CC BY
37
https://doi.org/10.17116/molgen2021390313
Биологические аспекты безопасности клеточных культур in vitro
© И.Н. ЛЯПУН1' 2
'ФГНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова» Роспотребнадзора,, Владивосток,
Россия;
дальневосточный филиал государственного научно-испытательного института военной медицины, Владивосток, Россия РЕЗЮМЕ
В последние десятилетия клеточные культуры находят все большее применение в разных сферах деятельности: в биотехнологических и биомедицинских исследованиях, регенеративной медицине, продукции моноклональных антител, вакцин, гормонов, интерлейкинов и т.д. Исследования in vitro стали одним из основополагающих методов проверки лекарственных средств, а применение стволовых клеток дало положительные результаты при лечении генетических, аутоиммунных и дегенеративных заболеваний. Наряду с этим ученые всего мира сталкиваются с одними и теми же проблемами — возможностью контаминации, вирусного или бактериального заражения исследуемой клеточной культуры, человека или окружающей среды при работе с первичными или вторичными клеточными культурами. Также некоторые клеточные штаммы несут онкоген-ный потенциал, что может привести к риску развития рака при доступе к макроорганизму. Стоит учитывать, что для работы с клеточными культурами требуются специальные методы, большое количество различного оборудования, растворителей, химикатов и реагентов, которые представляют собой дополнительную опасность и риск получения травм. В настоящей статье автор, опираясь на собственный опыт, рассматривает отдельные аспекты биобезопасности при работе с клеточными культурами при проведении биомедицинских исследований. Они изначально нацелены на защиту клеток от случайной контаминации. Ввиду ограниченного объема рукописи приводятся ссылки на современные международные нормативно-методические документы, основанные на мировой практике безопасной работы с культурами клеток для минимизации случайного инфекционного загрязнения и обеспечения максимальной защиты здоровья человека и окружающей среды.
Ключевые слова: биологическая безопасность, клеточная культура, культивирование клеток, перекрестная контаминация, стволовые клетки.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРЕ:
Ляпун И.Н. — https://orcid.org/0000-0002-5290-3864; e-mail: irina-lyapun@list.ru
Автор, ответственныий за переписку: Ляпун И.Н. — e-mail: irina-lyapun@list.ru
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Ляпун И.Н. Биологические аспекты безопасности клеточных культур in vitro. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.
2021;39(3):3-9. https://doi.org/10.17116/molgen2021390313
Biological aspects of security cell culture in vitro
© I.N. LYAPUN1' 2
'Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia;
2Far Eastern Branch of the State National Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Vladivostok, Russia
ABSTRACT
In recent decades, cell cultures are increasingly used in various fields of activity: in biotechnological and biomedical research, regenerative medicine, the production of monoclonal antibodies, vaccines, hormones, interleukins, etc. In vitro studies have become one of the fundamental methods of drug screening. Along with this, scientists all over the world are faced with the same problems — the possibility of contamination, viral or bacterial infection of the studied cell culture, person or the environment when working with primary or secondary cell cultures. Also, some cell strains carry oncogenic potential, which can lead to a risk of cancer when accessing the macroorganism. It is worth considering that working with cell cultures requires special methods, a large number of various equipment, solvents, chemicals and reagents, which pose an additional danger and risk of injury. In this paper, the author, based on his own experience, considers certain aspects of biosafety when working with cell cultures during biomedical research. They are primarily aimed at protecting cells from accidental contamination. In view of the limited volume of the manuscript, references are made to modern international regulatory and methodological documents based on the world practice of safe work with cell cultures to minimize accidental infectious contamination and ensure maximum protection of human health and the environment.
Keywords: biosafety, cell culture, cultivation cell, cross-contamination, stem cells. INFORMATION ABOUT THE AUTHOR:
Lyapun I.N. — https://orcid.org/0000-0002-5290-3864; e-mail: irina-lyapun@list.ru Corresponding author: Lyapun I.N. — e-mail: irina-lyapun@list.ru
TO CITE THIS ARTICLE:
Lyapun IN. Biological aspects of security cell culture in vitro. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2021;39(3):3-9. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen2021390313
Введение
Культивирование клеток — процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» связан в основном с выращиванием клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот (животных, человека).
В настоящее время культуры клеток человека и животных стали важным инструментом, используемым во многих областях естественных наук. Они находят все большее применение в научных исследованиях, практической и регенераторной медицине, современных биотехнологиях. Актуальным остается применение стволовых клеток в клинической медицине при лечении сахарного диабета [1], сетчатки глаза [2], легких [3], прогрессирующей неоваску-лярной возрастной дегенерации желтого пятна [4], воспалительных заболеваний кишечника [5], печени [6] и сердца [7].
Клеточная культура — размножение и выживание клеток в искусственной среде. С этим понятием тесно связан термин «клеточная линия». Клеточная линия — совокупность клеток, полученная из первичной культуры путем увеличения количества клеток после нескольких генераций с преобладанием клеток или линий дифференцировки с высоким темпом роста и высокой однородностью клеточной популяции. Как только первичная культура посеяна, она называется клеточной линией.
В связи с невозможностью привести полный и подробный список необходимых требований для работы с клеточной культурой из-за большого объема нормативных документов [8—14] в данной работе приводится лишь краткое описание, основанное на личном опыте автора и частично на мировой практике в вопросах безопасности.
Историческая справка
Культура тканей как метод впервые была использована более века назад для изучения процессов эмбрионального развития. Так, S. Ringer в 1880-х годах описал концентрации кальция, калия и натрия, необходимые для поддержания сердечного сокращения лягушки [15, 16]. В 1885 г. W. Roux культивировал куриную эмбриональную ткань в физиологическом растворе в течение нескольких дней. В 1907 г. R. Harrison из Университета Джона Хопкинса первым успешно вырастил нервные волокна in vitro из эмбриональных тканей лягушки, эта тканевая культура успешно сохранялась ex vivo в течение 1—4 нед [17]. В 1912 г. A. Carrel, работавший в Институте Рокфеллера, проводил эксперименты по улучшению состояния культуры клеток животных на модели культуры тканей куриного
эмбриона [18]. Ему удалось из сердечного фрагмента куриного эмбриона на 3-й месяц культивирования вырастить соединительную ткань.
Следующим важным достижением стала демонстрация K. Sanford и соавт. (1948) возможности культивирования одиночных клеток млекопитающих на стеклянных пластинах в жидкой среде для получения первой непрерывной клеточной линии [19]. До этого ткани прикрепляли к покровным стеклам, переворачивали и выращивали в каплях крови или плазмы. Наряду с этим в 1955 г. H. Eagle установил, что ранее используемые вещества (сложные экстракты тканей, сгустки и т.д.) для выращивания клеток могут быть заменены на «смесь аминокислот, витаминов, кофакторов, углеводов и солей, дополненные небольшим количеством сывороточного белка...» [20], открыв новые возможности для культивирования клеток. Это увеличило диапазон манипуляций, которые раньше были невозможны при работе с клетками: получение генетически измененных клеточных линий посредством мутагенеза и клонирования, прямое сравнение клеток из нормальных и трансформированных тканей, изучение клеточной физиологии и метаболизма, а также рост нормальных и трансформированных клеток человека in vitro [21—23].
Данные открытия привели к тому, что были созданы клеточные линии, поддерживающие дифференцированные функции, характерные для клеток по типу их происхождения, таких как клетки надпочечников, гипофиза [24], нейронов [25], миоци-тов [26] и гепатоцитов [27]. Также были разработаны диплоидные клеточные линии — HeLa [28], MRC-5 и WI-38 [29] из человеческой ткани и Vero, полученная из ткани обезьяны [30]. Это позволило изучать не только рост клеток, но и реакцию на гормоны и другие факторы окружающей среды, выработку и секрецию гормонов, а также другие дифференцированные функции in vitro.
Информация о том, что у каждого типа клеток есть оптимальное сочетание питательных веществ, поддерживающих их функции [31], привела к появлению питательных сред, используемых для культивирования определенных типов клеток в специализированных условиях. Вместе с тем замена сыворотки определенными компонентами, такими как поверхностные и транспортные белки, гормоны и факторы роста [32, 33], дала возможность для поддержания специализированных клеток и тканей в in vitro продолжительное время, что способствовало появлению новых биологических открытий, например рекомбинантной экспрессии белков и созданию линий гибридомных клеток, продуцирующих антитела.
Условия культивирования клеток
Лаборатории клеточных культур представляют собой особые области, отличающиеся от многих
Классификация риска на основе типа клеток
Риск
Тип клеток
Высокий Охарактеризованная клеточная линия
Первичные клетки крови, лимфоидные клетки и нервная ткань человеческого или обезьяньего происхождения Кровь человеческого или нечеловеческого происхождения Гипофиз от человека, козлят и овец Клетки центральной нервной системы человека и быка Преднамеренно введенный патоген или известный эндогенный загрязнитель Средний Негематогенные клетки млекопитающих, такие как фибробласты и эпителиальные клетки
Клеточные линии/штаммы, не полностью аутентифицированные или неохарактеризованные Низкий Клетки, полученные из тканей птиц и беспозвоночных
Хорошо охарактеризованные/аутентифицированные клеточные линии человека или приматов
Клеточные линии, которые были аутентифицированы, имеют низкий риск эндогенных патогенов и не представляют
опасности для здоровья человека
других рабочих мест. Специальные методы, используемые в этих лабораториях, требуют большого количества различного оборудования, растворителей, химикатов и реагентов. Существует много агрессивных, токсичных, легковоспламеняющихся и мутагенных химических веществ. Кроме того, часть оборудования имеет сложные конструкции и механизмы. Недостаточная информация о свойствах и использовании этого оборудования может привести к травмам. Также неправильное их использование может привести к поражению электрическим током или пожару. Некоторые химические вещества, используемые в лаборатории, могут быть опасны для человека или окружающей среды. Так, например, вдыхание, контакт с кожей или слизистыми оболочками, брызги на кожу, взрывы или пожары, а также неисправности при утилизации отходов — вот некоторые из общих проблем безопасности.
Другая степень опасности проистекает из характеристик биологических материалов, используемых в исследованиях клеточных культур. В основном это ткани, жидкости и клетки, полученные от человека и животных. Исследователи могут быть заражены различными бактериальными и вирусными агентами, грибами, микоплазмой, которые могут нести эти материалы в соответствии с типом полученного организма, если не принимаются достаточные меры безопасности. В частности, при использовании клеточного штамма, инфицированного или трансформированного латентными вирусами, необходимо более осторожное отношение к процедурам безопасности, требующим неукоснительного соблюдения. Тем не менее некоторые клеточные штаммы несут онкогенный потенциал спонтанно или в результате вмешательства, и существует риск развития рака при доступе к макроорганизму.
Специализированные боксы и различные способы контроля (автоматизированные системы культивирования и анализа (биостанции) с возможностью настраиваемых удаленно параметров, техническое обслуживание боксов, соблюдение передовых
лабораторных методов и использование специальных средств индивидуальной защиты для конкретного процесса/исследования) играют важную роль в предотвращении или минимизации таких опасностей (см. таблицу) [34].
Происхождение и источник клеток
Выделяют первичные и вторичные клеточные культуры. Первичные клеточные культуры получают из эмбриональной ткани животных и человека, поскольку эмбриональные клетки обладают способностью к росту и размножению [35]. Чаще культуры клеток готовят из смеси нескольких тканей, например кожной, костной и мышечной. Так получают фибробласты эмбриона человека (ФЭЧ), клетки почек человека (КПЧ) и др. Для получения клеточных культур используют эмбриональную ткань человека (в случае прерывания беременности), а также 8—12-дневные куриные эмбрионы [36].
Получение первичных клеточных культур непосредственно из органов и тканей различных животных, особенно тех, которых отлавливают в природе (млекопитающих, птиц, рыб, насекомых), приводит к частой контаминации клеток вирусами, нередко небезопасными для человека.
Чистые клеточные линии представляют минимальный риск для здоровья человека и окружающей среды. Вследствие иммунного отторжения чужеродных тканей маловероятно, что случайное воздействие культивируемых клеток приведет к их выживанию и размножению у нормальных здоровых людей (за исключением некоторых опухолевых клеток), что не отменяет соблюдения правил техники безопасности при работе с биологическими объектами [37].
Вирусное загрязнение
Вирусы, патогенные для человека, являются одной из наиболее вероятных биологических угроз, представленных клеточными культурами.
Пути заражения клеточных культур микоплазмами.
Основными вирусами, контаминирующими ткани человека, являются вирусы гепатита; ретровирусы человека; вирусы герпеса; popovirues; прионы [34, 38].
Зараженные вирусом культуры клеток представляют опасность для сотрудников лаборатории, пациентов, а также для чистых клеточных культур. В отличие от бактериального и грибкового загрязнения вирусное загрязнение не может быть обнаружено с помощью нормальной световой микроскопии. Только при морфологической модификации культивируемых клеток, такой как цитопатический эффект, можно заподозрить контаминацию вирусом [34, 35, 38].
Культуры клеток могут быть загрязнены следующими способами:
1) инфицированы как первичные культуры (поскольку источник клеток уже был заражен);
2) инфицированы в результате использования зараженного сырья;
3) через животный пассаж.
Микоплазмы
Во всем мире основными источниками контаминации считаются вирусы, но не менее значимой и опасной признается микоплазма (Mycoplasma pneumoniae). Молликуты, часто называемые микоплазма-
ми, представляют собой группу чрезвычайно мелких бактерий [34].
Клеточные культуры всех типов, ведущие свое происхождение от различных эукариотических организмов (млекопитающие, птицы, рептилии, рыбы, насекомые и растения), подвержены контаминации микоплазмами [39]. По результатам экспериментальных работ, проведенных в разных странах мира, по-раженность культур микоплазмами в различных лабораториях варьирует от 15 до 80%, а в некоторых достигает 100% [40-42].
В отличие от прямых видимых загрязнений бактериями или грибами, которые убивают клетки в течение нескольких дней, микоплазмы способны сохраняться в постоянных клеточных культурах и не обнаруживаться в течение многих лет. Единственный гарантированный способ выявления загрязнения ми-коплазмой — это периодическое тестирование культур с использованием флюоресцентного окрашивания, ПЦР, авторадиографии [36]. Для обнаружения микоплазм в клеточных культурах используются системы молекулярно-генетического тестирования. Этот анализ основан на способности иммунной системы (в частности, ТЬЯ2) распознавать микоплаз-мы и может быть внедрен в процедуры культивирования клеток для проведения рутинных проверок на все виды загрязнения микоплазмой (см. рисунок).
Перекрестное загрязнение
Перекрестная контаминация (cross contamination) — это именование клеточной линии с другими/неправильными признаками. При исследованиях изофермента, проведенных в 1960-х годах, было показано, что 18 из 20 клеточных линий человека имеют сродство с клетками HeLa [28].
Причины перекрестного загрязнения: неправильная маркировка флаконов с культурой в результате небрежности персонала при работе с клеточными линиями; загрязнение одной клеточной линии путем переноса в нее другой клеточной линии через общие флаконы с питательной средой [43], нестерильные инструменты или по воздуху (клетки HeLa способны перемещаться по воздуху с частицами пыли или на нестерильных инструментах, недостаточно тщательно вымытых руках, одежде [28]).
Загрязнение культуральных сред
При культивировании клеток используются среды животного происхождения, что могут выступать в качестве потенциального источника загрязнения [44]. Большинство сред, сывороток и других биологических препаратов животного происхождения пропускают через мембранные фильтры (иногда также используется УФ- или у-излучение), так как их нельзя стерилизовать нагреванием для удаления биологических загрязнений. Вещества, про-стерилизованные через фильтр непосредственно в лаборатории, следует всегда проверять на стерильность перед использованием. В фабричных продуктах стерильность гарантирует производитель. Но нужно иметь в виду, что фильтрация через мембраны 0,2 мкм, являющаяся эффективной для устранения большинства биологических загрязнений, не может гарантировать полное удаление вирусов и микоплазм, особенно в сыворотках.
Биобезопасность и управление рисками
в лабораториях in vitro
Риски, которым подвергается персонал, работающий в лаборатории клеточных культур, классифицируют на две основные группы: риски, связанные с рабочей зоной, и риски, связанные с рабочими материалами. Риски, которым подвергаются сотрудники, могут влиять как на здоровье, так и на окружающую среду. Чтобы избежать этого, персонал лаборатории должен соблюдать действующие правовые нормы и требования, изложенные в протоколах о работе и безопасности. Важным документом, в котором подробно изложены риски и меры предосторожности при работе с клеточными культурами, является «Руководство по биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях», подготов-
ленное ВОЗ совместно с Национальным институтом здоровья (США) [8, 9]. В этом Руководстве были определены четыре основных уровня безопасности (В8Ы—4) и меры предосторожности, на его основании в каждой лаборатории клеточных культур создаются Инструкции по биобезопасности в зависимости от объема исследований, целей и задач.
Необходимым требованием для работы с клеточными культурами является стерильность ламинарных боксов и окружающих помещений, в которых процедуры выполняются с минимумом загрязнений [45, 46]. Создать полностью стерильную лабораторию без загрязнения микроорганизмами практически невозможно, но уровень контаминации должен быть сведен к минимуму. Для этого необходимо ежедневное, в течение не менее 1 ч для боксового помещения и не менее 40 мин для ламинара, облучение ультрафиолетом до начала работы и после ее окончания. Ламинар снаружи и внутри обрабатывают специальными дезинфицирующими средствами. Все используемые материалы после окончания работы должны быть дезактивированы путем автоклавирования или дезинфекции перед утилизацией. Стеклянную посуду, используемую в работе, помещают в емкости со стерилизующей жидкостью (как правило, это 1% раствор гипохлорида натрия). Для проверки стерильности бокса в ламинар помещают чашки Петри с твердыми питательными средами, селективными для бактериальной микрофлоры воздушной среды. Чашки оставляют открытыми в течение 4 ч, после чего закрывают и инкубируют при 25—37 °С в течение 2 сут. Отсутствие роста бактериальных колоний на поверхности агара — показатель правильной подготовки ламинара к работе.
Важнейшей особенностью лаборатории является отделение стерильной рабочей зоны от других зон. Зоны культивирования клеток должны занимать ограниченное пространство с минимальным количеством персонала. Фильтрация воздуха является одним из наиболее важных вопросов. В куль-туральном боксе должна быть кабина с ламинарным потоком класса II, в котором после отбора чистого воздуха снаружи и стерилизации его подают в бокс с положительным давлением. Это гарантирует, что количество частиц в окружающем пространстве минимально. Ламинар с воздушным потоком, микроскоп и инкубатор должны быть расположены близко друг к другу, чтобы физический контакт культур был сведен к минимуму. Выполнение нестерильных процессов, таких как промывание культуры, должно происходить на другой стороне стерильной зоны. Система воздушного охлаждения необходима из-за тепла, выделяемого электронными устройствами. Такие меры предосторожности служат для уменьшения количества загрязняющих веществ и сводят их до минимума. Только руки сотрудника, выполняющего необходимые манипуляции
с культурой клеток, должны контактировать с кабиной с ламинарным потоком, являющейся стерильной зоной. Все лабораторные помещения следует регулярно обрабатывать дезинфицирующими средствами.
Необходимо строго соблюдать рекомендации В8Ь-2 в отношении средств защиты персонала, таких как лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз. Тестирование на вирусы является обязательным и очень важным этапом для снижения опасности использования зараженных вирусом клеточных линий, но не обеспечивает абсолютную безопасность, так как существует риск заражения случайными агентами. Следовательно, пользователи и производители биотехнологических продуктов, работающие с клетками животных, должны строго придерживаться вышеописанных правил по биобезопасности и гарантировать отсутствие каких-либо случайных агентов и/или вирусов.
Заключение
Работа с клеточной культурой является потенциально опасной как для персонала, работающего непосредственно с данной культурой, так и для окружающей среды в целом. Кроме того, опасность могут
AMTEPATYPA/REFERENCES
1. Volarevic V, Markovic BS, Gazdic M, Volarevic A, Jovicic N, Arsenijevic N et al. Ethical and Safety Issues of Stem Cell-Based Therapy. Int J Med Sci. 2018;15(1):36-45.
https://doi.org/10.7150/ijms.21666
2. Song WK, Park KM, Kim HJ, Lee JH, Choi J, Chong SY et al. Treatment of macular degeneration using embryonic stem cell-derived retinal pigmentepi-thelium: preliminary results in Asian patients. Stem Cell Reports. 2015;4:860-872.
https://doi.org/10.1016Zj.stemcr.2015.04.005
3. Ghaedi M, Niklason LE. Human Pluripotent Stem Cells [iPSC] Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells. Methods Mol Biol. 2019;1576:55-92. https://doi.org/10.1007/7651_2016_11
4. Mandai M, Watanabe A, Kurimoto Y, Hirami Y, Morinaga C, Daimon T et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 2017;376:1038-10 46. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1608368
5. Dhere T, Copland I, Garcia M, Chiang KY, Chinnadurai R, Prasad M et al. The safety of autologous and metabolically fit bone marrow mesenchymal stromal cells in medically refractory Crohn's disease — a phase 1 trial with three doses. Aliment Pharmacol Ther. 2016;44:471-481. https://doi.org/10.1111/apt.13717
6. Amin MA, Sabry D, Rashed LA, ArefWM, el-Ghobary MA, Farhan MS et al. Short-term evaluation of autologous transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in patients with cirrhosis: Egyptian study. Clin Transplant. 2013;27:607-612. https://doi.org/10.1111/ctr.12179
7. Bartunek J, Behfar A, Dolatabadi D, Vanderheyden M, Ostojic M, Dens J et al. Cardiopoietic stem cell therapy in heart failure: the C-CURE (Cardio-poietic stem Cell therapy in heart failure) multicenter randomized trial with lineage-specified biologics. J Am Coll Cardiol. 2013;61:2329-2338. https://doi.org/10.1016/jjacc.2013.02.071
8. Centers for Disease Control and Prevention (2009) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 5th edn. Accessed 31 Jan 2014. https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/
представлять и различные цитотоксические и химические вещества, CO2 и жидкий азот, используемые в лабораториях in vitro.
Несмотря на сложности и возможные риски, исследования in vitro клеточных культур являются уникальным и перспективным направлением регенеративной и трансплантационной медицины. При этом терапия стволовыми клетками, помимо этических противоречий, вызывает большие проблемы биобезопасности: подавление противоопухолевого ответа с последующим ростом опухолей и метастазированием, способность дифференцироваться в клетки других тканей и т.д. Таким образом, все исследования с использованием клеточных культур должны быть направлены на постоянный мониторинг и наблюдение за возможностью возникновения риска заражения человека и окружающей среды.
Финансирование. Работа выполнена в рамках выполнения государственного задания по теме НИР №0545-2019-0007 «Молекулярные механизмы образования устойчивых некультивируемых форм бактерий».
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
The author declare no conflicts of interest.
9. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) (5th ed.). U.S. Dept. of Health and Human Services. 2009;437.
10. World Organisation for Animal Health. Manuel of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. Chapter 1.1.2 biosafety and biosecurity in the veterinary microbiology laboratory and animal facilities. 2009. Accessed 31 Jan 2014.
https://web.oie.int/eng/normes/mmanual/2008/pdf/1.1.02_biosafety.pdf
11. Centers for Disease Control and the National Institutes of Health Office of Environmental Health and Safety (EH&S) Biosafety Manual. Last updated: June 7, 2019.
https://ehs.stanford.edu/manual/biosafety-manual
12. Cell Culture Fundamentals: Safety Aspects of Cell Culture. ECACC Laboratory Handbook 4th Edition, 2014.
https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/ safety-aspects-2014.html
13. Laboratory procedures for human cell culture. good practices for cell culture techniques. EuroBioBank. December, 2014. https://www.eurobiobank.org/uploads/2017/09
14. CDC/NIH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition. Working with Human, NHP and Other Mammalian Cells and Tissues. 2007.
https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html
15. Ringer S. Regarding the action of hydrate of ammonia, and hydrate of potash on the ventricle of the frog's heart. J Physiol. 1882;3:380-393.
16. Ringer S. A further contribution regarding the influence of the different constituents of the blood on the contraction of the heart. J Physiol. 1883;4:29-42.
17. Harrison R. Observations on the living developing nerve fiber. Proc Soc Exp Biol Med. 1907;4:140-143.
18. Carrel A. On the permanent life of tissues outside of the organism. J Exp Med. 1912;15:516-528.
19. Sanford K, Earle W, Likely G. The growth in vitro of single isolated tissue cells. J Natl Cancer Inst. 1948;9:229-246.
20. Eagle H. Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture. Science. 1955;122:501-504.
21. Puck T, Marcus P. A rapid method for viable cell titration and clone production with HeLa cells in tissue culture: The use of x-irradiated cells to supply conditioning factors. Proc Natl Acad Sci USA. 1955;41:432-437.
22. Hayflick L, Moorehead P. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 1961;25:585-621.
23. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am JHyg. 1963;78:173-180.
24. Bounassisi V, Sato G, Cohen A. Hormone-producing cultures of adrenal and pituitary tumor origin. Proc Natl Acad Sci USA. 1962;48:1184-1190.
25. Agusti-Tocco G, Sato G. Establishment of functional clonal lines of neurons from mouse neuroblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1969;64:311-315.
26. Yaffe D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1968;61:477-483.
27. Thompson E, Tompkins G, Curran J. Induction of tyrosine-ketoglutarate transaminase by steroid hormones in a newly established tissue culture cell line. Proc Natl Acad Sci USA. 1966;56:296-303.
28. Lucey BP, Nelson-Rees WA, Hutchins GM. Henrietta Lacks, HeLa cells, and cell culture contamination. Archives oof Pathology & Laboratory Medicine. 2009;133(9):1463-1467. https://doi.org/10.1043/1543-2165-133.9.1463
29. Jacobs JP, Jones CM, Baille JP. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 1970;277:168-170. https://doi.org/10.1038/227168a0
30. Yasumura Y, Kawakita Y. Studies on SV40 in tissue culture-preliminary step for cancer research in vitro. Nihon rinsho. 1963;21:1201-1215.
31. Ham RG, McKeehan WL. Media and growth requirements. Methods Enzy-mol. 1979;58:44-93.
32. Bottenstein J, Hayashi I, Hutchings SH, Masui H, Mather J, McClure DB et al. The growth of cells in serum free hormone supplemented media. Methods Enzymol. 1979;58:94-109.
33. Barnes D, Sato G. Serum-free cell culture: A unifying approach. Cell.
1980;22:649-655.
34. Shingatgeri V. Safety concerns using cell-based in vitro methods for toxicity assessment. Chapter 10 in book: In Vitro Toxicology; 2018;187-207. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-804667-8.00010-9
35. Stacey G, Doyle A, Tyrrell D. Safety in cell and tissue culture. Springer science. 1998.
https://doi.org/10.1007/978-94-011-4916-7
36. Uysal O, Sevimli T, Sevimli M, Gunes S, Sariboyaci AE. Cell and Tissue Culture: The Base of Biotechnology. In: Barh D., Azevedo V., editor. Om-ics Technologies and Bio-Engineering. Towards Improving Quality of Life. Elsevier BV: Academic Press; 2018;1:391-429. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-804659-3.00017-8
37. Doblhoff-Dier O, Stacey G. Cell lines: applications and biosafety. In: Fleming D., Hunt D., editors. Biological safety: principles and practices. Washington, DC: ASM Press; 2000;221-239.
38. Pauwels K, Herman P, Van Vaerenbergh B, Dai DC, Berghmans L, Waeter-loos G, et al. Animal cell cultures: risk assessment and biosafety recommendations. Applied Biosafety. 2007;12(1):26-38.
39. Del Gludice RA, Hopps HE. Microbiological Methods and Fluorescent Microscopy for the Direct Demonstration of Mycoplasma Infection of Cell Cultures. In: McGarrity GJ, Murphy D, Nichols WW, eds. Mycoplasma injection of cell cultures. New York: Plenum; 1978;57-69.
40. Ryan J. Understanding and managing cell culture contamination. Lowell, MA: Corning Incorporated, Life Sciences; 1994;24.
https://www.nexusacademicpublishers.com/uploads/portals/Cell_culture_ contaminations_.pdf
41. Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. New York: Wiley-Blackwell; 2015;736.
42. Шалунова Н.В., Волкова Р.А., Волгин А.Р., Петручук Е.М., Бердни-кова З.Е., Эльберт Е.В. и др. Микоплазмы-контаминанты клеточных культур. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016;16(3):151-160.
Shalunova NV, Volkova RA, Volgin AR, Petruchuk EM, Berdnikova ZE, Elbert EV, et al. Mycoplasma — contamination of cell cultures. BlOprepa-rations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2016;16(3):151-160. (In Russ.).
43. Zabal O, Kobrak AL, Lager IA, Schudel AA, Weber EL. Contamination of bovine fetal serum with bovine viral diarrhea virus. Rev Argent Microbiol. 2000;32:27-32.
44. Erickson GA, Bolin SR, Landgraf JG. Viral contamination of fetal bovine serum used for tissue culture: risks and concerns. Dev Biol Standard. 1991;75:173-175.
45. Coecke S, Balls M, Bowe G, Davis J, Gstraunthaler G, Hartung T et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 2005;33:261-287.
https://doi.org/10.1177/026119290503300313
46. Philippeos C, Hughes RD, Dhawan A, Mitry RR. Introduction to Cell Culture. Methods Mol Biol. 2012;806:1-13. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-367-7_1
Поступила в редакцию 23.01.2020
Received 23.01.2020
После доработки 25.01.2020
Revised 25.01.2020
Принята к публикации 11.02.2020
Accepted 11.02.2020
