Научная статья на тему 'Биологическое и клиническое действие абиратерона на антирезорбтивную и анаболическую активность микроокружения костной ткани'

Биологическое и клиническое действие абиратерона на антирезорбтивную и анаболическую активность микроокружения костной ткани Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

CC BY
66
19
Поделиться
Журнал
Онкоурология
Scopus
ВАК
ESCI
Ключевые слова
АБИРАТЕРОНА АЦЕТАТ / ОСТЕОКЛАСТ / ОСТЕОБЛАСТ / КОСТНЫЙ МАРКЕР

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Мишель Иулиани, Франческо Пантано, Консуэло Буттиглиеро, Марко Фиорамонти, Валентина Бертаглиа, Бруно Винченци, Алиса Зокколи, Джулия Рибели, Марчелло Туччи, Франческа Виньяни, Альфредо Беррути, Джорджио Витторио Скальотти, Джузеппе Тонини, Даниэле Сантини

Применение абиратерона ацетата (АА) сопровождается не только значимым увеличением выживаемости пациентов с метастатическим кастрационно-резистентным раком предстательной железы (мКРРПЖ), но также отдалением времени до развития рентгенологического прогрессирования заболевания. Эти преимущества относительно костных метастатических очагов могут быть связаны с непосредственным воздействием на метастатические клетки рака предстательной железы в костях или со специфическими механизмами, направленными на костное микроокружение. Чтобы проверить эти гипотезы, мы провели исследование in vitro, направленное на оценку потенциального действия AA на первичные остеокласты (ОКЛ)/остеобласты (ОБЛ); in vivo оценивали изменения уровней маркеров костного метаболизма, С-концевых телопептидов коллагена 1-го типа (CTX, маркер костной резорбции) и щелочной фосфатазы (ЩФ) у 49 пациентов с мКРРПЖ, получавших AA. Наши результаты показали, что AA оказывает статистически значимое ингибирующее действие на дифференцировку и активность ОКЛ, уменьшая экспрессию ОКЛ-маркерных генов TRAP (тартратрезистентная кислая фосфатаза), образование катепсина К и матриксной металлопротеиназы-9. Кроме того, AA способствовал дифференцировке ОБЛ и отложению костной матрицы, увеличивая экспрессию специфичных для ОБЛ генов RUNX2 (фактор транскрипции-2, содержащий домен Runt), образование ЩФ и остеокальцина. Также мы наблюдали in vivo значимое снижение уровня CTX в сыворотке и повышение уровня ЩФ у пациентов, получавших AA. Эти данные позволяют предполагать новый биологический механизм действия AA, состоящий в прямом анаболическом и антирезорбтивном влиянии на костную ткань.

Похожие темы научных работ по медицине и здравоохранению , автор научной работы — Мишель Иулиани, Франческо Пантано, Консуэло Буттиглиеро, Марко Фиорамонти, Валентина Бертаглиа, Бруно Винченци, Алиса Зокколи, Джулия Рибели, Марчелло Туччи, Франческа Виньяни, Альфредо Беррути, Джорджио Витторио Скальотти, Джузеппе Тонини, Даниэле Сантини,

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Текст научной работы на тему «Биологическое и клиническое действие абиратерона на антирезорбтивную и анаболическую активность микроокружения костной ткани»

Биологическое и клиническое действие абиратерона

о

на антирезорбтивную и анаболическую активность

микроокружения костной ткани* §

ев

Мишель Иулиани1, Франческо Пантано1, Консуэло Буттиглиеро2, Марко Фиорамонти1, Валентина Бертаглиа2, Бруно Винченци1, Алиса Зокколи1, Джулия Рибели1, Марчелло Туччи2, Франческа Виньяни2, Альфредо Беррути3, Джорджио Витторио Скальотти2, Джузеппе Тонини1, Даниэле Сантини1

1 Трансляционная онкологическая лаборатория, Департамент медицинской онкологии, Римский университет Био-Медико, Рим, Италия; 2 кафедра онкологии, Туринский университет, Больница Сан-Луиджи, Орбассано (Турин), Италия;

3 отделение оперативной онкологии, Гражданская больница Брешии, Брешиа, Италия ,_

Контакты: Даниэле Сантини d.santini@unicampus.it Ц

Применение абиратерона ацетата (АА) сопровождается не только значимым увеличением выживаемости пациентов с мета- ¡Í? статическим кастрационно-резистентным раком предстательной железы (мКРРПЖ), но также отдалением времени до раз- сЗ вития рентгенологического прогрессирования заболевания. Эти преимущества относительно костных метастатических очагов могут быть связаны с непосредственным воздействием на метастатические клетки рака предстательной железы в костях ос или со специфическими механизмами, направленными на костное микроокружение. Чтобы проверить эти гипотезы, мы прове- i_ ли исследование in vitro, направленное на оценку потенциального действия AA на первичные остеокласты (ОКЛ)/остеобласты ^ (ОБЛ); in vivo оценивали изменения уровней маркеров костного метаболизма, С-концевых телопептидов коллагена 1-го типа ® (CTX, маркер костной резорбции) и щелочной фосфатазы (ЩФ) у 49 пациентов с мКРРПЖ, получавших AA. g

Наши результаты показали, что AA оказывает статистически значимое ингибирующее действие на дифференцировку и ак- ас тивность ОКЛ, уменьшая экспрессию ОКЛ-маркерных генов TRAP (тартратрезистентная кислая фосфатаза), образование о катепсина К и матриксной металлопротеиназы-9. Кроме того, AA способствовал дифференцировке ОБЛ и отложению костной матрицы, увеличивая экспрессию специфичных для ОБЛ генов RUNX2 (фактор транскрипции-2, содержащий домен Runt), образование ЩФ и остеокальцина. Также мы наблюдали in vivo значимое снижение уровня CTXв сыворотке и повышение уровня ЩФ у пациентов, получавших AA.

Эти данные позволяют предполагать новый биологический механизм действия AA, состоящий в прямом анаболическом и анти-резорбтивном влиянии на костную ткань.

Ключевые слова: абиратерона ацетат, остеокласт, остеобласт, костный маркер

Введение

Существует несколько противоопухолевых лекарственных средств, которые непосредственно влияют на костное ремоделирование, воздействуя на специализированные клетки костной ткани, такие как остеокласты (ОКЛ), остеобласты (ОБЛ), остеоциты, что обуславливает анаболическое и антикатаболическое терапевтическое действие данных препаратов на костную ткань. В настоящее время лекарственные препараты, воздействующие на костную ткань, находятся на стадиях доклинических и клинических исследований, это, например ингибиторы с^гс, ингибиторы интегринов, ингибиторы катепсина-К, антагонисты рецепторов эн-дотелина и модуляторы сигнального пути Wnt [1].

Абиратерона ацетат (АА) является селективным ингибитором биосинтеза андрогенов, который актив-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

но и необратимо блокирует СУР17. Он снижает продукцию андрогенов в надпочечниках, яичках и клетках предстательной железы, в результате чего уровень андрогенов в сыворотке и в опухоли снижается ниже границы выявления [2, 3]. В исследованиях III фазы у пациентов с метастатическим кастрационно-ре-зистентным раком предстательной железы (мКРРПЖ) было показано, что лечение АА сопровождается не только значимой пользой для выживания [4—6], но также и лучшим контролем боли и отдалением времени до развития рентгенологического прогрессиро-вания заболевания. Влияние АА на костные метастазы может быть следствием системного контроля заболевания в результате непосредственного противоопухолевого эффекта, который, в свою очередь, приводит к разрыву «порочного круга», включающего раковые

* Iuliani M., Pantano F., Buttigliero C. et al. Biological and clinical effects of abiraterone on anti-resorptive and anabolic activity in bone microenvironment. Oncotarget 2015;6 (14):12 520—8. Настоящая статья находится в открытом доступе и распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons «С указанием авторства», которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение в любой среде при условии упоминания авторов и источника.

ев

u

в* U

N et

клетки/ОКЛ/ОБЛ, или, как вариант, специфического воздействия на костное микроокружение. Чтобы проверить эту гипотезу, было разработано трансляционное исследование, цель которого заключалась в изучении потенциального прямого воздействия AA на костную ткань в модели первичных ОКЛ/ОБЛ человека in vitro и в проспективной когорте пациентов с мКРРПЖ, у которых в ходе лечения AA определяли маркеры костного метаболизма.

Результаты

Экспрессия Cyp17a1 и андрогенного рецептора в ходе дифференцировки ОКЛ и ОБЛ

Экспрессию Cyp17a1 оценивали на разных этапах дифференцировки ОКЛ/ОБЛ с использованием поли-меразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Уровни мРНК ОКЛ оценивали в 3 различных временных точках в рамках протокола дифференцировки — в 0-й день (моноцит), 6-й день (пре-ОКЛ), 12-й день (зрелый ОКЛ), по аналогичной схеме определяли экспрессию ОБЛ: в 0-й день (мезенхимальные клетки), 14-й день (пре-ОБЛ) и 21-й день (зрелый ОБЛ). Cyp17A1 экспрессировался на всех этапах дифференцировки ОКЛ/ОБЛ со значимым увеличением уровня матричной РНК (мРНК) на ранней стадии дифферен-

циации ОКЛ (моноциты в сравнении с пре-ОКЛ: р < 0,001; моноциты в сравнении с ОКЛ: р < 0,0001) (рис. 1). В процессе дифференцировки остеобластов уровни мРНК Cyp17a1, напротив, оставались неизменными (см. рис. 1). Оценивали также уровни экспрессии андрогенного рецептора в ходе дифференцировки ОКЛ/ОБЛ, поскольку другие авторы продемонстрировали непосредственное воздействие стероидов на костные клетки [7—12]. Андрогенный рецептор экс-прессировался на различных этапах дифференцировки ОКЛ со значимым снижением уровней транскриптов в зрелых ОКЛ (моноциты в сравнении с ОКЛ: р < 0,001). Как и в случае с Cyp17a1, уровни мРНК андрогенного рецептора оставались стабильными в ходе всех фаз дифференцировки ОБЛ (см. рис. 1).

Влияние AA на дифференцировку и активность первичных ОКЛ при наличии или при отсутствии стероидов

Первичные клетки обрабатывали АА в 2 различных концентрациях — 5 и 10 мкмоль/л, как и в других доклинических исследованиях in vitro, в рамках которых концентрация величиной 10 мкмоль/л была максимальной [13—15]. Ни одна из доз не влияла на жизнеспособность ОКЛ. AA добавляли к клеточным культурам ОКЛ каждые 3 дня, дифференцировку ОКЛ оценивали по окончании протокола дифферен-

ДМСО

АА10 мкмоль/л

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

600

+ 400

ДМСО

а? 100

S

| 80 > S

о

g 60

S

5 ^

6 40

АА АА

5 мкмоль/л 10 мкмоль/л

ДМСО

АА АА

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5 мкмоль/л 10 мкмоль/л

Рис. 1. Влияние обработки абиратероном на первичные ОКЛ. Результаты применения методов ТРКФ и Osteoassay с использованием обработанных и необработанных ОКЛ(ДМСО) при наличии (а) и при отсутствии (б) стероидов. *р < 0,05; **р < 0,001; ***р < 0,0001; ****р < 0,00001. ТРКФ — тетрат-резистентная кислая фосфатаза; ДМСО — деметилсульфоксид

800

к***

к*

200

20

0

0

цировки (12-й день) с использованием метода определения кислой фосфатазы (МКФ). Обработка АА оказывала статистически значимое ингибирующее действие на созревание ОКЛ, что приводило к уменьшению количества зрелых ОКЛ в сравнении с контрольной группой (диметилсульфоксид, ДМСО) (ДМСО в сравнении с АА в концентрации 5 мкмоль/л: р < 0,05; ДМСО в сравнении с АА в концентрации 10 мкмоль/л: р < 0,001; АА в концентрации 5 мкмоль/л в сравнении с АА в концентрации 10 мкмоль / л: р = 0,032) (см. рис. 1а). Влияние АА на ОКЛ-активность изучали посредством посева моноцитов в лунки, покрытые неорганическим фосфатом кальция, чтобы имитировать костную матрицу, и оценки областей реабсорбции (ямки), образуемой ОКЛ по окончании протокола диффе-ренцировки. АА значимо ингибировал резорбцию костной ткани, нарушая функцию остеокластов (ДМСО в сравнении с АА в концентрации 5 мкмоль/л: р < 0,0001; ДМСО в сравнении с АА в концентрации 10 мкмоль/л:р < 0,0001; АА в концентрации 5 мкмоль/л в сравнении с АА в концентрации 10 мкмоль/л: р = 0,020) (см. рис. 1а). Кроме того, влияние АА на диф-ференцировку ОКЛ и активность также оценивали с использованием сыворотки, которую с применением угля очищали от содержания стероидов в культуральной среде. В этой модели частота встречаемости зрелых ОКЛ значимо повышалась, как и способность этих кле-

ток реабсорбировать костную матрицу (р < 0,001) (рис. 2). В данной модели (с использованием МКФ и анализа резорбции) результаты также подтвердили значимое антирезорбтивное действие АА, что позволяет предполагать независимый от андрогенов ингибиру-ющий механизм (см. рис. 16).

Влияние AA на дифференцировку и активность первичных ОБЛ при наличии или при отсутствии стероидов

Влияние АА на дифференцировку ОБЛ оценивали как при наличии, так и при отсутствии стероидов посредством метода определения щелочной фосфа-тазы (МЩФ), который позволяет выявить экспрессию щелочной фосфатазы (ЩФ), основного маркера ОБЛ. После обработки АА в ОБЛ, культивированных в среде, содержащей стероиды, отмечалось значимое увеличение экспрессии ЩФ (ДМСО в сравнении с АА в концентрации 5 мкмоль/л: р = 0,035; ДМСО в сравнении с АА в концентрации 10 мкмоль/л: р = 0,30) (см. рис. 2а). Способность ОБЛ продуцировать костную матрицу анализировали только в присутствии андрогенов, так как депривация стероидов делала клетки неспособными индуцировать отложение фосфата кальция. АА значимо усиливал отложение костной матрицы, окрашиваемой ализариновым красным (ДМСО в сравнении с АА в концентрации 5 мкмоль /л: р = 0,026; ДМСО в сравнении с АА в концентрации 10 мкмоль/л: р = 0,014) (см. рис. 2а).

ев

и

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

в* и

N «Г

а

5 мкмоль/л 10 мкмоль/л 5 мкмоль/л 10 мкмоль/л

б

10 мкмоль/л ДМСО АА АА

5 мкмоль/л 10 мкмоль/л

Рис. 2. Влияние АА на первичные ОБЛ. Методы с использованием ЩФ и ализаринового красного применительно к обработанным и необработанным ОБЛ (ДМСО) при наличии (а) и при отсутствии (б) стероидов. * р < 0,05

а

ев

u

cX U

1,0 0,8 0,6 0,4 0,20,0

--1-1—

ДМСО АА ТРКФ

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ДМСО АА Катепсин-К

ДМСО АА ММП-9

100'

80

60

40

20

Контроль АА

Катепсин-К

Бета-актин

ДМСО АА

N it

2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

-г-

II

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ДМСО АА ЩФ

150

ал100

t 50

ДМСО АА ДМСО АА Остеокальцин Фактортранскрипции-2, содержащий домен «Runt»

Контроль

АА

Остеокальцин Бета-актин

ДМСО АА

Рис. 3. Анализ экспрессии генов и белков: а — уровни мРНК ТРКФ, катепсина-К и ММР-9 (ПЦР в режиме реального времени) и уровни белка катепсина-К(вестерн-блот) в обработанных и необработанных остеокластах (ДМСО), культивированных со стероидами; б — уровни ЩФ, остео-кальцина и фактора транскрипции-2 (ПЦР в режиме реального времени) и уровни белка остеокальцина (вестерн-блот) в обработанных и необработанных остеокластах (ДМСО), культивированных со стероидами. * р < 0,05; ** р < 0,001. ММР-9 — матриксная металлопротеиназа-9

*

**

0

0

Это доказывает, что ОБЛ в отличие от ОКЛ требуют источника стероидов для достижения полной дифференцировки, хотя обработка AA приводит к значительному усилению дифференцировки в условиях недостатка стероидов, что позволяет предполагать наличие независимого от стероидов анаболического эффекта AA. Действительно, после применения AA процент ЩФ+ОБЛ значимо увеличивался по сравнению с контролем (ДМСО в сравнении с AA в концентрации 5 мкмоль/л: р = 0,018; ДМСО в сравнении с AA в концентрации 10 мкмоль/л: р = 0,020) (см. рис. 26).

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Влияние AA на маркеры ОБЛ/ОКЛ

По сравнению с исходными значениями AA вызвал значимую отрицательную модуляцию таких маркеров ОКЛ, как кислая фосфатаза (р < 0,001), катепсин-К (р < 0,001), ММП-9 (р = 0,015), и положительную модуляцию экспрессии в ОБЛ генов: ЩФ (р = 0,015) и остеокальцина (р = 0,034) как при наличии, так и при отсутствии стероидов (рис. 3). Снижение уровня катепсина-К и усиление экспрессии остеокальцина были подтверждены с помощью вестерн-блота (см. рис. 3).

Влияние ЛЛ на маркеры костного метаболизма у пациентов с РПЖ

В исследование были включены 49 пациентов, 18 из них наблюдались в течение 10 мес после окончания лечения. Характеристики пациентов представлены в табл. 1. Средний возраст составил 67 лет. У 16 из них сумма баллов по шкале Глисона (индекс Глисо-на) составила 7, у 6 < 7, у 23 > 7. У 16 пациентов имели место метастазы в кости, у 18 — в кости и лимфатические узлы, у 9 пациентов — в лимфатические узлы, у 3 — в кости и внутренние органы, у 1 — во внутренние органы, у 1 — в кости, лимфатические узлы и внутренние органы, у 1 — метастазы в кости и местный рецидив. Двадцать пациентов начали прием золедроновой кислоты по меньшей мере за 3 мес до начала лечения АА. Медиана полученных доз золедроновой кислоты до начала терапии АА составила 12.

Наблюдалось значимое снижение уровней С-концевых телопептидов коллагена 1-го типа (СТХ): исходно медиана составляла 0,86 нг/мл (95 % доверительный интервал (ДИ) 0,84—1,25), а через 3, 6 и 9 мес - 0,78 нг/мл (95 % ДИ 0,67-1,01; р = 0,077), 0,61 нг / мл (95 % ДИ 0,73-1,19; р = 0,027)

Таблица 1. Характеристики пациентов (средний возраст 67 лет)

Показатель Число пациентов, n

Индекс Глисона

7 16

< 7 6

> 7 23

неизвестен 4

Метастазы

кости 16

кости и лимфатические узлы 18

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

лимфатические узлы 9

кости и внутренние органы 3

внутренние органы 1

кости, внутренние органы и лимфатические узлы 1

кости и местный рецидив 1

Применение золедроновой кислоты в ходе лечения

АА 20

Функциональный статус по шкале ECOG 0 1 2 31 15 3

Таблица 2. Разница медианного уровня маркеров резорбции и образования костной ткани

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

СТХ

СТХ4 СТХ7

СТХ10

i Медиана J 25-75 % I Min-Max

Рис. 4. Сравнение уровней СТХ исходно, через 3, 6 и 9 мес с использованием графика «ящик с усами»

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

ЩФ

ЩФ4 ЩФ7 ЩФ10

Медиана

25-75 % Min-Max

Показатель Исходно Через 3 мес Через 6 мес Через 9 мес

CTX

Медиана, 95 % ДИ, нг/мл 0,86 (0,84-1,25) 0,78 (0,67-1,01) 0,61 (0,73-1,19) 0,66 (0,38-0,71)

р (при сравнении с исходным уровнем) 0,077 0,027 0,006

ЩФ

Медиана, 95 % ДИ, Ед/л 123 (126-261) 143 (255-382) 126 (200-327) 190 (172-344)

р (при сравнении с исходным уровнем) 0,01 0,62 0,28

CS

U

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

et

U

N «r

Рис. 5. Сравнение уровней ЩФ исходно, через 3, 6 и 9 мес с использованием графика «ящик с усами»

и 0,66 нг/мл (95 % ДИ 0,38-0,71; р = 0,006) соответственно (табл. 2, рис. 4). По сравнению с исходной медианой по прошествии 3, 6 и 9 мес отмечалось снижение уровня CTX на 9,3; 29 и 23 % соответственно.

Уровень ЩФ составил 123 Ед/л (95 % ДИ 126261) и 190 Ед/л (95 % ДИ 172-344) исходно и по прошествии 9 мес (р = 0,28) соответственно. Сравнение уровней ЩФ исходно и по прошествии 3 мес показало значимое повышение (р = 0,010) (табл. 2, рис. 5). По сравнению с исходной медианой по прошествии 3, 6 и 9 мес отмечалось повышение уровня ЩФ на 16,3; 2,4 и 54,5 % соответственно.

Обсуждение

Результаты настоящего исследования впервые продемонстрировали непосредственное анаболическое и ан-тирезорбтивное воздействие АА на костную кань in vitro и у пациентов с мКРРПЖ in vivo. Действительно, АА способен специфически модулировать дифференциров-ку ОКЛ/ОБЛ без какого-либо цитотоксического и/или пролиферативного эффекта в применяемых дозах. Кроме того, по нашим данным, АА регулирует экспрессию генов в клетках костной ткани, модулируя уровни мРНК ключевых генов ОКЛ/ОБЛ. Интересно отметить, что анаболические и антирезорбтивные эффекты отмечаются как при наличии, так и при отсутствии стероидов, что позволяет предполагать неканонический механизм действия, который представляется по меньшей мере как частично независимый от андрогенов.

Недавно R.D. Bruno и соавт. сообщили об альтернативном механизме действия после анализа влияния АА и других специфических ингибиторов CYP17

ев

u

■SI

u

N it

на линию андрогеннезависимых клеток рака предстательной железы (РПЖ) (PC-3) [16]. Применение лекарственного средства индуцировало быстрое высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума (ЭР), что приводило к нарушению кальциевого гомеостаза. Это, в свою очередь, обусловливало стрессовый ответ ЭР, также известный как «реакция неструктурированных белков», который осуществлялся посредством фосфорилирования фактора элонгации трансляции eIF2a и положительной модуляции генов реакции на стресс с итоговой остановкой клеточного цикла. Кроме того, недавние данные свидетельствуют, что фосфорилирование eIF2a способствует активации ATF4, ключевого транскрипционного фактора ОБЛ, что приводит к положительной модуляции остеокальцина и отрицательной модуляции ключевого про-остеокластного фактора NFATc1, в результате чего происходит продукция костной матрицы [17]. При совокупном анализе эти данные позволяют предположить новый потенциальный молекулярный механизм, действуя посредством которого, АА, фосфорилируя eIF2a, может способствовать обстеобластогенезу и ингибировать зависимую от ОКЛ резорбцию кости. Эти обнадеживающие результаты, полученные in vitro, позволили дать убедительное обоснование целесообразности разработки трансляционного исследования для изучения потенциальной модуляции сывороточных маркеров костного метаболизма при лечении с применением АА когорты из 49 пациентов с мКРРПЖ. Наши результаты показали, что у этих пациентов абиратерон значимо ингибировал костную резорбцию, о чем свидетельствовало снижение уровня CTX в сыворотке, и усиливал неоостеогенез, что подтверждалось повышением уровня ЩФ, и это согласуется с данными, полученными in vitro.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

В целом наши доклинические и клинические данные дают биологическое обоснование высокой эффективности лечения с применением АА, выражаемой в улучшении нескольких специфических клинических конечных точек со стороны скелета, что было недавно установлено в клинических исследованиях III фазы.

Молекулы, которые одновременно воздействуют на клетки РПЖ и костную микросреду, могут значимо повлиять на будущие подходы к терапии, что обеспечит лучший контроль в лечении заболевания при РПЖ с метастазами в кости. Если в дальнейшем будет получено перспективное подтверждение, то данные значимые результаты будут свидетельствовать в пользу си-нергетического эффекта АА и лекарственных средств, специфически воздействующих на костную ткань (бисфосфонатов и деносумаба).

В заключение хотелось бы сказать, что эти результаты представляют собой первые свидетельства нового механизма действия АА, направленного на костное

микроокружение (вместе с известным противоопухолевым действием на клетки мКРРПЖ), и прокладывают путь к новым сценариям лечения метастазов РПЖ в кости.

Материалы и методы

Первичная культура клеток

Мононуклеарные клетки периферической крови получали из лейкоцитарной массы 10 здоровых доноров мужского пола по градиенту плотности Lympholyte®^ (Cedarlane Laboratories), а моноциты отсортировывали с помощью гранул, конъюгированных с антителами к CD14 человека (Miltenyi Biotech), а затем культивировали в течение 12 дней в культуральной среде RPMI (Euroclone) с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Thermo Scientific), 10 % очищенной на угле сывороткой (Sigma-Aldrich) со 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина (Euroclone), 2 ммоль/л L-глутамина (Euroclone), 25 нг/мл макрофа-гального колониестимулирующего фактора и 50 нг/мл лиганда рецептора-активатора ядерного фактора кап-па-В (RANKL) (R&D Systems), чтобы дифференцировать их от ОКЛ. В ходе осуществления протокола диф-ференцировки (в 1—12-й дни) клетки обрабатывали АА в концентрации 5—10 мкмоль/л (Selleckem) или балластным веществом в качестве контроля.

Первичные ОБЛ человека дифференцировали от мезенхимальных стволовых клеток человека (МСКЧ), предоставленных лабораторией клеточных культур кафедры биомедицины и профилактики Университета Тор Вергата (Рим). МСКЧ культивировали в течение 21 дня в среде альфа-MEM (Euroclone), обогащенной 15 % фетальной бычьей сывороткой или 15 % очищенной на угле сывороткой, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 2 ммоль/л L-глутамина, 10 ммоль/л бета-глицеролфосфата (Sigma-Aldrich), 50 мкмоль/л аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich) и 100 нмоль/л дексаметазона (Sigma-Aldrich). В ходе осуществления протокола дифферен-цировки (в 1—21-й дни) клетки обрабатывали АА в концентрации 5—10 мкмоль/л (Selleckem) или балластным веществом в качестве контроля.

Все культуральные среды, факторы роста, цито-кины и АА меняли каждые 3—4 дня [18, 19].

Функциональный анализ ОКЛ

По окончании осуществления протокола диффе-ренцировки (12-й день) культуральную среду удаляли и клетки фиксировали в 4 % формальдегиде в течение 5 мин, а также окрашивали с использованием набора ТРКФ (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя. После этого подсчитывали окрашенные клетки (> 3 ядер) [20].

Активность ОКЛ оценивали посредством культивирования клеток на планшетах, покрытых синтетической неорганической матрицей, имитирующей

костную (Osteoassay, Corning). На 12-й день культивирования среду удаляли, а планшеты заполняли раствором натрия гипохлорида, чтобы оценить способность зрелых ОКЛ реабсорбировать этот субстрат; ямки, образованные в результате реабсорбционной активности ОКЛ, подсчитывали с использованием программного обеспечения ImageJ.

Функциональные анализы ОБЛ

На 21-й день клетки фиксировали в 4 % формальдегиде в течение 5 мин и окрашивали с использованием набора ЩФ (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя. Окрашивание ЩФ количественно оценивали с использованием программного обеспечения ImageJ.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Чтобы обнаружить отложение костной матрицы как маркера активности ОБЛ, клетки фиксировали в 4 % формальдегиде в течение 20 мин и окрашивали ализариновым красным в течение 1 ч при комнатной температуре. Флуоресценцию ализаринового красного регистрировали при длине волны 470 нм и количественно определяли с помощью спектрофлуориметра (Tecan Infinite M200Pro) [19].

Анализ МТТ

Жизнеспособность клеток оценивали с использованием набора определения роста клеток, анализа на основе МТТ (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя; оптическую плотность образовавшегося цветного комплекса определяли с использованием спектрофотометра при длине волны 570 нм с вычитанием фонового поглощения при длине волны 690 нм.

Экстракция РНК и анализ экспрессии генов

РНК экстрагировали из ОКЛ и ОБЛ по окончании протокола дифференцировки с использованием реагента Тризола (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. РНК обрабатывали буфером ДНКазы и ДНКазой (DNAse Turbo, Эпплайд Байо-системз), чтобы избежать контаминации геномной ДНК. Комплементарную ДНК получали с использованием набора обратной транскрипции (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями производителя. Уровни мРНК измеряли при помощи количественной ПЦР в реальном времени с использованием тестов экспрессии генов TaqMan в рамках системы «7900HT» ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems). Уровни экспрессии TRAP (Hs00356261_ ml), катепсина-К (Hs00166156_m1), ММП-9 (Hs00234579_m1), ЩФ (Hs01029144_m1), остеокаль-цина (Hs00234160_m1) и фактора транскрипции-2, содержащего домен Runt (RUNX2) (Hs00 231 692_m1), были нормализованы по эндогенному конститутивному гену глюкуронидазы-бета (GUSb) (Hs99 999 908_m1) в образцах, подвергавшихся и не подвергавшихся обработке, с расчетом Д СТ. Затем относительные уровни экспрессии в обработанных образцах были нормали-

зованы по уровням мРНК, обнаруженным в контрольных образцах, с расчетом Д Д CT [21].

Экстракция белка и анализ вестерн-блот

Клеточные лизаты получали с использованием анализа буфера радиоиммунопреципитации (анализа RIPA) (Sigma-Aldrich) и количественно оценивали с использованием набора для анализа белков DC (совместимость с детергентом) (Bio-Rad). Из каждого образца 20 мг общего белкового экстракта загружали в 8 %/15 % полиа-криламидный гель с додецилсульфатом натрия и переносили на нитроцеллюлозные мембраны с использованием системы передачи Trans-Blot Turbo Transfer (Bio-Rad) и инкубировали в блокирующий буфер (TBST 1X с 5 % обезжиренным сухим молоком) в течение 1 ч. Мышиные моноклональные антитела к катеп-сину К (Santa Cruz Biotechnologies), кроличьи поликло-нальные антитела к остеокальцину человека (Santa Cruz Biotechnologies) и мышиные антитела к актину-бета человека (Sigma-Aldrich) инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Применяли антикроличьи/антимышиные антитела, конъюгированные с пе-роксидазой хрена (Abcam), а хемилюминесцентный сигнал обнаруживали с использованием программного обеспечения ChemiDoc (Bio-Rad) и Quantity One (BioRad) для подсчета интенсивности сигнала зон.

Пациенты

Проводили проспективное обследование пациентов с мКРРПЖ с метастазами в кости в состоянии клинического прогрессирования после лечения с применением доцетаксела, включенных в расширенную программу получения АА в отделении медицинской онкологии Больницы Сан-Луиджи (Орбассано). АА применяли в дозе 1000 мг в день в комбинации с преднизолоном в дозе 5 мг 2 раза в день и аналогами лютеинизирующего гормона рилизинг-гормона до рентгенологического прогрессирования. Подгруппа пациентов получала также лечение золедроновой кислотой в стандартных неизменных дозах в последние 3 мес до начала применения АА. Всех пациентов обследовали на предмет образования и резорбции костной ткани.

Уровни ЩФ в сыворотке в качестве маркера активности ОБЛ и CTX в сыворотке в качестве маркера резорбции костей оценивали каждые 3 мес в центральной лаборатории Больницы Сан-Луиджи Орбассано. Общий уровень ЩФ определяли с помощью стандартных автоматизированных аналитических процедур (Architect, Abbott), нормальный диапазон составлял от 30 до 120 Ед/л. Уровни CTX в сыворотке измеряли с помощью коммерческого набора для иммунофер-ментного анализа (IDS-ISYS CTX—I, Immunodiagnostic Systems Ltd.). Нормальные значения, минимальные определяемые концентрации, внутри- и межтестовые коэффициенты вариации CTX были следующими: 0,12—0,75; 0,023 нг/мл; 3,2 и 6,3 % соответственно.

CS

U

«X U

N «r

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

CS

Статистический анализ

Данные, полученные in vitro, анализировали с использованием t-критерия Стьюдента и однофак-торного вариационного анализа ANOVA с последующими многократными сравнительными тестами Тьюки. Обработка графиков и статистические тесты проводили с использованием программы GraphPad Prism.

При анализе маркеров использовали парный знаковый ранговый критерий Вилкоксона для сравнения парных данных исходно, а также по прошествии 3, 6 и 9 мес лечения. Все сообщаемые величины р были двусторонними; величины р < 0,05 были выбраны при определении статистической значимости. Статистический расчет проводили с использованием пакета программ SPSS для операционной системы Windows.

u et

U

Благодарность

Благодарим доктора Франческу Агостини из лаборатории клеточных культур кафедры биомедицины и профилактики Университета Тор Вергата за предоставленные МСКЧ.

Финансирование

Исследование проводилось без каких-либо сторонних финансовых средств или грантов.

N

Конфликт интересов

Авторы статьи не заявляют о каком-либо конфликте интересов.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Santini D., Galluzzo S., Zoccoli A. et al. New molecular targets in bone metastases. Cancer Treat Rev 2010;36(Suppl 3):6-10.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

2. O'Donnell A., Judson I., Dowsett M. et al. Hormonal impact of the 17alpha-hydroxylase/C(17,20)-lyase inhibitor Abiraterone acetate (CB7630) in patients with prostate cancer. Br J Cancer 2004;90:2317- 25.

3. Barrie S.E., Potter G.A., Goddard P.M. et al. Pharmacology of novel steroidal inhibitors of cytochrome P450(17) alpha (17 alpha-hydroxylase/C17-20 lyase).

J Steroid Biochem Mol Biol 1994;50:267-73.

4. De Bono J.S., Logothetis C.J., Molina A. et al. AA and increased survival

in metastatic prostate cancer. N Engl J Med 2011;364:1995-2005.

5. Fizazi K., Scher H.I., Molina A. et al. Abiraterone acetate for treatment

of metastatic castration-resistant prostate cancer: final overall survival analysis of the COU-AA-301 randomised, double-blind, placebo-controlled phase III study. Lancet Oncol 2012;13:983-92.

6. Ryan C.J., Smith M.R., de Bono J.S.

et al. AAraterone in metastatic prostate cancer without previous chemotherapy. N Engl J Med 2013;10;368:138-48.

7. Kawano H., Sato T., Yamada T. et al. Suppressive function of androgen receptor in bone resorption. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:9416-21.

8. Wiren K.M., Semirale A.A., Zhang X.W. et al. Targeting of androgen receptor

in bone reveals a lack of androgen anabolic

action and inhibition of osteogenesis: a model for compartment-specific androgen action in the skeleton. Bone 2008;43:440-51.

9. Chiang C., Chiu M., Moore A.J. et al. Mineralization and bone resorption are regulated by the androgen receptor in male mice. J Bone Miner Res 2009;24:621-31.

10. Falahati-Nini A., Riggs B.L., Atkinson E.J. et al. Relative contributions of testosterone and estrogen in regulating bone resorption and formation in normal elderly men. J Clin Invest 2000;106:1553-60.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

11. Kousteni S., Chen J.R., Bellido T. et al. Reversal of bone loss in mice by nongenotropic signaling of sex steroids. Science 2002;298:843-6.

12. Kousteni S., Bellido T., Plotkin L.I. et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell 2001;104:719-30.

13. Duc I., Bonnet P., Duranti V. et al.

In vitro and in vivo models for the evaluation of potent inhibitors of male rat 17alpha-hydroxylase/C17,20-lyase. J Steroid BiochemMol Biol 2003;84:537-42.

14. Richards J., Lim A.C., Hay C.W. et al. Interactions of AAraterone, eplerenone, and prednisolone with wild-type and mutant androgen receptor: a rationale for increasing AAraterone exposure or combining with MDV3100. Cancer Res 2012;72:2176-82.

15. van Soest R.J., van Royen M.E.,

de Morree E.S. et al. Cross-resistance between taxanes and new hormonal agents AAraterone and enzalutamide may affect drug sequence

choices in metastatic castration-resistant prostate cancer. Eur J Cancer 2013;49: 3821-30.

16. Bruno R.D., Gover T.D., Burger A.M. et al. 17alpha-hydroxylase/17, 20 lyase inhibitor VN/124-1 inhibits growth

of androgen-independent prostate cancer cells via induction of the endoplasmic reticulum stress response. Mol Cancer Ther 2008;7:2828-36.

17. Hamamura K., Tanjung N., Yokota H. Suppression of osteoclastogenesis through phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2 alpha. J Bone Miner Metab 2013;31:618-28.

18. Susa M., Luong-Nguyen N.H., Cappellen D. et al. Human primary osteoclasts: in vitro generation

and applications as pharmacological and clinical assay. J Transl Med 2004;2:6.

19. He W., Mazumder A., Wilder T., Cronstein B.N. Adenosine regulates bone metabolism via A1, A2A, and A2B receptors in bone marrow cells from normal humans and patients with multiple myeloma. FASEB J 2013;27:3446-54.

20. Yen M.L., Hsu P.N., Liao H.J. et al. TRAF-6 dependent signaling pathway is essential for TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) induces osteoclast differentiation. PLoS One 2012;7:e38048.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

21. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001;25: 402-8.