CC BY
5
насюк Л. В. Морфофункциональныс исследования в гигиене. М., 1984.
3. Визель М. А., Зельцер Г. П., Керимова Т. С.— Гиг. труда, 1985, № 7, с. 58—60.
4. Вихерт А. М., Митрофанов М. П., 8(егпЬу N. — Арх. пат., 1974, № 5, с. 76—80.
5. Гродецкая Н. С., Панкратова Г. П., Германова А. Л., Голубович Е. Я — Гиг: труда, 1980, № 9, с. 36—39.
6. Ильин Г. И, —Арх. пат., 1956, № 8, с. 97—101.
7. Коган А. Х. — Бюл. экспер. биол., 1959, № 10, с. 109— 113.
8. Кончаловский Н. М. Сердечно-сосудистая система при действии профессиональных факторов. М., 1976.
9. Николаева Н. И. — В кн.: Морфологические методы исследования в гигиене и токсикологии. М., 1983, с. 83— 90.
10. Саркисов Д. С. Очерки по структурным основам го-меостаза. М., 1977.
11. Трахтенберг И. М., Саноцкий И. В.. Тычинин В. А. и др. — Гиг. и сан., 1978, № 9, с. 62—66.
12. Францевич Л. И. Обработка результатов биологических
Доказано, что цитотоксическое действие фиб-рогенных пылей связано с повреждением клеточных мембран и обусловлено физико-химическими свойствами поверхности пылевых частиц [1, 8-12].
Среди показателей, определяющих взаимодействие пылевых частиц и плазматической мембраны, особого внимания заслуживают электрические свойства этих поверхностей. Однако при оценке поверхностных свойств пылевого образца для сопоставления с его биологической активностью традиционно измеряемого ^-потенциала явно недостаточно.
Целью нашей работы являлась комплексная оценка поверхностных свойств пылевых образцов, включающая измерения ^-потенциала, электрической проводимости водных суспензий, порогов быстрой коагуляции и агрегирующей способности. На основе значений указанных параметров мы провели анализ особенностей взаимодействия пылинок с поверхностью макрофага по изменению хемилюминесцентного ответа макрофагов, а также цитотоксических свойств пылевых образцов по гемолитической активности.
Для выделения перитонеальных макрофагов в брюшную полость белых беспородных крыс непосредственно перед декапитацией вводили 15 мл среды Хенкса. После 2—3-минутного массирования брюшка животного содержимое брюшной полости отсасывали через два слоя капроновой марли и затем центрифугировали при 400 д в течение 10 мин. Супернатант сливали, осадок ресуспендировали в 5 мл среды Хенкса и еще раз осаждали центрифугированием [2]. Окончатель-
экспериментов на микро-ЭВМ «Электроника БЗ-21». Программы и программирование. Киев, 1980.
13. Чекунова М. П., Фролова А. Д.— Гиг. и сан., 1983£Г № 5, с. 11—12.
14. Шперлинг И. Д. Функциогенная гипертрофия сердца человека в морфологическом освещении. Ереван, 1983.
15. Fulton R. М., Hutchinson Е. С., Jones А. М. — Brit. Heart J., 1952, vol. 14, p. 413—420.
16. Ishikawa S., Fattal G., Popiewicz J., Wyat J. — Amer. Rev. resp. Dis., 1972, vol. 105, p. 358-367.
Поступила 05.12.85
Summary. The effect of 4,4-diamino-diphenvI ether on the cardiovascular system of- white random-bred male rats was studied in chronic exposure by using a complex of functional morphologic methods. The compound was found to affect the cardiac muscle causing dystrophic, alterative, inflammatory and plastic processes the manifestation of which depends on exposure duration. Maximum no-effect dose for the test compound is 1/10 000 LD50 (0.084 mg/kg).
|
но ресуспендировали клетки в 0,5 мл той же среды. Все процедуры проводили при 4 °С. Клетки подсчитывали в камере Горяева и доводили концентрацию до 4-Ю7 в 1 мл. При таком способе выделения до 80% клеток составляли пери-тонеальные макрофаги. Жизнеспособность клеток определяли по исключению трщпанового синего. В работе использованы суспензии с содержанием клеток не менее 75%.
Измерение хемилюминесценции, усиленной лю-минолом, проводили на приборе «Luminescence Photometer» фирмы «LKB — Wallac» (Швеция). Для измерения готовили образец объемом 1 мл, содержащий 0,5- 106 клеток; 0,5 мг пылевых частиц и 6-Ю-7 молей люминала. Суспензии клеток^ и пылевых частиц готовили в растворе Хенкса Л им же доводили объем образца до 1 мл. В процессе измерения образец термостатировали при 37 °С и регистрацию вели при непрерывном перемешивании. Величину сигнала от образца и его изменение во времени регистрировали непрерывно на самописце, а затем по получившейся кривой рассчитывали параметры хемилюминесцентного ответа.
Для оценки функционального состояния клеток и их сохранности вносили повторно стандартную добавку (0,5 мг/мл люберецкого кварца — ЛК) [2,7].
Хемилюминесцентный ответ характеризовали несколько параметров: Д/i/Zo — относительное изменение интенсивности хемилюминесценции при активации макрофагов пылевыми частицами; Ti — время достижения максимума на кривой хемилюминесцентного ответа; ту, — время умень-
УДК 616.2-003.66-07
А. В. Яхъяев, Б. Т. Величковский, И. Б. Деева, Л. Г. Коркина
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ СВОЙСТВ ФИБРОГЕННЫХ ПЫЛЕЙ
II ММИ им. Н. И. Пирогова
шения AI] в 2 раза; Д/2 — интенсивность хеми-бьлюминесцентного ответа на стандартную добавку.
Исследовали 9 пылевых образцов: международный стандарт кварца DQ12, Л К, электротермический конденсат кремнезема (КК), природные цеолиты — клиноптилолиты Болгарского (КПТБ) и Грузинского (КПТГ) месторождений, хризотил асбест (ХА) и, антрофиллит (АА) Уральского месторождения, диоксид титана (ТЮ2 хч) и активную окись алюминия А120з. После предварительного измельчения все образцы были доведены до одинаковой дисперсности (менее 5 мкм) методом седиментации в водной среде [3].
Измерение электрокинетического потенциала проводили методом микроэлектрофореза в прямоугольной ячейке закрытого типа [4]. Для измерений готовили водные суспензии пылевых частиц концентрацией 0,5 мг в 1 мл, добавляли Ю-5 молей электролита (KCl). Образец для измерения отбирали, погружая пипетку в суспензию на 5 мм. ^-потенциал рассчитывали по фор-^муле Смолуховского—Генри:
где г] — вязкость среды (в П); Е — напряженность электрического поля (в В/м); V — скорость движения пылинки на уровне Смолуховского (в м/с); е, ео — диэлектрическая проницаемость среды и вакуума (в Ф/м) соответственно. Учитывая, что для пылевых частиц (г —радиус частицы метрах, х — величина, обратная толщине эффективной ионной атмосферы), двойной электрический слой вокруг частицы можно рассматривать как плоский конденсатор. Поэтому поверхностную плотность заряда (в Кл/м2) рассчитывали по формуле [6]:
= 808Ч^.
Измерение электрической проводимости водных суспензий пылевых частиц проводили на кондуктометре с колоколообразным электродом фирмы «Раделикс» (ВНР), имеющим стандартную геометрию измерительной ячейки. Для из-
мерений готовили суспензии пылевых образцов в дистиллированной деионизованной воде (10 мг/мл).
Порог быстрой коагуляции (ПБК) измеряли по изменению мутности суспензии после введения в нее электролита. Измерения проводили при длине волны 360 нм на спектрофотометре «Ультроспек» (Швеция). Концентрацию (KCl) меняли от 0,1 ммоля до 1 моля. Регистрировали оптическую плотность суспензии в зависимости от концентрации добавляемого KCl. За ПБК принимали концентрацию KCl, при которой наблюдается излом на графике зависимости оптической плотности от концентрации KCl [3, 6].
Скорость седиментации пылевых частиц оценивали по изменению мутности суспензии с течением времени. В качестве характеристики пылевого образца брали отношение скорости седиментации в растворе Хенкса к скорости седиментации в воде [3, 6].
Гемолитическую активность пылевых образцов измеряли по описанной в литературе [9] методике с незначительной модификацией. Электролиты выделяли из крови белых беспородных крыс в фосфатном буфере с pH 7,4 и цитратом. Кровь центрифугировали 20 мин при 400 g для удаления плазмы, а эритроциты затем трижды отмывали в буферном растворе центрифугированием в течение 10 мин при 400 g. Надосадок сливали, а из эритроцитарной массы готовили 4 % суспензию. Пылевые образцы использовали в концентрации 1 мг/мл. После смешивания суспензий эритроцитов и пылей образцы инкубировали 60 мин при 25 °С с перемешиванием. Гемолиз прекращали добавлением 2,2 % глутарового альдегида, образцы центрифугировали 10 мин при 400 g и измеряли содержание гемоглобина в супернатанте спектрофотометрированием при длине волны 540 нм. Степень гемолиза определяли, принимая полный водный гемолиз за 100 %'.
Результаты исследования поверхности пылевых образцов представлены в табл. 1. Из нее видно, что пылевые образцы заметно различаются по значениям ^-потенциалов. Наибольшие значения отрицательного ^-потенциала, а следова-
Таблица 1
Электрические параметры поверхности фиброгениых пылей
Образец пыли ^-потенциал, мВ Поверхностная Электрическая ПБК, Отношение скоростей Гемолитическая
плотность заряда, проводимость ммоль KCl седиментации активность, %
Кл/м» суспензии, мксм
кптг —65+6,2 -1,5-Ю-2 45,0±1,3 100±5,0 4,9±0,65 62±9,06
КПТБ —69+4,0 -0,9-10-2 11,1±0,6 80±10,6 7,2+0,32 61 ±11,04
dqI2 к к —59+4,8 -0,76-10-2 25,4±0,9 90±6,0 3,5±0,34 44±1,38
-49+3,4 -0,68-10-2 45,0±1,2 80±8,5 1,3±0,43 35±2,3
лк -45+6,6 -0,51-110-2 8,24±0,5 50±4,5 2,5±0,41 4,6±0,71
ХА +39+6,5 +0,57-10-2 40,4±0,7 75±10,0 2,1±0,21 35,4±1,5
АА —45+2,2 -0,61-10-2 16,1±0,3 75±5,0 2,2±0,18 6,7±0,8
ТЮ, —26+5,3 -0,25-10-2 Ш,3±0,4 0,5±0,1 1,4±0,46 5,5±0,57
А12б3 +57+2,5 +0,61-10-2 8,6±0,4 50±6,5 1,5±0,38 5.1 ±0,5
Таблица 2
Хемилюминссцентный ответ перитонеальных макрофагов на воздействие различных пылевых образцов
Образец Д1,/1о Д^, отн. ед. т,, мин т„,, мин
кптг 95±5,7 0 2 3
КПТБ 1 Г0±6,5 0 1,5 3
од12 80±5,3 0,5+0,24 6 10
КК 33±3,2 0,9±0,47 22 15
ЛК 66±4,3 5,0±0,80 11 14
ХА 18±2,8 1,4+0,21 21 25
АА 20±3,8 4,6+0,28 22 35
А1,03 1±0,4 5,0+0,96 22 40
тю2 1 ±0,3 6,5+0,30 15,3 40
тельно, и отрицательного поверхностного заряда характерны для цеолитов и ОС^г. Эти же образцы обладали и наибольшей биологической активностью. Наименьший отрицательный поверхностный заряд характерен для диоксида титана, обладающего и наименьшей биологической активностью в ряду исследованных образцов. Низкая биологическая активность свойственна также А^Оз, имеющему положительный поверхностный заряд.
В следующей серии экспериментов измерена электрическая проводимость водных суспензий пылевых образцов, отражающая как поверхностную проводимость пылевых частиц, так и их суммарное количество. Установлено, что проводимость суспензий меняется во времени и через определенный, неодинаковый для различных образцов период выходит на плато. Из графы табл. 1, где указаны стационарные значения проводимости образцов в концентрации 10 мг/мл, видно, что проводимость К.ПТГ, КК и ХА заметно выше, чем других образцов. Обращает на себя внимание и тот факт, что гемолитическая активность этих образцов заметно превышает таковую пылевых образцов, близких к ним по поверхностным параметрам.
Помимо чистых электрических параметров частиц, мы измеряли параметры, характеризующие взаимодействие частиц в плане их сближения и
слипания как между собой, так и с клетками. В частности, определяли ПБК, отражающий со отношение ван-дер-ваальсовых сил притяжения и кулоновских сил отталкивания пылевых частиц в суспензии. Установлено, что чем выше ПБК, тем выше поверхностный потенциал пылинок. Следует отметить резкое различие ПБК ТЮг и других образцов.
Известно, что скорость седиментации сильно зависит от размера частиц. Поэтому скорость седиментации одного и того же образца в средах с разной ионной силой отражает способность пылевых частиц слипаться, образуя конгломераты. Наибольшая относительная скорость седиментации у цеолитов, 00)2, асбестов и ЛК. Результаты измерения гемолитической активности позволяют выделить 3 группы исследованных образцов: первая — цеолиты, имеющие степень гемолиза более 50%, вторая — образцы, степень гемолиза которых в пределах 20—50 %, третья— пыли, с низкой гемолитической активностью (ЛК, ТЮ2, АЬОз, АА). Хемилюминесцентный ответ макрофагов, полученных от разных живот-^ ных на один и тот же пылевой образец, разлив чен. Однако при сравнении хемилюминесцентно-го ответа одной и той же клеточной суспензии на различные цылевые образцы всегда воспроизводится одна и та же качественная картина. Значения параметров этого ответа одной и той же клеточной суспензии на различные пылевые образцы приведены в табл. 2. Из табл. 2 видно, что наибольшие значения параметра ДЬЛо и наименьшие значения параметра Д12 характеризуют соответственно степень активации и сохранность клеток и образцов с наибольшим отрицательным поверхностным зарядом и агрега-ционной способностью, что в общих чертах соответствует результатам, полученным при изучении гемолиза под действием этих же образцов. Эти же поверхностные свойства определяют и временные характеристики хемилюмикесцентно-го ответа Ть ту,. А
Таким образом, выявлена тесная связь поверхностных свойств фиброгенных пылей с их биоло-
Таблица 3
Коэффициенты линейной регрессии между электрическими параметрами поверхности фиброгенных пылей и их биологическим действием
Параметры поверхности Гемолиз ХсмилюминссцснтныЯ ответ клеток перитонеального экссудата
Д1./1« Д12, отн. ед. т,, мин Т], 2, МИН
^-потенциал —0,456 —0,719 +0,515 +0,481 +0,671
—0,889* —0,919*
а, Кл/м2 —0,563 —0,756 +0,213 +0,720 +0,715
—0,829*
X., мксм -1-0,578 +0,137 —0,678 +0,019 —0,406
ПБК 4-0,731 +0,614 —0,878 -0,331 —0,698
"отн +0,772 +0,886 -0,632 -0,859 -0,745
Значения / в ряду отрицательно заряженных пылей.
Г"
гическим действием. Результаты расчета коэффициентов линейной регрессии, характеризующих эту связь, представлены в табл. 3. Наиболее тесная связь имеется между плотностью отрицательного поверхностного заряда и активацией клеток, измеренной по параметру ДЬДо хе-милюминесцентного ответа, а также с поверхностной энергией пылезых частиц, оцененной по их способности к агрегации. Особенно высоки коэффициенты корреляции для ряда отрицательно заряженных пылевых образцов. Коэффициенты корреляции между биологическими свойствами и электропроводностью суспензий пылевых частиц относительно ниже. На наш взгляд, это объясняется большим вкладом в электропроводность ионов, связанных с поверхностью некоторых образцов пылей, но играющих в биологическом действии этих образцов второстепенную роль. Наши данные о поверхностных свойствах асбестов указывают на то, что в механизме действия ХА имеются способности, отличающие его от других фиброгенных пылей и требующие дальнейшего изучения. Тем не менее в действии 5§ХА электроповерхностные свойства играют важную роль. Так, в ряде работ отмечается связь гемолитического действия ХА с его способностью адсорбировать фосфолипидные мембраны [8], рост гемолитической активности с увеличением положительного поверхностного заряда ХА, отрицательного заряда АА [10].
Тесная связь биологического действия пылевых частиц с их поверхностными свойствами позволяет думать, что химически инертные кристаллы фиброгенных пылей могут действовать на биологические мембраны посредством электрических сил. Поскольку прикрепление пылевой частицы к клеточной мембране вызывает выработку клетками «активных форм» кислорода, регистрируемых в нашей работе методом хемилю-минесценции [2, 7], то действие электрических сил сочетается с биохимическим действием вы-^сокореактивных продуктов восстановления кис-Тлорода, способных индуцировать перекисное окисление липидов клеточных мембран [1, 12]. Последнее, будучи одним из основных механизмов повреждения липидного бислоя мембран, приводит к снижению их электрической стабильности [5].
Полученные результаты позволяют предположить, что частицы фиброгенных пылей проявляют как свою гемолитическую активность, так и активирующее действие на макрофаги, главным
образом посредством поверхностного заряда. Мы полагаем, что прикрепление заряженной частицы к мембране обусловливает увеличение внут-римембранного скачка потенциала, что приводит к повышению вероятности появления в мембране дефектов, повышающих ее ионную проницаемость, т. е. нарушающих барьерные функции мембран.
Выводы. Главную роль в гемолитическом действии частиц фиброгенных пылей и их способности активировать и повреждать макрофаги играют одни и те же физико-химические свойства поверхности пылевых частиц.
2. Биологические свойства пылевых частиц тесно коррелируют с отрицательным зарядом их поверхности и с их способностью прилипать к мембране.
Литература
1. Величковский Б. Т. Фиброгеиные пыли: особенности строения и механизма биологического действия. Горький, 1980.
2. Величковский Б. Т., Цоркина. JJ. Г., Суслова Т. Б. — Гиг. труда, 1983, № 5, с. 51—54.
3. Воюцкий С. С. Практикум по коллоидной химии и электронной микроскопии. М., 1974.
4. Духин С. С., Дерягин Б. В. Электрофорез. М., 1976. 5! Пучкова Т. В., Путвинский А. В., Владимиров Ю. А. —
Докл. АН СССР, 1983, т. 270, № 6, с. 1489—1492.
6. Щукин. Е. Д., Перцов А. В., Амелина Е. А. Коллоидная химия. М., 1982.
7. Hatch G. Е„ Gardner D. Е., Menzel D. В. — Environm. Res., 1980, vol. 23, p. 121—136.
8. Jaurand M.-С., Magne L., Bignon J. — Toxicol. Lett., 1983, vol. 15, p. 205—211.
9. Kozin F., Millstein В., Mandel G.. Mandel N. — J. Coll. Interf. Sei., 1982, vol. 88, p. 326—337.
10. Light W. G„ Wei E. T. — Nature, 1977, vol. 265, p. 537— 539
11. Schuller J. E., Payne S. L„ Khalaf¡alla S. E. — Ibid., 1980, vol. 209, p. 1530-1532.
12. The in Vitro Effects of Mineral Dusts / Eds R. C. Brown et al. London, 1980.
Поступило 18.11 85
Summary. Fibrogenic dust surface properties determining both the interaction of dust particules with each other and with the cells were studied. Interaction with cells is assessed from hemolytic activity and chemiluminescent (CL) response of peritoneal exudate cells. Zeolites being of the highest hemolytic activity and capable to evoke rapid and intensive CY macrophage response were found to have the highest density of negative surface charge and the greatest surface energy which was testified by the aggregation capacity of dust particles. The same pattern is characteristic of other dust samples with negative surface charge. Chrysoasbestos with positive surface charge is of high hemolytic activity too.
У
