CC BY
76
Фармакология и фармация
удк 615.322:612.014.3:576.32/.36 П.Б. Дыдендамбаев, Б.с. Хышиктуев
биологические эффекты экстрактов лекарственных трав в модели ex vivo
Читинская государственная медицинская академия, г. Чита
В последние годы происходит стремительное накопление данных об иммунобиологических свойствах лекарственных трав, их составе и особенностях влияния на организм человека [3, 8, 10]. В настоящее время известны несколько десятков веществ растительной природы, действующих избирательно на мононуклеарные клетки крови человека [9]. Данные соединения могут связываться с высокоселективными рецепторами на поверхности мембран моноцитов/макрофагов и вызывать специфические биологические эффекты. Макрофаги — крайне гетерогенная клеточная популяция, вместе с тем их объединяют общее происхождение и функции [4]. В организме они могут функционировать в качестве антиген-презентиру-ющих клеток и в контакте с Т-лимфоцитами вызывать модуляцию иммунного ответа. Кроме того, макрофаги играют первостепенную роль в процессах регенерации и перестройки тканей организма в норме и при патологии. Показано, что одним из основных механизмов иммуностимулирующего и противоопухолевого действия растительных полисахаридов является их прямое влияние на макрофаги и систему комплемента [7, 12]. В связи с этим целесообразно выявить характер и механизм действия растительных препаратов на макрофагальные клетки.
Целью исследования явилось изучение влияния экстрактов лекарственных трав на продукцию мононуклеар-ными клетками периферической крови здоровых доноров провоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-6, TNF-a), белков комплемента (С3, С5, C1-ing, factor H), оксида азота (NO) и неоптерина in vitro.
материалы и методы
Из гепаринизированной венозной крови доноров выделяли мононуклеарные клетки (МНК) в двойном градиенте плотности фиколл-урографина («Pharmacia», р=1,077 г/см3, р=1,086 г/см3) на границе раздела фаз. МНК культивировали в полной культуральной среде RPMI-1640, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворот-
резюме
Проведено сравнительное изучение действия экстрактов лекарственных трав на продукцию провоспалитель-ных цитокинов (IL-1p, IL-6, TNF-a), белков комплемента, оксида азота (No) и неоптерина мононуклеарными клетками здоровых доноров in vitro. выявлены индивидуальные особенности влияния экстрактов на функции макрофагов. наиболее эффективными препаратами оказались экстракты шлемника, пятилистника, бадана и облепихи.
Ключевые слова: экстракт лекарственных трав, макрофаг, цитокины, комплемент, неоптерин, No.
р.в. Tsydendambaev, B.s. Khyshiktuev
biological effects of medicinal plants extracts on ex vivo model
Chita State Medical Academy, Chita summary
The comparative study of medicinal plants extracts influence on the production of pro inflammatory cytokines (IL-1p, IL-6, TNF-a), complement proteins, nitric oxide (No) and neopterin by mononuclear cells from venous blood of healthy donors was conducted in vitro. The individual peculiarities of plants extracts influence on macrophage functions were determined. The most effective preparations proved to be scutellar-ia baicalensis, penthaphylloides fruticosa, Bergenia crassifolia and Hippophae rhamnoides extracts.
Key words: medicinal plants extract, macrophage, cyto-kines, complement, neopterin, No.
ки («ПанЭко», Москва), 2 мМ L-глутамина и 80 мкг/мл гентамицина («Ферейн»). Рабочая концентрация МНК составила 106 клеток/мл. Оптимальные дозы были вы-
влияние экстрактов лекарственных трав на продукцию провоспалительных цитокинов, белков комплемента, NO и неоптерина моноцитами/макрофагами периферической крови здоровых доноров (M±m)
Экстракт IL-1ß, пг/мл IL-6, пг/мл TNF-a, пг/мл С3, нг/мл С5, нг/мл C1-ing, нг/мл factor H, нг/мл NO, мкМ/л Neopterin, нг/мл
ПК 125,5±35,29* 1112,1±89,08 150,40±9,23* 0,97±0,24 1,19±0,12 205,76±13,01 63,15±4,05** 2,77±0,23 13,02±1,50**
ВТ 234,8±25,12 1150,4±65,55 254,7±45,19 1,51±0,54 1,39±0,15 200,45±15,20 83,32±9,82** 4,00±0,55* 6,19±0,53*
ТВ 297,5±20,27 1105,3±55,25 299,3 ±21,41 14,59±1,45** 1,91±0,17 201,56±13,15 2,13±0,32 11,07±1,09** 2,77±0,25
ШБ 372,0±15,58* 1142,6±43,67 340,5±10,21* 0,77±0,32 1,32±0,08 211,71±7,81 9,66±1,25** 7,07±0,69** 2,57±0,41
ЗК 365,7±6,98* 1147,2 ±43,91 332,3±10,92* 1,29±0,1 1,78±0,21 181,57±13,07 2,12±0,33 3,38±0,11 2,65±0,14
ДВ 326,2±14,43 1120,5±47,33 304,4±12,7 0,83±0,32 1,78±0,18 224,17±11,66 1,90±0,26 1,23±0,1 5,12±0,79*
ШД 219,7±15.14 1048,5±72,72 220,1±24,13 1,82±0,42 1,85±0,19 211,6±11,85 2,20±0,53 21,23±2,49** 2,45±0,93
ок 228,3±19,82 754,1±92,32 228,8±23,49 89,6±8,79** 2,50±0,76 191,1±14,84 1,65±0,34 6,77±1,9* 3,53±0,72
К 290,0±23,21 1103,3±87,19 261,3±18,25 1,33±0,37 1,52±0,2 200,7±19,42 1,90±0,41 1,62±0,41 2,79±0,3
Примечания. к — контроль; ** — р<0,01; * — р<0,05 к соответствующему контролю.
браны на основании данных литературы и собственных исследований. контролем служили клетки, культивируемые только в полной среде RPMI-1640. Синтетические процессы в клетках индуцировали внесением следующих экстрактов, полученных методом [1]: пятилистника кустарникового (Пк) (Penthaphylloides fruticosa), бадана толстолистного (БТ) (Bergenia crassifolia), горечавника бородатого (ТВ) (Gentianopsis barbata), шлемника байкальского (ШБ) (Scutellaria baicalensis), зопника клубненосного (ЗК) (Phlomis tuberosa), девясила высокого (ДВ) (Inula helenium), шиповника даурского (ШД) (Rosa dahurica Pall), облепихи крушиновидной (OK) (Hippophae rhamnoides).
Суспензию клеток в объеме 1 мл вносили в полипропиленовые пробирки «Eppendorf» и инкубировали в течение 18 ч при 37°С в атмосфере с 5% С02 при регулярном перемешивании. Жизнеспособность клеток после инкубации при окраске трипановым синим составляла не менее 86%. По окончании культивирования МНК осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 мин и в полученных супернатантах иммуноферментным анализом определяли содержание цитокинов («Вектор-Бест»), белков комплемента («Цитокин»), а также уровни метаболитов NO (нитриты/нитраты) методом [2] и неоптерина методом ВЭЖХ [5].
Анализ полученных данных проведен методом вариационной статистики, достоверность параметров определяли путем расчета t-критерия Стьюдента. Различие средних показателей считалось достоверным при уровне значимости менее 0,05.
результаты и обсуждение
Результаты исследований представлены в таблице. Из изученных препаратов на продукцию IL-1ß и TNF-a достоверно влияли экстракты шлемника, зопника и пя-тилистника (р<0,05). Максимальным стимулирующим эффектом на выработку данных цитокинов макрофагами обладал экстракт шлемника, который в 1,2 и 1,3 раза соответственно (372,0=15,6 и 340,5±10,2 пг/мл) увеличивал продукцию IL-1 ß и TNF-a по сравнению с контролем (290,0±20,2 и 261,3±18,2 пг/мл). Подобное же действие, но менее выраженное, оказывал зопник. В то же время клетки с добавлением экстракта пятилистника снижали продукцию вышеназванных полипептидов. На синтез и секрецию IL-6 макрофагами стимулирующего либо инги-бирующего влияния экстрактов не обнаружено.
Не все исследуемые препараты оказывали действие на синтез белков комплемента. Стимулирующим эффектом на выработку С3 обладали экстракты облепихи и горечавника (р<0,01), причем у первого действие в 5 раз сильнее второго. Генерацию синтеза С5 вызывал только экстракт ОК, но значение р было больше 0,05. Содержание С1-ингибитора не менялось при любом варианте использования предполагаемых эффекторов. Влияние на продукцию фактора Н оказывали три экстракта: ШБ, ПК и БТ, причем в такой же последовательности сила воздействия возрастала (р<0,01 по сравнению с контролем).
Что касается влияния на продукцию стабильных продуктов метаболизма оксида азота (N0), то статистически значимо усиливали их синтез экстракты ШД, ГБ, ШБ (р<0,01), ОК и БТ (р<0,05), причем наиболее значительный прирост количества метаболитов нитратов/нитритов вызывал ШД (в 6 раз).
Максимальным стимулирующим эффектом на выработку неоптерина МНК периферической крови обладал экстракт пятилистника, который в 4 раза (13,02±1,5 нг/мл) увеличивал продукцию изучаемого вещества по сравнению с контролем (2,79±0,3 нг/мл; р<0,01). Одинаковой силой стимуляции синтеза данного птеридина мононуклеарами обладали экстракты бадана и девясила (соответственно 6,19±0,53 и 5,12±0,79 нг/мл; р<0,05). Результаты воздействия других экстрактов не отличались от контроля.
Выявление механизмов регулирующего влияния растительных препаратов на клетки-эффекторы позволяет обосновать их конкретное направление применения. Биологически активные вещества, содержащиеся в исследуемых экстрактах, связываясь со специфическими рецепторами (CD14, TLR-4), предположительно, могут приводить к выработке широкого спектра провоспали-тельных медиаторов, таких как цитокины (ГЬ-1Р, Т№-а), неоптерин и нитросоединения. Увеличение синтеза ци-токинов в присутствии экстрактов шлемника и зопника может быть связано со взаимодействием компонентов экстрактов с так называемыми То11-подобными рецепторами (TLR) на мононуклеарах, так как известно, что при контакте соответствующего лиганда с TLR запускается сигнальный каскад, приводящий к активации транскрипционного фактора №-кВ, что, в свою очередь, приводит к синтезу Т№-а и других провоспалительных цитокинов [11]. Учитывая то, что оксид азота вовлечен в процессы вазо-
дилатации, ингибирования агрегации тромбоцитов, анти-пролиферативное действие цитокинов может реагировать с супероксидным радикалом и некоторыми системами, стимулирующими циклооксигеназу (синтез Pg), активировать гуанилатциклазу (неоптерин) и т.д. [2], становится актуальным выявление детального механизма влияния компонентов экстрактов шиповника и горечавника, вызывавших максимальный эффект на продукцию NO. Экстракты бадана и пятилистника резко увеличивали продукцию неоптерина, который в настоящее время рассматривается как маркер активации клеточного иммунитета [6]. Кроме того, поскольку продукция неоптерина активированными моноцитами/макрофагами коррелирует с продукцией активных форм кислорода данными клетками, неоптерин может служить непрямым маркером развития оксидатив-ного стресса в организме при воспалении [13]. Это может указывать на стимулирующее влияние данных экстрактов на процессы «кислородного взрыва», сопровождающего фагоцитоз, что косвенно говорит о благоприятном, в некоторых случаях, регулирующем воздействии веществ экстракта на функции макрофагов.
Таким образом, изучение механизмов воздействия экстрактов лекарственных трав на эффекторные клетки позволяет если не полностью объяснить, то хотя бы прояснить точки приложения их действия при комплексном влиянии лекарственных трав на оздоровление человека. Биологически активные вещества, содержащиеся в изучаемых экстрактах, вероятно, могут стимулировать активацию макрофагов и, таким образом, рассматриваться как перспективные компоненты для начальной разработки препаратов, предназначенных для коррекции иммунодефицита.
Быводы
В наших модельных тест-системах in vitro наиболее эффективными регуляторами функции макрофагов яви-
лись экстракты шлемника, пятилистника, бадана и облепихи, стимулирующие мононуклеарные клетки человека путем индукции синтеза некоторых цитокинов, белков комплемента, оксида азота и неоптерина.
Литература
1. Андреева Т.И., Комарова E.H., Юсубов М.С. и др. // Химико-фарм. журнал. 2004. Т.38, №10. С. 26-28.
2. Голиков П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний. М.: Медпрактика, 2004. 180 с.
3. Евстропов А.Н., Бурова Л.Г., Орловская И.А. и др. // Вопр. вирусол. 2004. Т. 49, №6. С. 30-33.
4. Луговская С.А. // Клин. лаб. диагн. 1997. №9. С. 1016.
5. Патент 2313092 RU, МПК G 01 №33/49. Способ определения неоптерина в крови / А.А. Дутов, П.Б. Цыдендамбаев, П.П. Терешков и др.; Читинская государственная медицинская академия. № 2006106029/15. Заявлено 26.02.2006. Опубл. 20.12.2007. Бюл. № 35. 6 с.
6. Свиридов Е.А., Телегина Т.А. // Успехи биол. химии. 2005. Т. 45. С. 355-390.
7. Смолина Т.П., Соловьева Т.Ф., Беседнова H.H. // Антибиотики и химиотер. 2001. №7. С. 19-22.
8. Чурин А.А., Масная Н.В., Шерстобоев Е.Ю. и др. // Эксперим. и клин. фарм. 2005. Т. 68, №5. С. 51-54.
9. Щепеткин И.А. // Антибиотики и химиотер. 2004. Т.49, №1. С. 35-42.
10. Chung H., Jeong H., Hong S. et al. // Biol. Pharm. Bull. 2002. Vol. 25, №9. P. 1142-1146.
11. Iwasaki A., Medzhitov R. // Nat. Immunol. 2004. Vol. 5, № 10. P. 987-995.
12. Wasser S.P. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. Vol. 60. P. 258-274.
13. Widner В., Wirleitner В., Baier-Bitterlich G. et al. // Arch. Immunol. Ther. Exp. 2000. №48. P. 251-258.
□□□
УДК 615.322 : 665.939.358 М.Ю. Хотимченко, Е.В. Хожаенко, Е.А. Коленченко
РТУТЬ-СВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АЛЬГИНАТА КАЛЬЦИЯ
Владивостокский государственный медицинский университет; Институт биологии моря ДВО РАН, г. Владивосток
Ртуть является высокотоксичным металлом, который содержится в выбросах промышленных предприятий тяжелой промышленности и топливно-энергетического комплекса, загрязняет воздушную и водную среду и вызывает острые и хронические отравления у лиц, занятых на вредных производствах, а также среди населения крупных промышленных центров [6, 9, 10]. Воздействие
ртути на организм человека сопровождается грубыми поражениями центральной нервной системы, печени, почек и репродуктивной функции [4, 12]. На сегодняшний день не существует специфических средств лечения и профилактики отравлений солями ртути. В этих целях обычно используют энтеросорбенты (активированный уголь, лигнин) или гемосорбенты (унитиол, пентацин), прием
