5 мкг/мл (2,5 мкМ);
3 — іони Zn концентрацією 100 мкМ;
4 — іони Со концентрацією 100 мкМ
Дослідження особливостей впливу іонного золота на біолюмінесцентний штам Ph. phosphoreum В7071 дозволили встановити, що вже при концентрації 0,12 мкг/мл (0,6 мкМ) за металом відбувалося інгібування бактеріальної люмінесценції більш ніж утричі порівняно з контролем (рис. 2). Це свідчить про значний токсичний вплив іонів Аи на процеси життєдіяльності клітин досліджуваного штаму.
Рис. 2. Вплив іонного золота на інтенсивність біолюмінесценції штаму Рк. рковркогит B7071
Висока концентраційно-залежна чутливість штаму Ph. phosphoreum В7071 до впливу іонного золота свідчить про можливість використання його як сенсорного елемента при створенні біосенсорів для визначення вмісту іонів золота у водних середовищах.
На користь такої можливості вказують також результати, що їх одержано під час вивчення особливостей кінетики процесу взаємодії іонного золота з клітинами штаму Ph. phosphoreum В7071. Кінетичні криві гасіння інтенсивності бактеріальної люмінесценції іонами золота за двох різних значень концентрації (рис. 3) показують «швидку» кінетику цього процесу: протягом 10 хв рівень гасіння біолюмінесценції досягав максимального значення і подальше збільшення часу інкубації не впливало на його хід.
1, мкА 200-
0----1-----*----1-----1-----1----'-----1--
0 10 20 ЗО **
Рис. 3. Кінетика гасіння біолюмінесценції Pк. pкospкorum B7071 іонами золота за концентрацій (мкг/мл): 0,12 ( ■ ) та 0,3 ( • )
Таким чином, отримані результати підтверджують можливість застосування ефекту інгібування іонами золота інтенсивності природної біолюмінесценції штаму Ph. phos-phoreum В7071, використаного як сенсорний елемент біолюмінесцентного аналізатора для визначення вмісту іонного золота у водному середовищі.
Для подальших досліджень щодо розроблення сенсорних елементів значний інтерес становить штам Ps. fragi Т2(5). Вивчення стійкості клітин цих бактерій до низки іонів важких металів (Еп — 0,8-2 мМ, Со — 1-2 мМ, Мі — 0,8-2 мМ, Си — 0,8-1 мМ, Са — 0,8 мМ, СЮ|- — 0,20-0,25 мМ) виявило, що штам Ps. fragi Т2(5) характеризувався високим рівнем резистентності тільки до іонів цинку (таблиця).
Звичайні концентраційні межі біодоступ-них металів становлять 0,5-20 мМ [23, 24], тож рівень стійкості штаму Ps. fragi Т2(5) на мінімальному (2,0 мМ) та багатому (10,0 мМ) середовищах є досить високим.
З метою визначення генетичної детермінації стійкості до іонів цинку штаму Ps. fragi Т2(5) проведено експерименти з виділення та аналізу плазмідної ДНК.
Ріст бактерій Pseudomonas fragi T2(5) у присутності іонів цинку
Живильне середовище Вміст Zn
Трис-мінімальне глюконатвмісне середовище 0,8 мM 1,0 мM 2,0 мM
++ ++ +-
ЬБ-середовище 3,0 мM 5,0 мM 10,0 мM
++ ++ +-
Примітка: «++» — інтенсивний ріст;
«+—» — помірний ріст.
Встановлено, що клітини досліджуваного штаму містять плазміду розміром близько 50 т.п.н. (рис. 4, доріжка 2). Як маркер розміру плазмід було використано препарат ДНК фага X (рис. 4, доріжка 1).
12 3 4
—
Рис. 4. Розділення плазмід штамів бактерій у 0,8%-му агарозному гелі:
1 — маркер молекулярної маси — нативна ДНК фа-
га X (47 т.п.н.);
2 — плазміда штаму Рв. fragi Т2(5) ^пк);
3 — плазміда штаму Ph.рЫврЫгвит В7071;
4 — плазміда штаму Рв. fragi Т2(5) ^пк Іих+)
Причетність виділеної плазмідної ДНК до детермінації стійкості до іонів цинку було виявлено в результаті експериментів з елімінації цієї плазміди з подальшою перевіркою резистентності клітин-елімінантів штаму Рв. fragi Т2(5) до цинку. Для цього 15-ту генерацію культури бактерій, культивування якої проводили на багатому середовищі без вмісту іонів цинку (виключений селективний тиск на бактерії з боку металу), ресуспендували у 10 мМ розчині MgSO4 та висівали, використовуючи десятикратні розведення, на агаризовані багаті та мінімальні середовища, що містили іони цинку різної концентрації. У результаті було встановлено, що культура втрачала здатність до росту в присутності 0,6 мМ іонів цинку на мінімальному глюконатвмісному середовищі та 1 мМ — на багатому ЬБ-середовищі. Таким чином, виявлена плазміда є генетичною детермінантою стійкості штаму Рв. fragi Т2(5) до іонів цинку.
Плазмідний характер резистентності цього штаму до іонів цинку уможливлює використання його в експериментах з генетичної модифікації з метою отримання транскон’ю-гатів з гібридними плазмідами (ЕпРІих+).
Як донори Іих-генів було використано клітини штамів Ph. phosphoreum В7071. За даними електрофорезу носієм Іих-генів у цьому штамі є плазміда розміром 50 т. п. н. (рис. 4, доріжка 3). Фенотиповою ознакою цього штаму є здатність до росту в присутності 3%-го розчину №С1.
Контрольні посіви виявили, що клітини штаму Ps. fragi Т2(5) не здатні рости на середовищі, яке містить 3%-й №С1, а присутність іонів цинку в концентрації 0,3 мМ пригнічувала ріст клітин Ph.phosphoreum В7071.
Для одержання Іих-фенотипу штаму з індукованою іонами цинку біолюмінесцен-цією застосовували класичний метод кон’ю-гативного схрещування між бактеріями штамів Ph. phosphoreum В7071 та Ps. fragi Т2(5) з подальшою селекцією отриманих транскон’югатів за ознаками стійкості до іонів цинку та високої концентрації МаС1.
Одержаним у результаті процесу кон’ю-гативного схрещування клітинам транс-кон’югату була притаманна набута здатність до люмінесценції, що є доказом наявності Іих-генів у гібридній плазміді.
Дослідження вектора переносу генетичного матеріалу свідчать про те, що перенесення Іих-генів відбулось у клітини Ps. fragi Т2(5): ріст клітин транскон’югату спостерігався на середовищі, яке містить 0,3 мМ цинку, але не містить 3%-го МаС1.
Для підтвердження цього факту було проведено скринінг плазмід клітин отриманого транскон’югату за методом Екгардта. В результаті експерименту в генетично модифікованих бактерій було виявлено плаз-міду з більшою електрофоретичною рухливістю, ніж плазміди батьківських штамів (рис. 4, доріжка 4). Характеристику гібридної плазміди (Епкїих+), а також плазмід батьківських штамів одержано з використанням RAPD-аналізу. Суть цього методу полягала в ампліфікації поліморфних ділянок ДНК, які визначають видову належність. Було показано, що плазміди акцепторного (Еп^, до-норного (Іих+) та генетично модифікованого штамів (Е^Іих+) мають різні генетичні профілі (рис. 5).
Утворення гібридної плазміди, яка є носієм генів стійкості до цинку та Іих-генів, у процесі взаємодії плазмід батьківських штамів підтверджується даними щодо її елімінації. Отримані елімінанти характеризува-
лись високою чутливістю до іонів цинку та не виявляли біолюмінесцентних властивостей.
Створені селективні умови експерименту сприяли відбору таких модифікацій, де регуляція експресії Іих-генів відбувається промоторно-операторною ділянкою спільно з генами стійкості до цинку. У кінцевому підсумку в гібридному Іих-опероні цинк виступає як регулятор синтезу бактеріальної люциферази, яка каталізує окиснення аліфатичного альдегіду та відновлення фла-вінмононуклеотиду молекулярним киснем, унаслідок чого випромінюється світло.
Інтенсивність біолюмінесценції у цьому процесі є функцією концентрації цинку, з яким контактують клітини такої генетичної конструкції. Це дає змогу використовувати клітини отриманого транскон’югату як сенсорний елемент для кількісного та якісного визначення іонів цинку.
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 5. Розділення продуктів ПЛР, одержаних на плазмідах штамів бактерій за допомогою прай-мерів ОРА-О6 (1-4) та ОРР-12 (5-8) у 1,5%-му агарозному гелі:
1 — маркер молекулярної маси риС19/МврІ;
2 — Рв. ^і Т2(5) (Тек ZnR);
3 — Ph.рЫврЫгвит В7071;
4 — Рв. ^і Т2(5) Іих+);
5 —маркери молекулярної маси риС19/МврІ
і риС19/Шпа III;
6 — Рв. ^і Т2(5) ^ ZnR);
7 — Ph.рЫврЫгвит В7071;
8 — Рв. ^і Т2(5) Іих+)
Аналіз характеру впливу іонів важких металів на інтенсивність біолюмінесценції клітин генетично модифікованого штаму Рв. ^аді Т2(5) (2п^их+) засвідчив чітко виражену дію іонів цинку (рис. 6, крива 1). Прямолінійна залежність інтенсивності люмінесценції від концентрації цинку зберігається в діапазоні 1-100 мкМ за металом. Хід кривих 2-6 свідчить про незначний рівень чутливості клітин транскон’югату до інших важких металів.
біолюмшесценції. ('PS
Коїщеп ірлцім метану МкМ '
Рис. 6. Інтенсивність специфічної біолюмінесценції (CPS-кількість фотонів за секунду) клітин штаму-біосенсора Ps. fragi Т2(5) (ZnR lux+) у присутності іонів важких металів:
1 — Zn; 2 — Ni;
З — Co; 4 — Cd;
5 — Cu; 6 — Ag
Отже, можна констатувати високу специфічність клітин одержаного транс-кон’югату. Крива 1 може розглядатися як калібрувальна для іонів цинку у разі його кількісного визначення.
Фоновий рівень біолюмінесценції (середовище виміру) відображено на кривій 7.
Відношення максимального сигналу (рис. 6, крива 1) до фонового (рис. 6, крива 7) становить близько трьох порядків.
Таким чином, у результаті проведених комплексних досліджень встановлено: по-перше, ефект інгібування іонами золота інтенсивності природної люмінесценції штаму РК рЫврЫгеит В7071. Тому клітини цього штаму можуть слугувати сенсорним елементом для визначення вмісту іонного золота, наприклад у стічних водах золотодобувних та золотопереробних підприємств з метою контролю додержання технологічних процесів. По-друге, клітини транскон’югату, отримані в результаті кон’югативного схрещування, здатні висо-коспецифічно випромінювати світло під час контакту з іонами цинку. Це уможливлює використання їх як сенсорного елемента в біолюмінесцентному визначенні якісного та кількісного вмісту цього металу в об’єктах довкілля.
ЛІТЕРАТУРА
1. Подгорский В. С., Касаткина Т. П., Лозовая О. Г. Дрожжи — биосорбенты тяжелых металлов // Мікробіол. журн. — 2004. — Т. 66, №1. — С. 91-103.
2. Лозовая О. Г., Касаткина Т. П., Подгорский В. С. Влияние хрома (VI) на физиологию роста и сорбционную способность дрожжей // Там же. — 2004. — Т. 66, №3. — С. 43-50.
3. Губський Ю. І., Ерстенюк Г. М. Вивчення компонентів системи гемоглобіну та антиоксидантних ферментів за кадмієвої інтоксикації // Укр. біохім. журн. — 2002. — Т. 74, №5. — С. 124-127.
4. Благой Ю. П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами) // Соросовский образовательный журнал. — 1998. — №10. — С. 18-24.
5. Давыдова С. Л. О токсичности ионов металлов. — М.: Знание, 1991. — 32с.
6. Методы анализа объектов окружающей среды: Сб. научн. тр. АН СССР / Под ред.
В. В. Малахова. — Новосибирск: Наука. Сиб. Отделение, 1988. — 141 с.
7. Хроматографический анализ окружающей среды / Под ред. З. Л. Гроба. Перевод с англ. — М.: Химия, 1979. — 606 с.
8. Yu Lei, Wilfred Chen, Ashok Mulchandani. Microbial biosensors // Anal. Chim. Acta. — 2006. — 568. — P. 200-210.
9. Расторгуев С. М., Завильгельский Г. Б. Lux-биосенсор для детекции ионов мышьяка// Биотехнология. — 2001. — №2. — С. 77-82.
10. Асриэли Т. В., Власова И. И., Гаврилова Е. М., Данилов В. С. Влияние антибиотиков на люминесценцию рекомбинантных клеток Escherichia coli, активированных сывороткой крови // Там же. — 2002. — №2. — С. 85-93.
11. Corbisier P., Ji G., Nuyts G. et. al. luxAB gene fusion with the arsenic and cadmium resistance operons of Staphylococcus aureus plasmid p128 // FEMS Microbiol. Lett. — 1993. — V. 110. — P. 231-238.
12. Van der Lelie D., Corbisier P., Mergeay M. The use of biosensors for environmental monitoring // Res. Microbiol. — 1994. — V. 145. — P. 67-74.
13. Кацев А М., Стародуб Н. Ф. Влияние поверхностно-активных веществ на интенсивность люминесценции бактерий // Укр. биохим. журн. — 2003. — Т. 75, №2. — С. 94-99.
14. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria // Plasmid. — 1978. — V. 1, N4. — Р.584-588.
15. Birnboim H., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids. Res. —
1979. — V. 7, N6. — P. 1513-1523.
16. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. -1990. — V. 18, N24. — Р. 7213-7218.
17. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984. — 480 с.
18. Bouanchaud D., Scauizzi M., Chabbert Y. Elimination by ethidium bromide of antibiotic resistance in Enterobacteria and Staphylococci // J. Gen. Microbiol. — 1969. — V. 54. — P. 417-425.
19. Trevors T. Plasmid curing in bacteria // FEMS Microbiol. Rev. — 1986. — V. 32. — P. 149-157.
20. Грузина Т . Г., Дыбкова С. Н., Чеховская Т. П. и др. Получение биолюминесцентного бактериального штамма Photobacterium
phosphoreum В7071 (lux+) для определения концентрации ионов цинка // Укр. биохим. журн. — 2006. — Т. 78, №1. — С. 143-148.
21. Лакин Г. Ф. Биометрия: учебное пособие для биологических специальностей ВУЗов. — М.: Высш. школа, 1990. — 352 с.
22. Решетилов А. Н. Микробные, ферментные и иммунные биосенсоры для экологического мониторинга и контроля биотехнологических процессов// Прикл. биохим. микробиол. — 2005. — Т. 41, №5. —
С. 504-513.
23. Gerhardt P., Murray R., Wood W. Plasmids// Methods for general and molecular bacteriology. Amer. Soc. of Microbiol. — Washington DC, 1993. — P. 124-128
24. Сатаева Л. В., Малахов С. Г. Загрязнения почв металлами в зависимости от типа преобладающей промышленности // Труды ин-та эксперимент. метеорол. — 1991. — Вып. 18. — С. 3-8.
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ БАКТЕРИИ КАК СЕНСОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
А. М. Задорожняя, Т. Г. Грузина С. Н. Дыбкова, З. Р. Ульберг
Институт биоколлоидной химии им. Ф. Д. Овчаренко НАН Украины, Киев,
E-mail: [email protected]
Выявлен дозозависимый эффект ингибирования ионами золота интенсивности природной люминесценции штамма Photobacterium phos-phoreum В7071 (lux+). Клетки этих бактерий могут выступать в качестве сенсорного элемента для определения содержания ионного золота, например в сточных водах золотодобывающих и золотоперерабатывающих предприятий, с целью контроля соблюдения технологических процессов.
В результате конъюгативного скрещивания получены клетки трансконъюгата Pseudomonas fragi T2(5), которые содержат гибридную плазмиду (ZnRlux+) и способны высокоспецифично испускать свет при контакте с ионами цинка. Это дает возможность использовать их как сенсорный элемент в биолюминесцентном определении качественного и количественного содержания этого метала в объектах окружающей среды.
Ключевые слова: бактерии, природная биолюминесценция, индуцированная биолюминесценция, определение, золото, цинк, конъюгативное скрещивание.
BIOLUMINESCENT BACTERIA AS SENSOR ELEMENTS FOR THE HEAVY METALS IONS’ CONTENT DETECTION
A. M. Zadorozhnyaya T. G. Gruzina
S. M. Dibkova Z. R. Ulberg
Ovcharenko Institute of Biocolloidal Chemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
It has been shown the doze-dependent inhibition influence of gold ions on Photobacterium phosphoreum B7071 (lux+) natural luminescence. These bacterial cells can serve as a sensor element for ionic gold content detection, for example, in wastewater of gold-mining and gold-processing manufactures for requirements compliance control.
The Pseudomonas fragi T2(5) transconjugates, which contain hybrid plasmid (ZnRlux+) and which are capable of the high-specific of light emission as a result of the contact with zinc ions, have been derived by conjugate crossing method. It enables to use these transconjugates as sensor elements in the high-specific biolumi-nescent detection of qualitative and quantitative content of this metal in environmental objects.
Key words: bacteria, natural bioluminescence, induced bioluminescence, detection, gold, zinc, conjugate crossing.
