БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МНОГОСЛОЙНЫХ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК ПРИ ЛЕГОЧНОЙ ЭКСПОЗИЦИИ IN VIVO Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Токсикологический вестник (121)

УДК 54.1: 615.91

Биологические эффекты многослойных углеродных нанотрубок при легочной экспозиции in vivo

Т.О. Халиуллин1, Е.Р. Кисин2, Р.Р. Залялов1, А.А. Шведова2, Л.М. Фатхутдинова1

1ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Минздрава РФ», 420111, г. Казань 2National Institute for Occupational Safety and Health, NIOSH, 26505, Morgantown, USA

Однократное введение 40 мкг многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) мышам линии C57BL/6 методом фарингеальной аспирации привело к возникновению локального воспалительного ответа с развитием фибротического процесса в ткани легкого. Воспалительные изменения характеризовались значительным увеличением, по сравнению с контролем, количества нейтрофилов в лаважной жидкости, повышением общего белка, уровня

лактат-дегидрогеназы и цитокинов IL-6, MCP-1, TNF-Э. через 24 часа после экспозиции. Был показан фиброгенный потенциал исследуемых МУНТ, что подтверждается высоким уровнем TGF-b с 7-го дня и до конца эксперимента. В легких обнаружены гранулемы и участки фиброза (28-й день). Полученные данные не исключают возможности развития системного ответа. Предполагая наличие потенциального риска здоровью работников, подвергающихся воздействию аэрозоля МУНТ на рабочих местах, считаем, что необходимы дальнейшие исследования, которые позволят определить класс опасности, допустимые уровни и необходимость отнесения МУНТ, как отдельных аллотропных модификаций углерода, к веществам (аэрозолям) преимущественно фиброгенного действия.

Ключевые слова: углеродные нанотрубки; фиброз, in vivo, легочная экспозиция.

Введение. Углеродные нанотрубки (УНТ) представляют собой свернутые листы графена (двумерная аллотропная модификация углерода). В зависимости от количества структурообразующих листов графена принято выделять одно- и многослойные УНТ. Спектр возможного применения этих наночастиц весьма широк - по прочностным характеристикам они превосходят сталь, обладают высокой тепло- и электропроводностью [1]. Сегодня в мире наблюдается стабильное увеличение количества предприятий наноиндустрии, в том числе и тех, что имеют дело с углеродными на-нотрубками. Мировой рынок УНТ достиг $192 миллионов в 2011 году. В 2012 году ожидаемый совокупный доход составляет $239 миллионов долларов. Динамика рынка дает основания предполагать рост до $527 миллионов долларов в 2016 году со среднегодовым темпом 22,4% [2].

Предварительное изучение этого сегмента отрасли наноиндустрии (анкетный опрос, интервью во время международных выставок, проводимых под эгидой ОАО «РОСНАНО») показало, что производство УНТ в России представлено в основном малыми предприятиями с числом работающих до 20 человек, из них около половины работников потенциально подвержены воздействию аэрозолей УНТ на рабочих местах. Ингаляционный путь поступления в организм для аэрозолированных УНТ на рабочих местах представляется наиболее вероятным, в сравнении с перкутанным и пероральным [3].

Целью исследования было изучить фиброгенный потенциал исследуемых МУНТ в ходе аспирационного эксперимента на животных.

Материалы и методы исследования. В качестве объекта исследования были выбраны многослойные углеродные нанотрубки, полученные промышленным методом каталитического осаждения паров. Физико-химические характеристики МУНТ приведены в таблице 1.

Для исследований были взяты двухмесячные мыши линии C57BL/6J (Jackson laboratories), самки, масса тела 18±2 г. Животные были разделены на контрольную и опытную группы по 30 мышей в каждой. Работа с экспериментальными животными соответствует нормативной отечественной документации [4]. Экспонированная группа получила путем фарингеальной аспирации 40 мкг МУНТ; контрольной группе тем же способом был введен фосфатно-буферный раствор (ФБР).

Затравка была осуществлена методом фарингеальной аспирации (ФА). Мыши были анестезированы 0,1%-ным раствором кетамина/ксилазина, после мышечного расслабления и потери подвижности мышь фиксировалась в вертикальной позиции, язык оттягивался пинцетом, к корню языка помещались 40 мкл суспензии МУНТ в ФБР (1мг/мл), которые затем рефлекторно вдыхались животным. При квалифицированном проведении процедуры практически весь объем затравочного материала поступает в дыхательные пути, минуя пищевод [5, 7]. Далее мышь наблюдалась в течение 3 минут и переносилась в клетку. Все мыши благоприятно перенесли проце-

дуру и восстановились в течение 30-45 минут.

В отличие от интратрахеальной инсталляции взвесей твердых частиц, фаринге-альная аспирация не приводит к обтурации просвета крупных бронхов. В частности, Lakatos и соавт. [5] провели сравнительный эксперимент на мышах (модель силикоза) и показали, что при интратрахеальной инстилляции происходила закупорка воздухоносных путей, возникали одиночные участки повреждения легочной ткани и фиброза; при использовании метода фарингеальной аспирации затравочный материал равномерно распределялся в объеме легких. Carrero-Sanchez и соавт. [6] наблюдали гибель животных при экспозиции МУНТ методом интратрахеального введения из-за закупорки воздухоносных путей.

Ранее Shvedova и соавт. [7] установили, что распределение УНТ в легких и ответные реакции организма животных при фарингеальной аспирации сопоставимы с ингаляционным экспериментом.

Затравочная доза в 40 мкг/мышь соответствует депонированной дозе 800 мкг на 1 м2 альвеолярного эпителия (площадь поверхности альвеолярного эпителия у мышей равна 0,05 м2 [8]). Специфических моделей депонирования УНТ в легких человека не существует, поэтому для установления ориентировочных депонированных доз применялась модель MPPD [9]. При расчете были использованы следующие входные данные: концентрация аэрозоля МУНТ 1500 мкг/м3, размер агломератов МУНТ 1,5 мкм, минутный объем дыхания 20 л/мин для легкой физической нагрузки [10]. Характеристики аэрозоля МУНТ, использованные в модели, основывались на результатах американских исследователей, которые установили, что диапазон концентраций для углеродных наноматериалов в воздухе рабочей зоны составляет 15-1800 мкг/м3, при этом УНТ быстро агломерируют в воздухе, образуя структуры с размерами 0,3^,5 мкм с медианным значением около 1,5 мкм [11, 12, 13]. В соответствии с этой моделью, с учетом поверхности альвеолярного эпителия человека 102 м2 [8], поверхностная депонированная доза в 800 мкг/м2 может накопиться в легких работника уже через 20-30 рабочих смен.

В каждой группе мыши были разделены на 3 подгруппы и подвергнуты эвтаназии на 1-й, 7-й и 28-й день после экспозиции путем инъекции летальной дозы пен-тобарбитала натрия.

Для проведения бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) эвтаназированное животное помещалось на операционный столик и фиксировалось булавками. Обнажалась трахея, в ней проделывалось отверстие, через которое вводилась канюля, фиксируемая далее нитью. Через канюлю легкие лаважировались однократно ледяным ФБР (0,8 мл) для первой порции и затем несколько раз (до 5 мл) для второй. Супернатант первой порции использовался для биохимических исследований, клеточный осадок первой и второй порций окрашивался по Романовскому-Гим-зе для подсчета клеток легких и оценки клеточного состава. В лаважной жидко-

Халиуллин Тимур Оскарович (Khaliullin Timur Oskarovich), кафедра гигиены , медицины труда ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, Khaliullin.40k@gmail.com

Кисин Елена Рафаиловна (Kisin Elena Rafailovna), acc^Tern; биолог, NIOSH,edk8@cdc.gov

Залялов Рамиль Равилевич (Zalyalov Ramil Ravilevich), канд. мед. наук, старший преподаватель кафедры общей гигиены ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, ramilzal@nm.ru

Шведова Анна Александровна (Shvedova Anna Aleksandrovna), доктор медицинских наук, руководитель лаборатории, NIOSH, ats1@cdc.gov Фатхутдинова Лилия Минвагизовна (Fatkhutdinova Liliya Minvagizovna), доктор мед. наук, профессор кафедры гигиены, медицины труда ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, liliafat@kcn.ru

17

и юл ь

- август 201 3

Таблица 1

Физико-химические характеристики МУНТ, взятых для острого аспирационного эксперимента (по данным предприятия-производителя и собственных исследований)

Физико-химические характеристики МУНТ Диапазон

Наружный диаметр, нм 8-15

Внутренний диаметр, нм 4-8

Длина, мкм 2 и более

Общий объем примесей, % до 5

Насыпная плотность, г/ см3 0,03-0,05

Удельная геометрическая поверхность, м2/г 300-320

Термостабильность, °С до 600

сти определялись лактатдегидрогеназа (ЛДГ), общий белок (ОБ), цитокины: IL-6,

MCP-1, TNF-a, IFN-y, IL-10, IL-12p70.

Забор крови производился после эвтаназии и вскрытия брюшной полости из

нижней полой вены. В сыворотке крови определялся TGF-Ъ.

У 5 мышей из каждой подгруппы легкие были извлечены, зафиксированы, гистологические срезы были окрашены гематоксилином-эозином, а также трихромом по Массону.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-теста для парных и непарных случаев (пакет Microsoft Excel 2010).

Результаты исследования. Экспонированные мыши имели в два раза меньший прирост массы тела в ходе эксперимента по сравнению с контрольной группой на 7-й и 28-й дни (рис. 1).

Однократная аспирация 40 мкг многослойных углеродных нанотрубок у мышей привела к возникновению локального воспалительного ответа, сменившегося развитием фибротических изменений в ткани легкого.

Через 24 часа после экспозиции наблюдалось значительное увеличение, по сравнению с контролем, количества нейтрофилов в лаважной жидкости, наряду с повышением общего белка, уровня ЛДГ и ряда воспалительных цитокинов - IL-6, MCP-1,

TNF4I (табл. 2).

На 7-й день имело место уже незначительное превышение маркеров воспаления по сравнению с контрольной группой, с приведением параметров к контрольному

уровню на 28-й день (цифровые данные не приведены). Уровень TGF-Ъ в сыворотке крови у экспонированных мышей увеличился в 2 раза к 7-му дню и оставался высоким вплоть до конца эксперимента (рис. 2).

На 28-й день гистологическая картина в легких характеризовалась наличием гранулем, в центре которых определялись агломерированные МУНТ, многочисленные альвеолярные макрофаги и фибробласты. Окраска трихромом по Массону выявила увеличение количества коллагеновых волокон (рис. 3).

В лаважной жидкости на 28-й день после экспозиции все еще наблюдалось большое количество макрофагов с хорошо заметными включениями МУНТ.

Обсуждение результатов. Значительный приток нейтрофилов в бронхоальвео-лярной жидкости через 24 часа после введения МУНТ совпал с увеличением уровней воспалительных цитокинов TNF-a, IL-6 и MCP-1(CCL-2), что свидетельствует о развитии локального воспалительного ответа. Похожие эффекты уже были описаны ранее: Erdely и соавт. [14] и Shvedova и соавт. [15] показали, что МУНТ и ОУНТ при фарингеальной аспирации у мышей вызывают значительно более выраженный воспалительный ответ, чем фуллерены и сажа в дозах 10^40 мкг/мышь. Изучив изменения в экспрессии генов крови тканей сердечно-сосудистой системы, Erdely и соавт. [14] указали на связь локального воспалительного ответа в результате попадания ОУНТ и МУНТ с системными нарушениями, в том числе развитием атеросклероза, причем в качестве посредников выступали цитокины (IL-6, IL-üb, IL-33, CCL-2, CCL-4, CCL-22, CXCL2 и др.). Обнаруженные нами изменения цитокиново-го профиля согласуются с данными Erdely и соавт. [14] и свидетельствуют в пользу гипотезы о системных эффектах легочной экспозиции УНТ.

Увеличение ЛДГ и уровня общего белка свидетельствуют о клеточных повреждениях и повышении проницаемости мембран. Изменения, обнаруженные в первый день, практически исчезли к 7-му дню, что может быть обусловлено стиханием первичной воспалительной реакции.

В то же время на 7-й день в сыворотке крови резко увеличилось содержание

TGF-Ъ по сравнению с контролем, данный уровень сохранялся вплоть до конца

эксперимента (28-й день). TGF-Ъ - это белок, секретируемый многими клетками, в том числе макрофагами и эпителием, участвующий в пролиферации, клеточной

дифференциации, апоптозе и во множестве других процессов, а также играющий роль в развитии фиброзов, опухолевых заболеваний, диабета, заболеваний сердечно-сосудистой системы и др. На сегодняшний день известны три его изоформы (Ъ1,

Ъ2, Ъз), в нашем исследовании у мышей оценивался уровень TGF-Ъl, аналогичный человеческому. В опытах [15] с однослойными углеродными нанотрубками было показано увеличение TGF-bl в бронхо-альвеолярной жидкости мышей, получивших 20-40 мкг ОУНТ, на 7-й день эксперимента одновременно с нарастанием количества макрофагов до пикового уровня и возвращение к норме к 28-му дню. Увеличение

содержания TGF-b совпало с обнаружением гранулематозных изменений в легких, участков фиброза с высоким содержанием коллагена (окраска трихромом по Массону). Обнаружение повышенных уровней TGF-b в сыворотке крови свидетельствует не только о локальных изменениях. По мнению некоторых авторов [16], этот белок, попадая в системный кровоток из легких в результате экспозиции к МУНТ, через циклооксигеназный путь ведет к повышению продукции простагландина и ]Ь-10, приводя в итоге к дисфункции Т-клеток и нарушениям в общем иммунитете.

Необходимо указать на ограничения исследования. Хотя выбранная для фа-рингеальной аспирации доза в 40 мкг соотносится с условиями производственной экспозиции с точки зрения депонирования МУНТ в легочной ткани, соответствие является достаточно условным, т.к. предполагается накопление дозы у человека, а мышь получает ту же дозу (в пересчете на 1 м2 эпителия) однократно. Тем не менее, даже после однократного введения, вплоть до конца эксперимента, в макрофагах, полученных из БАЛ экспонированных мышей и на гистологических срезах легких, микроскопически определялись скопления УНТ. Это может быть косвенным признаком персистирования исследуемых наночастиц. Об этом же говорят данные других исследователей [17, 18, 19, 20]. Таким образом, при условии равных депонированных доз можно предполагать сходные эффекты однократных и дробных экспозиций.

На основании наших данных и работ других авторов можно предположить наличие потенциального риска здоровью работников, подвергающихся воздействию аэрозоля МУНТ на рабочих местах. Необходимы дальнейшие исследования, включая хронические ингаляционные эксперименты и эпидемиологические наблюдения.

Заключение. Исследуемые МУНТ обладают провоспалительным потенциалом, вызывая кратковременный локальный воспалительный ответ.

Многослойные углеродные нанотрубки депонируются и сохраняются в легких мышей как минимум 28 дней, в том числе внутри альвеолярных макрофагов.

Был обнаружен фиброгенный потенциал исследуемых многослойных углеродных нанотрубок, что подтверждается высоким уровнем TGF-b с 7-го дня и до конца эксперимента и гистологической картиной наличия в легких гранулем и участков фиброза (28-й день).

Необходимы дальнейшие исследования, которые позволят определить класс опасности, допустимые уровни и необходимость отнесения УНТ, как отдельных аллотропных модификаций углерода, к веществам (аэрозолям) преимущественно фиброгенного действия.

18

Токсикологический вестник (121)

3 -| 2,5 -2 -

5 1.5 ^

I н

и

I 0,5

б о о.

£ -0,5 Н с

-1 -

-1,5 -

-2 -

Г

. I

МУНТ 40 мкг I Контроль

24 часа 7 день 28 день

Рис. 1. Средний прирост массы тела мышей в ходе эксперимента. * - р < 0.05

Таблица 2

БАЛ, 24 часа после экспозиции к МУНТ или ФБР

Нейтрофилы, % от общего числа клеток ЛДГ, пг/мл 11.-6, пг/мл МСР-1, пг/мл ТМР-а, пг/мл 11-10, пг/мл !Ы2р70, пг/мл !Р1Ч, пг/мл

МУНТ, 40 мкг 13±4,3* 69,1±1,9* 36,9±11,01* 30,3±6,5* 10,1±1,7* 44,9±5,4 29,6±8,5* 8,5±0,5

Контроль 0,6±0,23 34,7±1,1 3,2±0,47 19±0,42 6,3±0,7 44,5±1,1 12,4±3,2 8,7±0,5

Примечание. * р < 0,05.

19

и юл ь

- август 201 3

24 часа 7 дней

Рис. 2. Уровень TGF-b в сыворотке крови, пг/мл, * - р < 0,05

Контроль I МУНТ 40 мкг

28 дней

Рис. 3. Окраска среза легкого по Массону, 28-й день. МУНТ, 40 мкг, увеличение 40х

20

Токсикологический вестник (121)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Coleman, J.N., Khan, U., Blau, W.J., Gun'ko, Y.K. Small but strong: A review of the mechanical properties of carbon nanotube-polymer composites. Carbon. 2006; 44. P. 1624-1652.

2. Доклад Global Markets and Technologies for Carbon Nanotubes. BCC Research. Market forecasting. Available at: http://www.bccresearch.com/report/car-bon-nantubes-markets-technologies-nan024e.html

3. Donaldson K., Aitken R., Tran L., Stone V, Duffin R., Forrest G. et al. Carbon nanotubes: a review of their properties in relation to pulmonary toxicology and workplace safety. Toxicol Sci. 2006 Jul.; 92 (1). P. 5-22.

4. Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Утв. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 2 декабря 2009 г №544-ст. Доступ из справ.-правовой системы «ГАРАНТ».

5. Lakatos H.F., Burgess H.A., Thatcher T.H., Redon-netM.R., Hernady E., Williams J.P. et al. Oropharyn-geal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 2006 May; 32(5). P. 181-199.

6. Carrero-Sanchez J.C., Elias A.L., Mancilla R., Ar-rellin G., Terrones H., Laclette J.P. et al. Biocompat-ibility and toxicological studies of carbon nanotubes doped with nitrogen. Nano Lett. 2006 Aug; 6(8). P. 1609-1616.

7. Shvedova A.A., Kisin E., Murray A.R., Johnson V.J., Gorelik O., Arepalli S. et al. Inhalation vs. aspiration of single-walled carbon nanotubes in C57BL/6 mice: inflammation, fibrosis, oxidative stress, and muta-genesis. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 2008; Vol. 295(4).

P. 552-565.

8. Stone, K.C., Mercer, R.R., Gehr, P., Stockstill, B., Crapo, J.D. Allometric relationships of cell numbers

and size in the mammalian lung. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1992; Vol. 6. P. 235-243.

9. Human respiratory tract model for radiological protection. A report of a Task Group of the International Commission on Radiological Protection. Ann ICRP 1994; Vol. 24 (1-3). P. 1^82.

10. de Winter-Sorkina R., Cassee F.R. Multiple Path Particle Dosimetry Model (MPPD v 1.0): A Model for Human and Rat Airway Particle Dosimetry. National Institute for Public Health and the Environment (RIVM) Report; Bilthoven, Netherlands; 2002.

11. MethnerMM. Engineering case reports. Effectiveness of local exhaust ventilation (LEV) in controlling engineered nanomaterial emissions during reactor cleanout operations. J Occup Environ Hyg 2008; Vol. 5(6). P. 63-69.

12. Methner MM., BirchM.E.. Evans D.E. Case study: Identification and characterization of potential sources of worker exposure to carbon nanofibers during polymer composite laboratory operations. J. Oc-cup. Environ. Hyg 2007; Vol. 4. P. 125-130.

13. Maynard A.M., Kuempel E.D. Airborne nanostruc-tured particles and occupational health. J. Nanopart. Res. 2005; Vol. 7(6). P. 587-614.

14. Erdely A., Hulderman T., Salmen R., Liston A., Zeidler-Erdely P.C., Schwegler-Berry D. et al. Crosstalk between lung and systemic circulation during carbon nanotube respiratory exposure. Potential biomark-ers. Nano Lett 2009; Vol. 9 (1). P. 36-43.

15. Shvedova, A.A., Kisin, E.R., Mercer, R., Murray, A.R., Johnson, V.J., Potapovich, A.I. et al. Unusual inflammatory and fibrogenic pulmonary responses to single-walled carbon nanotubes in mice. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol 2005; Vol. 289. P. 698-708.

16.Mitchell L.A., LauerFT., Burchiel S.W., McDonald J.D. Mechanisms for how inhaled multiwalled carbon nanotubes suppress systemic immune function in mice. Nat Nanotechnol 2009; Vol. 4(7). P. 451-456.

17. Mercer R.R., Hubbs A.F., Scabilloni J.F., Wang L., Battelli L.A., Friend S. et al. Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi-walled carbon nanotubes. Part Fibre Toxicol 2011, Jul 22; Vol. 8. P. 21.

18. Porter D.W., Hubbs A.F., Mercer R.R., Wu N., Wolfarth M.G., Sriram K et al. Mouse pulmonary dose- and time course-responses induced by exposure to multi-walled carbon nanotubes. Toxicology 2010, Mar 10; Vol. 269 (2-3). P. 136-147.

19. Li J.G., Li W.X., Xu J.Y., Cai X.Q., Liu R.L., Li Y.J. et al. Comparative study of pathological lesions induced by multiwalled carbon nanotubes in lungs of mice by intratracheal instillation and inhalation. "Environ Toxicol 2007 Aug; Vol. 22 (4). P. 415^21.

20. Muller J., Huaux F., Moreau N., Misson P., Hei-lier J.F., Delos M. et al. Respiratory toxicity of multiwall carbon nanotubes. Toxicol Appl Pharmacol 2005, Sep 15; Vol. 207 (3). P. 221-231.

T.O. Khaliullin1, E.R. Kisin2, R.R. Zafyalov1, A.A. Shvedova2, L.M. Fatkhutdinova1 Biological effects of pulmonary exposure to multiwalled carbon nanotubes in vivo

'Kazan State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Fedreation, 420012, Kazan, Russian Federation 2National Institute for Occupational Safety and Health, NIOSH, 26505, Morgantown, USA

A single administration of 40 |ig multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) to C57BL/6 mice via pharyngeal aspiration led to an acute local inflammatory response with the development of the fibrotic process in the lung tissue. Inflammatory changes were characterized by a significant increase ( compared to control) in the number of neutrophils in the lavage

fluid, total protein, lactate dehydrogenase, as well as IL-6, MCP-1 and TNF^i 24 hours post exposure. The fibrogenic potential of investigated MWCNT has been shown, confirmed by high levels of TGF-b from the 7th day and untill the end of the experiment. Granulomas formation and fibrosis areas were revealed in the lungs on 28 day post-exposure. The data obtained do not exclude a possibility of systemic responses. Assuming potential health risk for workers exposed to MWCNT aerosol at the workplace, further studies are needed to determine the hazard class and threshold levels along with the necessity to refer MWNTs as specific allotropic modifications of carbon to substances (aerosols) with mainly fibrogenic activity. Key words: carbon nanotubes, fibrosis, in vivo, pulmonary exposure.

Переработанный материал поступил в редакцию 08.05.2013 г.

21