CC BY
178
УДК 582.688.4-15(571.6)
О.И. Молканова, Н.В. Козак, Л.Н. Коновалова, Е.В. Малаева
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ВИДОВ РОДА ACTINIDIA LINDL.
Представлены основные этапы формирования и перспективы дальнейшей работы с уникальной коллекцией (включающей около 200 образцов) дальневосточных видов актинидии Actinidia Lindley Центра сохранения, поддержания и изучения генофонда ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии (до 2006 г. Московское отделение ВИР им. Н.И. Вавилова). На основе многолетних исследований показано, что дальневосточные виды актинидии успешно интродуцированы в Подмосковье. Наряду с традиционными методами сохранения растений ex situ применение культуры изолированных тканей и органов становится все более и более актуальным. Цель наших исследований - совершенствование технологии клонального микроразмножения, изучение морфогенетических процессов и создание банка in vitro дальневосточных видов актинидии. Обьектами исследования были представители рода Actinidia - A. kolomikta (Rupr. et Maxim.) Maxim., A. arguta Planch. и A. polygama (Siebold et Zucc.) Maxim. Методы исследования основывались на классических приемах работы с культурами изолированных тканей и органов растений. В результате установлено, что разработка эффективных методов устойчивого воспроизводства растений является основой работ по сохранению генофонда. На основе массового скрининга разработаны высокоэффективные технологии клонального микроразмножения представителей рода Actinidia. Хранение in vitro ценных форм растений является высокоэффективным способом для содержания коллекций растений и сохранения биологического разнообразия. Подобраны оптимальные условия для длительного хранения меристем представителей рода Adtinidia в генетическом банке культур in vitro (t°=5-7 °C). Установлены важнейшие факторы, влияюшие на длительность сохранения в условиях in vitro.
Ключевые слова: актинидия, коллекция, интродукция, клональное микроразмножение, охранение биоразнообразия in vitro.
Коллекция актинидии Центра сохранения, поддержания и изучения генофонда ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии (до 2006 г. Московское отделение ВИР им. Н.И. Вавилова) является наиболее представительной в России. Некоторые образцы в ее составе представлены единичными экземплярами. Поэтому актуальным становится использование современных биотехнологических методов для сохранения и устойчивого воспроизводства генофонда этой культуры.
Создание, поддержание и пополнение коллекций дикорастущих и культурных растений является наиболее эффективным путем сохранения и рационального использования биологического разнообразия растений. Наиболее эффективный путь его сохранения - создание генетических банков растений.
Материалы и методы исследований
Анализ структуры коллекции проводили на 195 образцах. Анализ биохимических данных плодов актинидии проведен в лаборатории хроматографии ВНИИ консервной и овощесушильной промышленности в соответствии с существующими ГОСТами.
Методика биотехнологических исследований основывалась на общепринятых классических приемах работы с культурами изолированных тканей и органов растений [1].
В качестве первичных эксплантов использовали апикальные и латеральные почки в фазе активного роста. Для культивирования регенерантов применяли минеральную основу питательной среды MS [2]. В качестве регуляторов роста на стадии пролиферации использовали: Z (0,5 - 1 мг/л), Zr (1,0 мг/л), 6-BAP (0,5 - 1,0 мг/л), 6-BAPr (1,0 мг/л), TDZ (0,02 - 0,05 мг/л), 2iP (3,0 - 5,0 мг/л), K (0,5 - 1,0 мг/л); на стадии укоренения - IAA и IBA (1,0 - 3,0 мг/л). Контроль - питательная среда, не содержащая гормональных добавок.
В процессе биотехнологических исследований измеряли длину побегов, корней и рассчитывали коэффициент размножения и процент укорененных растений.
Математическую обработку экспериментальных данных осуществляли стандартными методами [3] с использованием пакета программ Microsoft Office.
Результаты и их обсуждение
С 1980 г. по 2008 г. в бывшем Московском отделении ВИР им. Н.И. Вавилова (ныне Центр сохранения, поддержания и изучения генофонда ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии) под руководством Э.И. Колбасиной была проведена большая работа по сбору и формированию уникальной коллекции редких плодовых лиан рода актинидия [4-6]. Род Актинидия (Actinidia Lindle., семейство Actinidiaceae Van-Tieghеm.) объединяет более 36 видов. Природные формы в коллекции представлены экспедиционными образцами А. Ыот1Ыа, А. а^Ша, А. polygama из различных точек ареалов. При этом указанные таксоны интродуцированы из генцентров, где сосредоточено наибольшее генетическое разнообразие представителей рода Actinidia. Большинство семян коллекционных образцов собраны из плодов дикорастущих лиан в Приморье, на Курильских островах, о. Сахалин и в экспедициях по областям Центральной Черноземной зоны РФ, Нечерноземью, Украине с 1981 г. по 1988 г. Эта коллекция является самой крупной и представительной в России (табл. 1).
Таблица 1
Количественный состав и происхождение образцов в коллекции актинидии в 2013 году
Название вида Всего, шт. Происхождение
Европейская часть Дальний Восток
шт. % шт. %
Actinidia kolomikta 110 62 56,4 48 43,6
Atinidia arguta 57 34 59,6 23 40,4
Atinidia arguta var. giraldii 4 0 0 4 100
Actinidia purpurea 4 4 100 0 0
Actinidia polygama 20 3 15 17 85
Коллекция включает всего 195 образцов из 4 видов и 1 подвида рода Actinidia. Первые три вида произрастают в природных условиях на Дальнем Востоке России, один вид, актинидия пурпурная, интродуцирован из Китая. Более половины образцов актинидии составляют окультуренные формы, собранные в европейской части РФ и в Украине. В большинстве это первая или вторая генерация растений в культуре, прошедших этап стихийной народной селекции. Многолетние наблюдения показали, что растения вышеперечисленных видов актинидии успешно интродуцированы в условиях Московской области [7].
В процессе изучения коллекционного материала выявлены новые перспективные формы и образцы с комплексом хозяйственно-ценных признаков. Выделенным образцам были присвоены постоянные номера каталога ВИР. Они являются полезными источниками для использования в селекционной работе [8].
В коллекции представлены сорта основных селекционных центров, отражающие разные периоды селекции: от созданных основоположником селекции актинидии в России И.В. Мичуриным до современных сортов, созданных под руководством Э.И. Колбасиной. На основе отбора элитных сеянцев Э.И. Колбасиной были получены 27 сортов А. kolomikta: Вафельная, Виноградная, Гладкая, Дальневосточная, Изобильная, Изящная, Командир, Королева Сада, Лакомка, Марица, Мармеладка, Мома, Монетка, Народная, Незнакомка, Парковая, Плоская, Праздничная, Прелестная, Приусадебная, Ранняя Заря, Сластёна, Сорока, Университетская, Фантазия Садов (из них 11 - в соавторстве), а также сорта А. а^Ма - Приморская и А. polygama - Абрикосовая, которые включены в Госреестр РФ с 1998 г.
В 2013 г. были получены авторские свидетельства и патенты на новые сорта А. kolomikta: Надежда, Памяти Колбасиной, Услада, Чемпион, Элла. Проводится дальнейшая работа по сбору образцов для пополнения коллекции новыми образцами и углубленное изучение имеющихся форм.
Плоды актинидии содержат большое количество витаминов, биологически активных веществ, макро- и микроэлементов [5]. Проведен анализ биохимических данных плодов некоторых представителей дальневосточных видов Actinidia. Наиболее высоким содержанием аскорбиновой кислоты в плодах по сравнению с другими изученными видами рода характеризуется А. kolomikta. Установлено, что у 55 % сортов этого вида коллекции содержание витамина С превышает 1500 мг/ 100 г сырой массы. У некоторых сортов этого вида, например Услада, содержание витамина С варьирует от 1600 до 1900 мг/100 г, а у сорта Чемпион от 1824 до 2200 мг/100 г сырой массы плодов соответственно. Наи-
большее количество веществ Р-активности содержится в плодах A. arguta (до 55 мг/100 г сырой массы), высоким содержанием каротиноидов (до 6,4 мг/100 г), в том числе Р-каротина (до 4,47 мг/100 г) отличаются плоды A. polygama.
Коллекция Центра сохранения, поддержания и изучения генофонда ГНУ ВСТИСП Россельхо-закадемии является уникальным собранием представителей рода Actinidia, отражающим существующий генофонд культуры.
В настоящее время для сохранения и устойчивого воспроизводства коллекций растений наряду с традиционными способами актуально использование биотехнологических приемов. При этом разработка эффективных методов клонального микроразмножения является основой подобных исследований.
Известно, что существует комплекс факторов, каждый из которых в отдельности и в сочетании с другими оказывает значительное влияние на развитие клеточных и тканевых систем in vitro. Среди них наиболее важными являются тип экспланта, физиологическое состояние донорных растений, условия культивирования растений in vitro, состав питательных сред и др. При этом степень влияния каждого из названных факторов зависит от генотипа [9].
Одним из наиболее ответственных этапов работы по культуре ткани является выбор сроков изоляции экспланта. В результате проведенных исследований установлено, что оптимальным сроком изоляции эксплантов актинидии является фаза начала активного роста (апрель-май). Выход жизнеспособных эксплантов при этом составил 83 %.
На регенерационную способность в культуре изолированных апексов, а также на коэффициент размножения in vitro существенное влияние оказывают генетические особенности видов и сортов. Выявлено, что экспланты A. arguta и A. polygama развивались более активно по сравнению с A. kolomikta (табл. 2), и это коррелирует с энергией роста этих видов в природных условиях. Подобную тенденцию мы наблюдали у представителей рода Syringa [10].
Таблица 2
Морфометрические показатели регенерантов видов актинидии на стадии микроразмножения
(среда MS с добавлением 0,5 мг/л 6-BAP)
Название вида Число побегов, шт Длина побегов, см Коэффициент размножения
Actinidia kolomikta 1,8±0,9 3,1±1,3 3,1±0,7
Actinidia arguta 2,4±1,1 4,2±1,1 4,6±0,3
Actinidia polygama 3,2±1,3 5,1±1,4 5,7±0,4
Установлено, что различия в реализации морфогенетического потенциала между вышеуказанными видами существовали как на стадиях инициации, так и пролиферации.
В рамках настоящего исследования также были изучены морфометрические показатели и коэффициент размножения модельных сортов Actinidia kolomikta, A. arguta и A. polygama на среде, содержащей 0,5 мг/л 6-BAP (рис. 1).
По коэффициенту размножения у A. kolomikta установлены существенные различия между сортами Приусадебная, Изобильная и Мома. Среди исследованных сортов A. arguta Великанша и Ребристая значительно превышают значение этого показателя у сортов Золотая Коса и Сладкий. В пределах сортов, созданных на основе A. polygama, только сортообразец Бета существенно отличается по коэффициенту размножения от других исследованных генотипов.
Таким образом, на коэффициент размножения актинидии in vitro существенное влияние оказывают как видовые, так и сортовые особенности. Это соответствует данным исследователей, полученным на других культурах [1; 11].
Наряду с генотипом значительное влияние на реализацию морфогенетического потенциала оказывают компоненты питательной среды, особенно фитогормоны. При изучении влияния различных цитокининов на морфогенез in vitro выявлено, что важным является правильный выбор цитокинина [11; 12].
Проведено изучение влияния типа и концентрации цитокининов в составе питательной среды на коэффициент размножения некоторых видов и сортов актинидии (рис. 2).
Рис. 1. Коэффициент размножения модельных сортов Actinidia kolomikta, A. arguta и A. polygama
Ш A kolomikta В A arguta □ A polygama
Рис. 2. Влияние типа и концентрации цитокинина на коэффициент размножения некоторых
представителей рода Actinidia Условные обозначения: 1 - контроль, без гормонов; 2 - Z 0,5 мг/л; 3 - Z 1,0 мг/л; 4 - Zr 1,0 мг/л; 5 - 6-BAP 0,5 мг/л; 6 - 6-BAP 1,0 мг/л; 7 - 6-BAPr 1,0мг/л; 8 - TDZ 0,02 мг/л; 9 - TDZ 0,05 мг/л; 10 - 2iP 3,0 мг/л; 11 - 2iP 5,0 мг/л; 12 - К 0,5 мг/л; 13 - К 1,0 мг/л
Установлено, что все исследованные фитогормоны (за исключением К) в целом обеспечивали увеличение коэффициента размножения изученных генотипов.
Сравнительный анализ изучения влияния различных цитокининов показал, что под воздействием 2iP коэффициент размножения A. kolomikta и A. arguta, а также среднее число междоузлий на побег существенно превышали значение этих показателей на средах с 6-BAP. Коэффициент размножения варьировал от 3,1 до 4,8 для A. kolomikta и от 4,7 до 6,8 - для A. аrguta.
Для Actinidia polygama отмечены максимальные показатели коэффициента размножения и количества междоузлий на средах, содержащих 6-BAP (0,5 мг/л) или Z (1 мг/л). Показатели на данных средах варьировали от 3,9 до 6,7 (коэффициент размножения) и от 5,8 до 7,2 (среднее число междоузлий на побег) соответственно.
Содержание в среде зеатина увеличивало коэффициент размножения у всех исследуемых образцов актинидии, одновременно стимулируя образование каллуса, что впоследствии затрудняло адаптацию растений in vivo.
Установлено также, что коэффициент размножения растений-регенерантов актинидии в процессе культивирования существенно изменяется (рис. 3).
Отмечена общая для всех изучаемых видов тенденция: на первых пассажах коэффициент размножения постепенно возрастал, достигая наибольших значений на 3-5-м субкультивированиях, снова снижаясь на 6-7-м пассажах.
Максимальный коэффициент размножения Actinidia kolomikta и A. arguta отмечен на 3-м субкультивировании, A. polygama - на 4-м.
Актинидия относится к культурам относительно легко укореняемым в условиях in vitro. По-видимому, проявляются внутренние механизмы регуляции процесса укоренения, выработанные видами в процессе эволюции.
Рис. 3. Зависимость коэффициента размножения различных видов актинидии от числа
субкультивирований
1 2 3 4 5 6
варианты питательных сред
S A. kolomikta 0 A.arguta ED A.polygama
Рис. 4. Влияние ауксинов на укореняемость микропобегов различных видов актинидии. Условные обозначения: 1 - 1 мг/л IBA; 2. - 2 мг/л IBA; 3 - 3 мг/г IBA; 4 - 1 мг/л IAA; 5 - 2 мг/л IAA;
6 - 3 мг/л IAA
Результаты экспериментов по подбору питательных сред на этапе укоренения показывают значительные отличия скорости укоренения в зависимости от типа и концентрации ауксинов, применяемых для индукции ризогенеза.
Изучение особенностей укоренения актинидии в культуре in vitro выявило преимущество IAA по сравнению с IBA (оптимальная концентрация IAA - 1,0 мг/л) (рис. 4).
На стадии адаптации сохранялась тенденция опережения роста и развития Actinidia polygama и A. arguta по сравнению с A. kolomikta. Выход адаптированных растений составил 80-95 %.
В ходе исследований подобраны оптимальные условия для сохранения образцов актинидии в генетическом банке in vitro - питательная среда MS, с половинным содержанием минеральных солей, дополненная 6-BAP, в концентрации 0,1 мг/л при температуре 5-7 °С. При таких условиях культивирования сохраняется жизнеспособность эксплантов, замедляется процесс роста микропобегов и длительность беспересадочного культивирования составляет 7-9 месяцев.
Выводы
Коллекция Центра сохранения, поддержания и изучения генофонда ГНУ ВСТИСП Россельхо-закадемии является уникальным собранием представителей рода Actinidia, отражающим существующий генофонд культуры. Растения дальневосточных видов рода Actinidia успешно интродуцированы в Подмосковье.
Установлено, что экспланты Actinidia arguta и A. polygama развиваются более активно на всех стадиях клонального микроразмножения по сравнению с A. kolomikta, и это коррелирует с энергией роста вышеназванных видов в природных условиях.
Оптимизирована методика микроклонального размножения представителей рода Actinidia. Выявлено, что оптимальной для размножения A. kolomikta и A. arguta является питательная среда MS, дополненная 2iP (5 мг/л), а для A. polygama - 6-BAP (0,5 мг/л) или Z (1 мг/л), для укоренения - дополненная IAA (1 мг/л).
Создана коллекция in vitro видов, сортообразцов и форм актинидии (около 70 наименований) и банк ДНК (47 наименований), куда вошли наиболее ценные образцы коллекции Центра сохранения, поддержания и изучения генофонда ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.
2. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. plant. 1962. N 15. Р. 473-497.
3. Доспехов Б.А Методика опытного дела. М.: Агропромиздат, 1985. 351 с.
4. Колбасина Э.И. Актинидия и лимонник в России (биология, интродукция, селекция). М.: Россельхозакаде-мия, 2000. 264 с.
5. Колбасина Э.И., Соловьёва Л.В., Тульнова Н.Н., Козак Н.В., Скрипченко Н.В., Мороз П.А., Корчемная Н.А., Гвоздецкая А.И. Культурная флора России. Т.: Актинидия. Лимонник. М.: Россельхозакадемия, 2008. 327 с.
6. Колбасина Э.И., Козак Н.В., Темирбекова С.К., Корчемная Н.А., Гвоздецкая А.И. Генофонд Актинидии (Actinidia Lindl.) в России. М.: Россельхозакадемия, 2008. 74 с.
7. Козак Н.В. Интродукция редких ягодных культур в Подмосковье // Культурные растения для устойчивого сельского хозяйства в XXI веке (иммунитет, селекция, интродукция): науч. тр. М.: РАСХН. 2002. С. 268-278.
8. Козак Н.В. Итоги селекции актинидии и лимонника в МО ВИР // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. тр. ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии. 2009. Т. XXI. С. 160-167.
9. Орлов П.А. Клеточные и генно-инженерные технологии модификации растений. Минск: Тонпик, 2006. 248 с.
10. Молканова О.И., Спиридович Е.В., Коновалова Л.Н., Брель Н.Г., Зинина Ю.М., Решетников В.Н. Комплексное изучение интродуцированных видов и сортов рода Syringa L. в ГБС РАН и ЦБС НАН Беларуси // Вестн. Удм. ун-та. Сер. Биология. Науки о Земле. 2011. Вып. 2. С. 66-73.
11. Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного материала плодовых и ягодных растений: автореф. ... д-ра биол. наук. М., 1998. 44 с.
12. Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур: автореф. . д-ра биол. наук. Ялта, 2007. 40 с.
Поступила в редакцию 30.01.14
O.I. Molkanova, N. V. Kozak, L.N. Konovalova, E. V. Malaeva
BIOLOGICAL PECULIARITIES OF FAR EASTERN SPECIES OF THE GENUS ACTINIDIA LINDL.
This research presents the main stages of the definition and the prospects of further work with the unique collection of selected forms of Far Eastern species of Actinidia Lindley (about 200 samples) kept in the All-Russian Horticultural Institute Breeding, Grotechnology and Nursery, Russian Academy of Agricultural Sciences. On the basis of long-term investigations it is shown that Far Eastern species of Actinidia Lindley have been successfully introduced in Moscow region. Alongside with the йМШош1 mettods оf plant preservatwn ex situ the applicatwn оf isоlated tissue and оrgan cultures is beaming mоre and mоre actual. The purpose of our research is to improve the clonal micropropagation technology, to study the morphogenetic processes in the course of propagation and to create the bank and of in vitro cultures of Far Eastern species of Actinidia Lindley. The objects of our research were Actinidia - A. kolomikta (Rupr. et Maxim.) Maxim., A. arguta Planch. и A. polygama (Siebold et Zucc.) Maxim. Our research methods are based on the classical ways of working with cultures of isolated organs and tissues of plants. In the result it has been found out that the development of effective methods for sustainable reproduction of plants is the basis of the work on preserving the plant gene bank. Based on mass screeninghighly efficient technologies of clonal micropropagation of various taxonomic group of Actinidia have been developed. Storage in vitro of valuable plant forms is a highly efficient way for mainten-ing plant collections and conservation of plant biodiversity. Optimal conditions for long-term storage of the genus Acti-nidia meristems in gene bank cultures in vitro (t0 = 5-70C) have been found. The critical factors affecting the duration of preservation conditions in vitro have been determined.
Keywords: collection, Actinidia, introduction, selection, donalmicropropagation, conservation of plant biodiversity.
Молканова Ольга Ивановна, кандидат биологических наук, зав. лаб. биотехнологии растений E-mail: molkanova@mail.ru
Коновалова Людмила Николаевна, младший научный сотрудник E-mail: new_tech_@mail.ru
Учреждение Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН 127276, Россия, г. Москва, ул. Ботаническая, 4
Козак Наталья Васильевна, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
ГНУ Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии
115598, Россия, г. Москва, ул. Загорьевская, 4 E-mail: vstisp.vstisp@mail.ru
Малаева Елена Викторовна,
кандидат биологических наук, зам. директора по науке ГБУ ВО «Волгоградский региональный ботанический сад» 400007, Россия, г. Волгоград, пос. Металлургов, 68 E-mail: e.malaeva@mail.ru
Molkanova O.I., Candidate of Biology,
The head of the plant biotechnology laboratory E-mail: molkanova@mail.ru
Konovalova, L.N., junior research scientist E-mail: new_tech_@mail.ru
Main botanical garden of Russian academy of science Botanicheskaya st., 4, Moscow, Russia, 127276
Kozak N.V.,
Candidate of Agriculture, senior research scientist
All-Russian Horticultural Institute Breeding, Grotechnology and Nursery, Russian Academy of Agricultural Sciences
Zagor'evskaya str., 4, Moskow, Russia, 4115598 E-mail: vstisp.vstisp@mail.ru
Malaeva E.V.,
Candidate of Biology, Deputy Director on science Volgograd Regional Botanical Garden Metallurgov, 68, Volgograd, Russia, 400007 E-mail: e.malaeva@mail.ru
