CC BY
130
УДК 615.32 + 581.19
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА И АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ IN VITRO ПОЛИЭКСТРАКТА LOMATOGONIUM CARINTHIACUM (WULFEN) A. BR.
© П.Б. Лубсандоржиева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахъяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия) E-mail: [email protected]
Изучена антиоксидантная активность полиэкстракта из надземной части Lomatogonium carinthiacum (Wulfen) A. Br, Липофильные вещества - каротиноиды, агликоны ксантонов, флавоноидов - вносят существенный вклад в суммарную антиоксидантную активность полиэкстракта.
Введение
Надземная часть Lomatogonium carinthiacum (Wulfen) A.Br. (сем. Gentianaceae) использовалась в практике тибетской медицины в Забайкалье в качестве заменителя сырья sum cu tig - Saxifraga umbellulata Hook. F. Et Thoms. для лечения воспалительных заболеваний печени и желчного пузыря [1, 2]. Отвар L. carinthiacum обладает в эксперименте диуретической и гистаминной активностями [3]. L. carinthiacum содержит флавоноиды (производные лютеолина), ксантоны, иридоиды (сверциамарин, эритроцентаурин), алкалоиды [3-5]. В отделе тибетской медицины ИОЭБ СО РАН изучали желчегонное действие L. carinthiacum [6], химический состав [7].
Цель данной работы - оценить антиоксидантную активность (АОА) полиэкстракта из надземной части L. carinthiacum (Wulfen) A. Br. и содержание в нем биологически активных веществ (БАВ).
Экспериментальная часть
Надземная часть L. carinthiacum для получения полиэкстракта собрана в фазу цветения в начале августа в Иволгинском районе Бурятии в 2004 г. К 100 г н.ч. L. carinthiacum добавили 96% этанол в соотношении сырье: экстрагент (1:10) и экстрагировали дважды при комнатной температуре и при постоянном помешивании в течение 2 ч. Извлечение отфильтровали, к шроту добавили 40% этанол в соотношении сырье :экстрагент (1:10), экстрагировали (двукратная экстракция) при температуре 90 ± 5 °С в течение 1 ч. Извлечение отфильтровали, к шроту добавили горячую очищенную воду и экстрагировали при 100 °С в течение 1 ч. Спирт отогнали на роторном испарителе, водные остатки шести извлечений объединяли, сепарировали, концентрировали до 1/5 объема, высушили в вакуум-сушильном шкафу. Выход полиэкстракта (экстракт 1) - 49,053,5% от массы исходного сырья. Для удаления липофильных веществ 20 г экстракта последовательно экстрагировали до осветления извлечений гексаном, хлороформом (экстракт 2).
В полиэкстракте определяли содержание биологически активных веществ по известным методикам [810]. Данные анализов приведены в таблице 1.
700 г н.ч. L. carinthiacum четырежды экстрагировали 60% этанолом при комнатной температуре в соотношении сырье:экстрагент (1 : 10). Спирт отогнали на роторном испарителе, водный остаток обработали последовательно растворителями разной полярности. После удаления растворителей получили 22,5 г хлороформного, 13,715 г этилацетатного, 42,07 г бутанольного и 145 г водного извлечений. Общий выход экстрактивных веществ - 31,9%. Хлороформное извлечение разделили на колонке с силикагелем (элюция смесью хлороформ-этанол с возрастающей концентрацией последнего) на 2 части: содержащую у-пироны (фракция 1) и содержащую тритерпеновые соединения (фракция 2). Этилацетатную фракцию разделили на колонке с полиамидом, элюент - этанол, водный раствор этанола возрастающей концентрации.
Для колоночной, тонкослойной, бумажной хроматографии использовали системы растворителей: гексан-этилацетат, 7 : 3 (I), хлороформ-бензол, 5 : 1 (II), хлороформ (III), хлороформ-метанол, 7 : 3 (IV), этилацетат-муравьиная кислота-уксусная кислота-вода, 100 : 11 : 11 : 26 (V), этилацетат-метанол-вода, 70 : 15 : 8 (VI), ацетон-хлороформ-вода, 16 : 4 : 1 (VII), 15% уксусная кислота (VIII), бутанол-уксусная кислота-вода, 4 : 1 : 2 (IX). Для нисходящей хроматографии кумаринов использовали импрегнированную смесью формамид-ацетон (1 : 1) бумагу. Для обнаружения ксантонов и флавоноидов использовали 3% спиртовый раствор алюминия хлористого, пары аммиака, для тритерпеновых соединений - 1% раствор ванилина в концентрированной серной кислоте, 20% раствор фосфорновольфрамовой кислоты, для иридоидных соединений - 0,2% раствор диа-зотированной сульфаниловой кислоты, 20% водный раствор карбоната натрия.
Для обнаружения иридоидов 1,0 г полиэкстракта растворяли в 100 мл 70% этанола. 1 мл спиртового раствора полиэкстракта элюировали на колонке с окисью алюминия (масса сорбента - 3,0 г) 25 мл 70% этанола. Элюат концентрировали до 2 мл, хроматографировали на пластинке с силикагелем в системе растворителей VI, VII. Пластинку прогревают при 60 °С в течение 5 мин.
Для количественного определения ксантоновых агликонов 1,0 г (точная навеска) полиэкстракта четырежды экстрагировали 20 мл хлороформа, растворитель удалили, сухой остаток растворили в 50 мл 96% этанола. 1 мл извлечения элюировали на колонке с полиамидом (2,0 г масса сорбента) 25 мл 96% этанола. Колонку (диаметр
1,5 см) предварительно промыли дистиллированной водой и 96% этанолом. Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 328 нм на фоне 96% этанола, пропущенного через полиамидную колонку. В качестве стандартного образца использован спиртовый раствор сверциаперенина, пропущенного через колонку с полиамидом. Содержание ксантоновых агликонов (%) вычисляли по формуле
D ■ C ■ 50 • 25 • 100 • 100
X _----------------------,
D0 ■ m ■ 1 ■ (100 - w)
где D - оптическая плотность испытуемого раствора; C - концентрация раствора сверциаперенина, г/мл; Do
- оптическая плотность раствора сверциаперенина; m-- навеска полиэкстракта, г; w - влажность полиэкстракта, %.
Приготовление стандартного раствора сверциаперенина: 0,050 г (точная навеска) высушенного при 60 °С вещества растворяют в 200 мл 96% этанола. 1 мл раствора элюируют на колонке с полиамидом 25 мл 96% этанола.
Для определение антиоксидантной активности in vitro использована модельная система, представляющая собой суспензию желточных липопротеидов. АОА извлечений определяли по способности тормозить накопление продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в суспензии желточных липопротеидов со спектрофотометрическим детектированием при 532 нм [11]. Величину АОА выражали в С Д, (г/л)-1 -концентрации экстракта, необходимой для ингибирования образования малонового диальдегида (МДА) на 50%. Данные опытов приведены в таблице 2.
Обсуждение результатов
Для разделения фракции 1 на колонке с силикагелем использовали системы растворителей I и II. Выделены индивидуальные соединения, идентифицированные как сверциаперенин (выход 0,385 г), декуссатин (выход 0,013 г), сверхирин (выход 0,064 г), 1-гидрокси-4,6,8-триметоксиксантон (выход 0,365 г) по литературным данным [4, 5].
Сверциаперенин - 1,8-диокси-3,7-диметоксиксантон, желтые кристаллы, Т пл 184-186 °С, УФ спектр, Х^ (EtOH), нм: 241, 266, 312, 328, 386. R f - 0,55 (I), 0,44 (II).
1-окси-4,6,8-триметоксиксантон, желтые игольчатые кристаллы, Тпл 218-219 °С, УФ спектр, Х^ (EtOH), нм: 238 пл., 256, 281, 303, 335. R f -0,40 (I), 0,13 (II).
Декуссатин - 1-окси-3,7,8,-триметоксиксантон, желтые кристаллы, Тпл 155-157 °С, УФ спектр, Х^ (EtOH), нм: 243, 262, 312, 380. R f - 0,45 (I), 0,21 (II).
Сверхирин- 1,8-диокси-3,5 диметоксиксантон, желтые кристаллы, Тпл 187-189 °С, УФ спектр, Х^ (EtOH), нм: 238, 253, 277, 303 пл., 333. Rf - 0,60 (I), 0,57 (II).
Из фракции 2 выделены 2 тритерпеновых соединения, один из которых с достоверным образцом идентифицирован как олеаноловая кислота (выход - 0,32% от массы сырья). В хлороформной фракции извлечения присутствуют 3 кумариновых вещества, 2 из которых идентифицированы с достоверными образцами как скополетин с Rf - 0,25 (II), 0,76 (импрегнированная БХ, III), 0,60 (VIII), 0,45 (IX) и умбеллиферон с Rf -
0,40(11), 0,42 (импрегнированная БХ, III), 0,58 (VIII), 0,91 (IX). Из флавоноидных агликонов в хлороформной фракции доминирует лютеолин с - 0,9 (V). Из этилацетатной фракции выделен ксантоновый гликозид мангиферин (выход 0,011 г) с -0,30 (IV), 0,35 (VIII), 0,25 (IX), идентифицированный с достоверным образцом. Из бутанольной фракции извлечения выделен доминирующий флавоноидный гликозид (выход -
0,085 г) с ^ - 0,57 (IV), 0,64 (VIII), 0,40 (IX).
В полиэкстракте L. carinthiacum содержится наиболее полный комплекс полярных и неполярных БАВ (табл. 1). УФ-спектр полиэкстракта, очищенного на колонке с окисью алюминия, имеет максимум поглощения
- Хмах 240 нм, что совпадает с УФ-спектром иридоида сверциамарина [8]. На хроматограмме элюата (система растворителей VI и VII) сверциамарин с - 0,40 (VI), 0,32 (VII) проявляется в виде красного пятна (реактив проявления - 0,2% раствор сульфаниловой кислоты и 20% раствор карбоната натрия), синего пятна (реактив проявления - 1% ванилин в конц. серной кислоте). Для количественного определения иридоидов использован удельный показатель поглощения сверциамарина при 240 нм, который равен 228,4 [8].
Для определения аналитической длины волны ксантоновых агликонов снимали УФ-спектры элюатов полиэкстракта (Хиах 267 пл., 277 пл., 335 нм), хлороформной фракции полиэкстракта (Х^ 277 пл., 328 нм), гидролизата полиэкстракта (Х^ 325 нм), очищенных на колонке с полиамидом. В качестве стандартного вещества выбран сверциаперенин, доминирующий компонент суммы ксантоновых соединений, максимум поглощения которого (328 нм) близок с максимумом поглощения хлороформной фракции полиэкстракта. Установлен удельный показатель поглощения сверциаперенина при 328 нм - 516,9±2,7.
В липофильной части полиэкстракта содержатся агликоны ксантонов и флавоноидов, кумарины, тритерпе-ны, каротиноиды. АОА полиэкстракта составляет 33,3 (г/л)-1, после удаления липофильных веществ - 18,2 (г/л)-1 (табл. 2). При этом после удаления липофильных веществ АОА ненамного увеличивается в диапазоне малых доз экстракта (до 0,0125 мг/мл), но затем резко снижается из-за отсутствия эффективных гидрофобных антиоксидантов. В диапазоне более высоких доз АОА экстрактов выравнивается.
АОА БАВ зависит не только от их структурных особенностей, но и от их локализации и распределения в гидрофильной и гидрофобной фазах липидных мембран. Каротиноиды - ингибиторы пероксирадикалов и синглетного кислорода и, благодаря гидрофобной природе и способности встраиваться в липопротеидную структуру расходуются прежде гидрофильных АО. В реакции с пероксильными радикалами большинство ка-ротиноидов проявляют только АОА, кроме Р-каротина, который в высоких концентрациях и в присутствии ионов железа может индуцировать свободно-радикальные реакции [12]. В нашем опыте вклад каротиноидов в суммарную АОА полиэкстракта из-за невысокого их содержания можно оценить как положительный.
Известно, что флавоноиды ингибируют ПОЛ на стадии как инициации, так и продолжения цепи, выступая донорами атомов водорода для перекисных радикалов. Образующиеся при этом флавоноидные радикалы вступают в реакции диспропрорционирования с другими радикалами. Флавон лютеолин - доминирующий флавоноид полиэкстракта L. carinthiacum, является эффективным ингибитором процессов ПОЛ [13, 14]. Кумарины, не имеющие В-кольцо, в отличие от флавоноидов, проявляют незначительную АОА [13]. АОА эскулетина, оцененная по величине констант скоростей расщепления лактонного кольца, превышала таковую умбеллиферона, кумарина [15]. В механизме противовоспалительного действия растительных препаратов, в котором антиоксидантный потенциал БАВ является важным звеном, кумарины играют не последнюю роль. Скополетин, умбеллиферон, эскулетин тормозят образование продуктов липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты [16].
Таблица 1. Количественное содержание биологически активных веществ в полиэкстракте L. carinthiacum и метрологические характеристики
Наименование Ї X й X «РЛ Ат Е , %
Каротиноиды в пересчете на Р-каротин, мг % 4 9,95 0,1305 2,78 0,3628 3,65
Тритерпеновые сапонины в пересчете 4 16,50 0,1923 2,78 0,5346 3,24
на олеаноловую кислоту, %
Кумарины в пересчете на скополетин, % 6 0,43 0,0060 2,45 0,0149 3,47
Ксантоновые агликоны в пересчете 10 1,02 0,0179 2,23 0,0399 3,92
на сверциаперенин, %
Флавоноиды в пересчете на лютеолин, % 6 1,90 0,0172 2,45 0,0423 2,23
Полифенолы в пересчете на таннин, % 4 6,03 0,0652 2,78 0,1815 3,01
Иридоиды в пересчете на сверциамарин, % 10 5,84 0,1016 2,23 0,2265 3,88
Аскорбиновая кислота, % 4 7,52 0,0743 2,78 0,2068 2,75
Водорастворимые полисахариды, % 2 2,0 0,0196 4,30 0,0844 4,22
Таблица 2. Антиоксидантная активность экстрактов
Ингибирование образования МДА, %
Наименование С / мг/мл Концентрация экстрактов, мг/мл
0,0037 0,0123 0,0373 0,1230 0,3730 0,б700
Экстракт 1 0,030 4 19 б2 83 88 83
Экстракт 2 0,033 12 24 39 7б 88 83
Ксантоны ингибируют ПОЛ, проявляют гепатопротекторное, противовоспалительное, антиязвенное, хо-леретическое, противотуберкулезное действия, ряд ксантонов ингибирует моноаминооксидазу типа А и В [17, 18]. Гепатопротекторная активность ксантонов связана с их АОА. Так, защитные свойства 3-замещенных ксантонов на модели токсического гепатита были более выражены, чем у признанного гепато-протектора силибина, АОА которого зависит от его локализации в водной фазе липидных мембран [19, 20]. Ксантоновый С-гликозид мангиферин также проявляет АОА, стабилизирует лизосомальные мембраны, в экспериментах на крысах проявляет противовоспалительное действие, противоопухолевую и иммуностимулирующую активности [21].
Присутствующие в большом количестве в липофильной фракции полиэкстракта тритерпеновые соединения замедляют процесс ингибирования ПОЛ в диапазоне малых доз. Олеаноловая кислота - доминирующий тритерпеноид полиэкстракта - является слабым АО по сравнению с другими фенольными АО [22].
Таким образом, флавоноидные и ксантоновые агликоны, кумарины, каротиноиды, содержащиеся в полиэкстракте L. carinthiacum обусловливают АОА полиэкстракта, при их удалении АОА экстракта уменьшается в 1,8 раза. Слабые ингибиторы ПОЛ - тритерпеновые соединения - замедляют процесс ингибирования, при их удалении АОА полиэкстракта при малых дозах незначительно увеличивается.
Выводы
Из надземной части L. carinthiacum получен полиэкстракт, содержащий сумму липофильных и гидрофильных веществ. Липофильная часть полиэкстракта, содержащая каротиноиды, агликоны флавоноидов, ксантонов вносит существенный вклад в суммарную антиоксидантную активность полиэкстракта, которая составляет 33,3 (г/л)-1, после удаления липофильных веществ - 18,2 (г/л)-1.
Список литературы
1. «Чжуд-ши»: канон тибетской медицины / пер. с тибетского Д.Б. Дашиева. М., 2001. 766 с.
2. Гаммерман А.Ф., Семичов Б.В. Словарь тибетско-латино-русских названий лекарственного растительного сырья, применяемого в тибетской медицине. Улан-Удэ, 1963.
3. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование: семейства Caprifoli-aceae -Plantaginaceae. Л., 1990. 326 с.
4. Sorig T., Toth I., Bujtas Gv. Isolierung von xanthonen aus Lomatogonium carinthiacum (Wulfen). Rchb. // Pharmazie. 1977. V. 32. H. 12. P. 803.
5. Schaufelberger D., Hostettmann K. Flavonoid glycosides and a bitter principle from Lomatogonium carinthiacum // Phytochemistry. 1984. V. 23. №4. P. 787-789.
6. Самбуева З.Г., Цыренжапов А.В. Желчегонное растительное сырье традиционной медицины // Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии. Улан-Удэ, 2006. С. 109-110.
7. Лубсандоржиева П.Б. Фитохимическая характеристика тонкоплодника дымянкового, гипекоума прямого, ло-матогониума каринтийского, бадана толстолистного // Сб. научных трудов ВСГТУ. Серия: Химия биологически активных веществ. Улан-Удэ, 1995. Вып. 2. С. 14-19.
8. Даргаева Т.Д. Теоретическое и экспериментальное обоснование технологии и стандартизации многокомпонентных растительных лекарственных препаратов, применяемых при заболеваниях пищеварительной системы: автореф. дис. ... д-ра фарм. наук. М., 1994. 48 с.
9. Чемесова И.И., Чубарова С.Л., Саканян Е.И., Котовский Б.К., Чижиков Д.В. Спектрофотометрический метод количественной оценки содержания полифенолов в сухом экстракте из надземной частиMelilotus officinalis (L.) Pall. и в его лекарственной форме (таблетках) // Раститительные ресурсы. 2000. Т. 36. Вып. 1. С. 86-91.
10. Российская Г.И., Лякина М.Н., Брутко Л.И. Определение тритерпеновых сапонинов в плодах боярышника // Химия природных соединений. 1989. №2. С. 230-232.
11. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкина Ю.О. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов. // Лабораторное дело. 1988. №5. С. 59-62.
12. Polyakov N.E., Leshina V., Konovalova A., Kispert L.D. Carotenoids as scavengers of free radicals in a Fenton reaction: antioxidants or pro-oxidants? // Free Radic. Biol. Med. 2001. V. 31. №3. P. 398-404.
13. Arora A., Nair M.G., Strasburg G.M. Structure-activity relationships for antioxidant activities of a series of flavonoids in a liposomal system // Free Radic. Biol. Med. 1998. V. 24. №9. P. 1355-1363.
14. Sadik C.D., Sies H., Schtwe T. Inhibition of 15-lipoxygenases by flavonoids: structure - activity relations and mode of action // Biochem. Pharmacology. 2003. V. 65. P. 773-781.
15. Орлов Ю.Е. Химическое строение и антиоксидантная активность в ряду природных кумаринов // Химия природных соединений. 1986. №3. С. 367.
16. Парфенов Э.А., Смирнов Л.Д. Фармакологический потенциал антиоксидантов на основе кумарина (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. 1988. Т. 22. №12. С. 1438-1448.
17. Peres V., Nagem T.J. Trioxygenated naturally occurring xanthones // Phytochemistry. 1997. V. 44. №2. P. 191-214.
18. Peres V., Nagem T.J., De Oliveira F.F. Tetraoxygenated naturally occurring xanthones // Phytochemistry. 2000. V. 55. P. 683-710.
19. Saua A., Scalese M., Lanza M., Marzullo D., Bonina F., Castelli F. Flavonoids as antioxidant agents: importance of their interaction with biomembranes // Free Radic. Biol. Med. 1995. V. 19. №4. P. 481-486.
20. Fernandes E.R., Carvallo F.D., Remiao F.G., Bastos M.L., Pinto M.M., Gottlieb O.R. Hepatoprotective activity of xan-thones and xanthonolignoids against tert-butylhydroperoxide-induced toxicity in isolated rat hepatocytes - comparison with silybin // Pharmaceutical Research. 1995. V. 12. №11. P. 1756-1760.
21. Chattopadhyay U., Chaudhuri L., Ghosal S. Immunostimulatory activity of mangiferin, a naturally occurring xanthone-c-glucoside // Pharmaceutical Research. 1986. V. 3. №5. P. 307-308.
22. Шкарина Е.И. Изучение антиоксидантных свойств препаратов на основе лекарственного растительного сырья: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. М., 2001. 28 с.
Поступило в редакцию 1S июня 2007 г.
