CC BY
371
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
Therapeutic gastroenteroiogN
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА
ЛазебникЛ.Б.1, Парфенов А.И.1, Князев О.В.1, Коноплянников А.Г.2, Сагынбаева В.Э.1, Яковлева М.В.3, Астрелина Т.А.3, Ручкина И.Н.1, Щербаков П.Л.1 Трубицына И.Е.1, Царегородцева Т.М.1, Гудкова Р.Б.1, Рогозина В.А.1, Чикунова Б.З.1, Хомерики С.Г.1, Михайлова З. Ф.1
1 ГУ Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии ДЗ г. Москвы
2 Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск
3 ГУЗ Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы
Князев Олег Владимирович 111123, Москва, ш. Энтузиастов, д. 86 E-mail: oleg7@bk.ru
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым относятся язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), являются одной из наиболее серьезных проблем современной гастроэнтерологии, это обусловлено постоянным ростом заболеваемости среди наиболее трудоспособного возраста населения, их инвалидизации. Наибольшее число случаев приходится на возраст 20-40 лет, что делает данную группу заболеваний социально значимой [1]. Например, в США насчитывается более 250 тыс. больных ВЗК — это 25 млн врачебных визитов, 29 тыс. госпитализаций и огромные финансовые потери. В результате стоимость лечения одного больного ВЗК в США составляет порядка 20-50 тыс. долларов в год, что в масштабах страны приводит к ежегодным затратам около 2 млрд долларов. Частота ЯК в России составляет 20:100000 населения (из них около 10% приходится на детей).
Несмотря на достижения фундаментальной медицины в изучении патогенеза ВЗК и широкий спектр применяемых лекарственных средств, течение БК и ЯК приводит к тяжелым осложнениям, оперативным вмешательствам и выходу на инвалидность лиц молодого, трудоспособного возраста. Данные проблемы потребовали разработки новых терапевтических направлений в лечении больных ВЗК и новых подходов, основанных на системном и комплексном терапевтическом воздействии на данную патологию. Патогенетическое лечение ВЗК заключается в выработке принципиально новой «биологической» лечебной стратегии, получившее название биологической терапии (БТ). Эта стратегия основана на концепции о ведущей роли воспалительных цитокинов (а-ФНО, ИЛ-1,
ИНФ-у и др.) в патогенезе воспаления и возможной их блокаде биологическими агентами. Основная задача биологических методов лечения — подавление эффекторных сигналов на разных уровнях и разрыв порочного круга воспаления [2].
На сегодняшний день предложено достаточно много биологических методов, но лишь немногие из них успешно используются, практическое применение остальных остается делом ближайшего или отдаленного будущего. Изучается эффективность селективных ингибиторов молекул адгезии, стимуляторов роста и дифференцировки клеток, ингибиторов рецепторов провоспалительных цитокинов [3]. Помимо инфликсимаба и адалимумаба, которые в течение многих лет эффективно используются в лечении ВЗК, синтезированы новые противовоспалительные антицитокиновые соединения. Пептид БЛР58, состоящий из девяти В-аминокислот и глицина, способный блокировать синтез фактора некроза опухоли-а (а-ФНО), а также подавляет продукцию интерферона у (ИНФ-у), интерлейкина-2, -12 (ИЛ-2, ИЛ-12); этанерцепт, искусственно синтезированный белок, сочетающий растворимые человеческие рецепторы II типа к а-ФНО и человеческий 1§С1 с Fc-фрaгментом, обладающий двойным действием, связывая а-ФНО и лимфотоксин А; онерсепт (рекомбинантный ФНО-связывающий протеин) представляет собой нормальные человеческие растворимые ФНО-рецепторы I типа. СDР571 — один из новых препаратов — ингибиторов а-ФНО, представляющий собой гуманизированные моноклональные антитела к а-ФНО, блокирует растворимый и мембраносвязанный а-ФНО, но не вызывает лизиса воспалительных клеток.
7
№02/2011 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
Однако по результатам исследований было сделано заключение, что CDP571 является безопасным препаратом, но не таким эффективным, как инфлик-симаб, и дальнейшие его клинические испытания для лечения БК были прекращены [4]. Лиганд CD40 (CD40L), экспрессируемый на Т-лимфоцитах после их взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками (АПК), участвует в активации Т клеток. Г уманизированные моноклональные антитела к CD40L были использованы во II фазе исследования безопасности и эффективности препарата у больных с болезнью Крона умеренной и высокой степени активности. Однако из-за развития тромбоэмболий, лимфопении исследование было приостановлено. Визилизумаб (антитела к CD3) может вызывать апоптоз активированных Т-клеток и стимулировать выработку ИЛ-10, являющегося мощным противовоспалительным цитокином. К сожалению, исследование было приостановлено в 2007 году, когда предварительный анализ показал, что нет преимуществ между рекомбинантным ИЛ-10 и плацебо у больных рефрактерной БК, а попытки увеличить дозу ИЛ-10 привели к развитию анемии и тромбоцитопении. Сиртолизумаб — пегилированный гуманизированный фрагмент Fab, который связывает а-ФНО, но не фиксирует комплемент, вводится подкожно. Препарат допущен для клинического использования при лечении БК в США, но не в Европе.
Недавно закончены пилотные испытания тали-домида. Талидомид ингибирует главным образом продукцию а-ФНО in vitro и, по-видимому, синтез а-ФНО и NFkb макрофагами in vivo. Кроме того, он угнетает Тх1-цитокиновую продукцию (ИЛ-2 и ИНФ-у) и индуцирует образование Тх2-цитокинов (ИЛ-10 и ИЛ-4), обладающих противовоспалительной активностью. В двух открытых исследованиях продемонстрирована клиническая эффективность талидомида при стероидрезистентной БК и возможность снижения доз гормонов [5], но серьезные побочные реакции, даже при низких дозах препарата, не позволяют применять этот вид терапии в существующем виде. Анти-ИЛ-6В. — гуманизированное моноклональное антитело к ИЛ-6В. (MRA) — было разработано для лечения активной БК. Исследования эффективности и безопасности препарата продолжаются. Анти-ИЛ-2-рецептор (CD25) антител (даклизумаб и базиликсимаб). Даклизумаб является гуманизированным IgG1 рекомбинантным моноклональным антителом к рецепторам ИЛ-2 (CD25), который блокирует связывание ИЛ-2 с ИЛ-2-рецепторами. Открытое экспериментальное исследование даклизумаба продемонстрировало эффективность у больных с активным течением ЯК [6]. Фонтолизумаб является гуманизированным моноклональным антителом к ИНФ-у [7]. Исследования продемонстрировали хорошую безопасность и переносимость препарата, но необходимы дальнейшие исследования.
Еще одной мишенью для биологического лечения считаются молекулы адгезии, которые играют
большую роль в развитии воспаления при ВЗК, вызывают миграцию клеток из сосудистого русла в очаг воспаления, то есть способствуют усилению воспалительной инфильтрации слизистой оболочки и хомингу лимфоцитов. Блокирование молекул адгезии (в частности, интегрин-а4, 1САМ-1 и др.) также является одним из разрабатываемых направлений в лечении ВЗК. Натализумаб является рекомбинантным, гуманизированным моноклональным антителом IgG4 к а4 интегрину, который блокирует патологические эффекты молекул адгезии, уменьшает хоуминг лейкоцитов и способствует заживлению язвенных дефектов [8]. Несмотря на многообещающий результат поддерживающей терапии, лечение натализумабом было приостановлено после нескольких случаев прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопа-тии. Заболевание почти всегда возникает у больных СПИДом, лейкемией или пациентов, перенесших трансплантацию органов, является фатальной оппортунистической инфекцией центральной нервной системы, вызванной активизацией вирусами полиомиелита. Но в последнее время препарат вернулся на рынок в США для больных БК с множеством рекомендаций по безопасности. Гормон роста человека и различные факторы роста, такие как ТФР-^, который выделяется ^3-клетками и обеспечивает отрицательную обратную связь в дифференциации наивных Т-хелперов на ^1- или ^2-подтипы, эпидермальный фактор роста (ЭФР) и фактор роста-1 кератиноцитов (KGF-1), могут играть важную роль в патогенезе ВЗК [9]. Потенциально их можно использовать для лечения и восстановления целостности слизистой оболочки кишки. Список биологически активных препаратов можно было бы продолжать, так как по мере изучения патогенеза ВЗК, выявления его звеньев, представленных различными соединениями, синтезируются новые антитела к провоспалитель-ным агентам и стимуляторы противовоспалительных биологически активных веществ.
Показания к применению моноклональных антител в лечении ВЗК расширяются, и у них есть несомненные преимущества перед системными иммунодепрессантами. Пациенты в долгосрочной перспективе могут получать препараты, поддерживающие ремиссию заболевания, и тем самым обеспечивать полноценное качество жизни. Исследования в этом направлении продолжаются. Но, несмотря на очевидные достижения в терапии ВЗК, проблема фармакотерапии остается до конца не решенной, около 30% больных ВЗК нуждаются в проведении альтернативной биологической терапии [10]. В свете этого стоят задачи дальнейшего поиска методов, направленных на уменьшение выраженности клинических проявлений заболевания, предотвращение возникновения рецидивов, минимизацию побочных эффектов лечения, улучшение качества жизни.
Понятие биологической терапии более широкое и включает помимо применения биологически активных веществ с различными механизмами действия клеточную и генную терапию [11]. Целью
клеточной терапии является замещение, регенерация и обновление поврежденных клеток и тканей, восстановление их функции путем дифференциации клеток-предшественников и/или путем активации эндогенных резидентных стволовых клеток. Благодаря внедрению в медицинскую практику достижений фундаментальных исследований в области молекулярной и клеточной биологии стало возможным разрабатывать новое направление в лечении с использованием костномозговых стволовых клеток, которое получило название «регенеративная медицина». Клеточные технологии и лечение стволовыми клетками (СК) — это новое направление биологической терапии последнего десятилетия. Притом что клеточная терапия — не панацея, совершенно очевидно, что такая терапия в сочетании со стандартной терапией заболевания может дать даст наилучший эффект. В настоящее время методы трансплантации СК используют в клинической практике при лечении заболеваний системы крови (лейкозы, анемии), врожденных иммунодефицит-ных состояний, острой печеночной недостаточности, цирроза и наследственных метаболических заболеваний печени, дегенеративных заболеваний нервной ткани, инсультов, паркинсонизма, коррекции инсулинзависимого диабета тяжелых форм течения. Положительные предварительные результаты проводимых в различных странах клинических и экспериментальных исследований обосновывают актуальность, перспективность и достаточную безопасность метода трансплантации аллогенных МСК костного мозга для лечения больных ВЗК.
Впервые термин «стволовая клетка» А. А. Максимов сформулировал в 1909 году в статье «Лимфоцит как общая стволовая клетка разнообразных элементов крови в эмбриональном развитии и постфетальной жизни млекопитающих». Настоящий прорыв произошел в 60-70-е годы, когда А. Я. Фриденштейн и соавт. обнаружили стволовые клетки в мезенхиме (строме) «взрослого» костного мозга; в дальнейшем их стали называть мезенхимальными стромальными клетками (МСК) [12]. Тогда же появились работы, доказывающие наличие стволовых клеток практически во всех органах взрослых животных и человека [13]. Клеточная трансплантация как наиболее физиологичный вариант заместительной терапии получает все большее распространение. Этот метод рассматривается как возможный дополнительный либо самостоятельный способ коррекции функциональной несостоятельности некоторых органов и тканей.
Имеющиеся в настоящее время публикации свидетельствуют о том, что МСК костного мозга обладают очень широкой пластичностью. Многолетние исследования показали, что эти клетки способны дифференцироваться в костную, хрящевую и соединительную ткани, костномозговые элементы, миобласты, кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, нервные клетки, эпителиальные клетки легких. Существует ряд работ, демонстрирующих
дифференцировку стволовых клеток слизистой оболочки кишечника в зрелые эн-тероциты. Многочисленные данные свидетельствуют об иммуномодулирующих свойствах МСК костного мозга. Хотя точные механизмы иммунорегуляторного действия аутологичных и аллогенных МСК до конца не известны, большинство исследований показывают, что они реализуются с помощью растворимых факторов, к которым относят: трансформирующий фактор роста (ТФР-01), фактор роста гепатоцитов (HGF), простагландин Е2 (PGE2) и индоламин-2,3-диоксигеназу. Золотым стандартом клеточной терапии до недавнего времени считалась аутологичная трансплантация, в настоящее время наибольший интерес представляет интерес аллогенная трансплантация мезенхимальных стромальных клеток в связи с их особой ролью в лимфопоэзе, в частности в положительной селекции Т-лимфоцитов, а следовательно, влиянии на иммунитет реципиента [14]. Характер взаимодействия МСК с клетками реципиента позволяет осуществлять аллоген-ную трансплантацию несовместимых по антигенам главного комплекса гистосовместимости (MHC) МСК без сопутствующей иммуносупрессии.
Установлено, что иммунотолерантность к МСК со стороны иммунной системы реципиента не обусловлена отсутствием или низкой степенью экспрессии молекул MHC на поверхности МСК. Так была обнаружена высокая степень экспрессии антигенов MHC I класса и отсутствие антигенов MHC класса II, которые обнаруживались внутриклеточно [15], а после добавления в культуру гамма-интерферона MHC II класса экспрессировались и на клеточной поверхности. Однако МСК человека не экспрессируют костимулирующие молекулы B7-1, B7-2 и CD40 [16], при отсутствии которых контакт Т-клеточного рецептора и MHC приводит к состоянию анергии Т-лимфоцитов [17]. Согласуясь с приведенными данными, в экспериментах in vivo при аллогенной трансплантации МСК и их дифференцировке не отмечалось каких-либо иммунологических реакций отторжения при отсутствии иммуносупрессии [18].
В настоящее время существуют 79 зарегистрированных клинических протоколов для оценки эффективности комплексной терапии с применением МСК. В Соединенных Штатах проводятся исследования 28 протоколов, 19 — в Европе, 16 — в Китае, 5 — на Ближнем Востоке, 4 — в Индии, 3 — в Канаде, по 2 в Африке и Японии и 1 в Австралии, что указывает на высокий интерес к МСК в качестве потенциальной терапии различных заболеваний. Однако результаты многих клинических исследований противоречивы, что может быть обусловлено недостаточными знаниями фармакокинетики и фармакодинамики МСК. Последние исследования показали, что при системном введении менее 1% МСК сохраняются в организме через неделю после
^-----------------------------------------------------------------
терапевтическая гастроэнтерология
therapeutic gastroenterology
№02/2011 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
трансплантации [19; 20]. Полученные результаты клинических исследований демонстрируют, что терапевтический эффект обусловлен не столько трансформацией и дифференцировкой СК, а действием паракринной сигнализации в качестве основного механизма действия МСК [21-23]. Это в свою очередь требует разработки новой стратегии оптимальных режимов дозирования и введения МСК.
Полученные положительные результаты экспериментальных исследований позволили перейти к многоцентровым клиническим испытаниям трансплантации стволовых клеток в различных отраслях медицины. Любая терапия должна быть направлена на улучшение прогноза заболевания, улучшение качества жизни больных. Это особенно важно, поскольку в большинстве случаев ВЗК имеют неблагоприятное течение и, как указывалось ранее, приводят большинство пациентов к инвалидиза-ции. Цель терапии ВЗК — индукция и сохранение стойкой ремиссии, отмена стероидов/иммуносупрессоров или уменьшение потребности в них, профилактика осложнений, уменьшение потребностей в госпитализациях и хирургическом лечении.
В ЦНИИГ проводилась работа, целью которой являлось изучение эффективности и безопасности применения трансплантации МСК костного мозга в комплексной терапии больных с хроническим непрерывным и хроническим рецидивирующим течением ЯК и БК, а также проводилось сравнение биологической терапии (клеточной и селективным иммунодепрессантом-инфликсимабом (ИНФЛ)) со стандартной терапией препаратами 5-аминоса-лициловой кислоты (5-АСК), глюкокортикостероидами (ГКС) и иммуносупрессорами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В основу работы положены результаты обследования 132 больных ВЗК с хроническим непрерывным и хроническим рецидивирующим течением, находившихся на лечении в отделении патологии кишечника ЦНИИ гастроэнтерологии. Больные ВЗК в зависимости от метода лечения были разделены на три группы: 1-я группа, получавшая стандартную противовоспалительную терапию препаратами 5-АСК и ГКС в комплексе с трансплантацией МСК; 2-я группа, получавшая только стандартную противовоспалительную терапию препаратами 5-АСК и ГКС; 3-я группа больных, получавшая монотерапию ИНФЛ в дозе 5 мг/кг (индукция проводилась по схеме 0 - 2 - 6, поддерживающая терапия через 8 недель в течение года). Эффективность терапии ЯК и БК оценивалась нами по продолжительности ремиссии, по риску возникновения рецидива заболевания, по частоте госпитализаций в течение года, по снижению дозы или полной отмене преднизолона.
С 2008 года в отделении осуществлена трансплантация аллогенных МСК костного мозга 90 больным, что составило 9,6% всех больных ВЗК, пролеченных за данный период.
В качестве оценки критериев эффективности терапии мы использовали оценку клинического состояния больных (индекс Рахмилевича, индекс Беста), инструментальные (индекс Мейо), лабораторные методы исследования: цитокиновый статус — ИЛ-4, а-ФНО, ИЛ-ф, показатели гуморального иммунитета (иммуноглобулины [Щ G, М, А), антитела к цитоплазме нейтрофилов (IgG-BPI). Показатели клеточного иммунитета (субпопуляции Т- и В-лимфоцитов) определяли у больных, получивших культуру клеток через месяц после введения (абсолютное количество CD19+, CD19+CD5+, CD19+CD5—, CD19+CD10+, CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, отношение СБ4+/ СЭ8+ (иммунорегуляторный индекс), СБ3+СБ4+ СБ38+, СВ3+СБ16+СБ56+, СБ3+ НЬА ОВ.+, С03+С056+), морфологическое исследование слизистой оболочки (индекс Гебса). Через год от начала терапии у больных, получавших ИНФЛ, определяли уровень АТ к инфликсимабу.
В качестве оценки безопасности помимо эндоскопических методов исследования с проведением множественных биопсий мы проводили определение уровня онкомаркеров в сыворотке крови (СА 242 и СА 19-9). Данные обследования осуществлялись перед включением в исследование, через 2, 6, 12, 24, 30 и 36 месяцев.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенная трансплантация аллогенных МСК костного мозга достоверно способствовала снижению индекса клинической активности воспалительного процесса с 8,3 ± 0,26 до 1,8 ± 0,3 балла при ЯК, в группе больных, получавших ИНФЛ, — с 8,1 ± 0,2 до 1,7 ± 0,34 балла, а в группе больных, получавших препараты 5-АСК/ГКС, — с 8,1 ± 0,2 до 2,9 ± 0,4 балла. Аналогичные данные получены в группе больных БК, получивших культуру клеток: индекс Беста снизился с 246,9 ± 12,1 до 62,0 ± 8,87 балла, в группе ИНФЛ — с 265,5 ± 14,6 до 64,7 ± 19,7, в группе больных, получавших стандартную противовоспалительную терапию, — с 234,3 ± 10,9 до 90,4 ± 9,0 балла. Сходные тенденции демонстрировали индексы эндоскопической и патогистологической активности при проведении БТ: индекс эндоскопической активности Мейо при ЯК уменьшился с 7,7 ± 0,3 до 0,76 ± 0,2 балла (в группе сравнения — с 7,2 ± 0,4 до 2,6 ± 0,4), а также уменьшился индекс патогистологической активности Гебса с 4,4 ± 0,2 до 0,6 ± 0,18 (в группе сравнения — с 4,4 ± 0,2 до 1,2 ± 0,02).
Трансплантированные клетки стимулировали репаративные процессы, что приводило к большему проценту заживления слизистой оболочки кишки в данной группе больных по сравнению с группой, получавших терапию препаратами 5-АСК и иммуносупрессорами. Ремиссия заболевания у большинства больных ВЗК с хроническим непрерывным и хроническим рецидивирующим течением, которым проведена терапия ИНФЛ и трансплантированы МСК,
сохранялась более года. Системная трансплантация аллогенных МСК костного мозга в 80,5% случаев способствует преодолению гормонорезистентности и гормонозависимости у больных ЯК и БК; позволяет отказаться от приема иммуносупрессоров; в 2 раза уменьшить дозу принимаемых ГКС, а в 65% случаев — полностью отказаться от них и вернуться к терапии препаратами 5-АСК. У больных с хроническим рецидивирующим и непрерывным течением язвенного колита и болезнью Крона биологическая терапия увеличивает продолжительность ремиссии в среднем до 21,5 ± 2,7 месяца, в группе сравнения получающих препараты 5-АСК/ГКС — 11,6 ± 1,6 месяца (р < 0,05) и уменьшает частоту госпитализаций больных ВЗК до 20,5% (в группе больных, получавших 5-АСК/ГКС, — 66,6% (р < 0,05)).
Наши исследования продемонстрировали, что введение аллогенных МСК также оказывает иммуномодулирующий эффект, уменьшает интенсивность аутоиммунных реакций и активность воспалительного процесса у больных ВЗК. По мере увеличения частоты рецидивов, продолжительности заболевания и длительности базисной терапии системными иммунодепрессантами уровень цитокинов снижается. Это обусловлено угнетением функциональной активности иммунной системы, развитием вторичного иммунодефицита. Системная трансплантация аллогенных МСК оказывает системный разнонаправленный регулирующий эффект на воспалительный процесс. Введение аллогенных МСК повышает уровень сниженных иммуноглобулинов, видимо, обусловленный длительной иммуносупрессивной терапией: IgG — с 11,2 до 14,8 г/л; ^М — с 0,9 до 2,2 г/л; ^А — с 1,82 до 3,8 г/л и снижает уровень повышенных иммуноглобулинов: IgG — с 12,8 до 11,8 г/л; ^М — с 1,6 до 1,1 г/л; — с 2,6 до 1,5 г/ л. МСК также уменьшают интенсивность аутоиммунных реакций, снижая в течение 12 месяцев содержание аутоантител к антигенам цитоплазмы ней-трофилов (IgG-BPI) с 42 ± 2,8 до 12 ± 1,6 Ед/мл.
В патогенезе ВЗК задействованы многочисленные механизмы тканевого и клеточного повреждения. Одну из ведущих ролей может играть дисбаланс между регуляторными и эффекторными Т-клетками, обусловленный чрезмерной реакцией со стороны Т-лимфоцитов на внутрипросветные пищевые и бактериальные антигены, растет популяция В-лимфоцитов и плазмоцитов с последующим выделением медиаторов воспаления, которые вызывают деструкцию эпителиальных клеток слизистой оболочки толстой кишки.
До трансплантиции МСК у больных ЯК в период обострения заболевания абсолютное содержание В-лимфоцитов (CD19+) составило 0,26±0,06х109/л, содержание аутореактивного клона В-1 клеток (С019+С05+)- 0,04±0,01х109/л), В-2 лимфоцитов (С019+С05) - 0,2±0,05х109/л и В-клеток предшественников (CD19+CD10+) - 0,04±0,01х109/л.
После трансплантации МСК изменяется субпопуляция В-лимфоцитов, при этом абсолютное содержание В-лимфоцитов у больных ЯК практически
не изменилось и составило (0,27 ± 0,06) х 109/л, достоверно уменьшилось абсолютное содержание аутореактивного клона В1-лимфоцитов до (0,02 ± 0,007) х 109/ л (р <
0,05), содержание В2-клеток составило (0,24 ± 0,05) х 109/л, содержание В-клеток предшественников имело тенденцию к снижению и составило в абсолютных значениях (0,03 ± 0,008) х 109/ л (р > 0,05). Эти данные подтверждают снижение интенсивности системных аутоиммунных реакций у больных ЯК после трансплантации МСК, что коррелирует со снижением активности воспалительного процесса в кишечнике. До трансплантации МСК у больных ЯК в период обострения заболевания абсолютное содержание Т-лимфоцитов (СБ3+) составило (1,54 ± 0,27) х 109/л, содержание Т-хелперов (С03+С04+) — (0,9 ±
0,1) 109 /л, Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+) — (0,6 ± 0,09) х 109 / л, иммунорегу-ляторный индекс — 1,57 ± 0,04, активированных Т-хелперов (С03+С04+С038+) — (0,3 ± 0,1) х 109/л, активированных Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+CD38+) — (0,13 ± 0,3) х 109 / л и Т-киллеров (CD3+CD16+CD56+) — (0,15 ± 0,04) х 109/л. После трансплантации МСК абсолютное содержание Т-лимфоцитов (CD3+) незначительно уменьшилось и составило (1,37 ± 0,23) х 109 / л, содержание Т-хелперов (CD3+CD4+) — (0,77 ± 0,1) х 109/ л, содержание Т-цитотоксических лимфоцитов (СЭ3+СЭ8+) в абсолютных значениях не изменилось и составило (0,6 ± 0,09) х 109/ л, при этом произошло достоверное уменьшение иммунорегуляторного индекса — 1,39 ± 0,04 (р < 0,05). Уровень активированных Т-хелперов (CD3+CD4+CD38+) уменьшился до (0,17 ± 0,05) х 109/ л (р < 0,05), активированных Т-цитотоксических лимфоцитов (СЭ3+СЭ8+С038+) — до (0,065 ± 0,008) х 109/ л (р < 0,05), содержание Т-киллеров (CD3+CD16+CD56+) также имело тенденцию к снижению — (0,11 ± 0,04) х 109/ л (р > 0,05). Снижение содержания активированных Т-хелперов (СЭ3+СЭ4+С038+) и активированных Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+CD38+), а также достоверное уменьшение иммунорегуляторного индекса свидетельствует об иммуносупрессив-ном действии трансплантированных МСК.
После трансплантации МСК у больных ВЗК восстанавливался изначально пониженный уровень показателей гуморального иммунитета и цитоки-нового профиля, а также баланс про- и противовоспалительных цитокинов. Трансплантация МСК уменьшает активность воспалительного процесса у больных ВЗК: снижает уровень провоспалитель-ных цитокинов — а-ФНО, ИНФ-у и ИЛ-1; показателей острой фазы воспалительного процесса (СРБ, СОЭ, уровень лейкоцитов), в динамике повышает уровень противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 (с 11,4 до 23,6 пг/мл). Через 6 и 12 месяцев после введения МСК отмечался достоверный рост противовоспалительных цитокинов ТФР-Р1, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижение провоспалительных цитокинов
Б >
а
5 О
I- 2
О £ £
Щ а
Н}; £ ё
И
и
га
I.
Б
га
й
<и
т
I-
0
<и
с
га
а
ш
I-
№02/2011 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
интерферона у, а-ФНО, ИЛ-ф, что свидетельствовало о регуляторных свойствах МСК и готовности их к индукции восстановительных (репаративных) процессов. Системная трансплантация МСК костного мозга стимулирует угнетенный синтез цитокинов, снижает интенсивность иммунопатологических процессов при ЯК, в динамике способствует выработке противовоспалительных цитокинов ТФРф1, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижению уровня провоспалительных цитокинов интерферона у, а-ФНО, ИЛ-ф, обеспечивая в дальнейшем адекватный баланс про- и противовоспалительных цитокинов. Это одновременно сочетается с позитивной динамикой клинической и эндоскопической картины у больных ЯК и БК.
В нашей работе мы установили изменения ци-токинового статуса в слизистой оболочке толстой кишки после трансплантации МСК и сравнили полученные данные у больных, которым проводится терапия инфликсимабом и системными иммунодепрессантами. Биоптаты у больных 1-й, 2-й и 3-й групп брали до и через 2 месяца после лечения. В экстрактах слизистой толстой кишки иммуноферментным методом определяли содержание ИНФ-у, а-ФНО, ИЛ-4. Были получены следующие результаты: в 1-й группе больных ИНФ-у снизился с 1207,6 ± 125,3 до 499,2 ± 50,2 пг/г ткани (р < 0,05), а-ФНО — с 358,67 ± 38,1 пг до 187,67 ± 18,9 пг/г ткани, уровень ИЛ-4 также изменился с 541,6 ± 43,7 до 312 ± 29,8 пг/г ткани (р < 0,05). Во 2-й группе больных, получавших препараты 5-АСК и ГКС, уровень ИНФ-у изменялся следующим образом: до начала терапии — 237,6 ± 30,1 и 707,6 ± 72,5 пг/г ткани через 2 месяца от терапии (р < 0,05), уровень а-ФНО до начала активной терапии по поводу обострения заболевания составил 251,6 ± 24,6, после лечения — 418,2 ± 35,2 пг/г ткани (р < 0,05), ИЛ-4-277,2 ± 24,6 и 400,4 ± 39,8 пг/г ткани (р < 0,05). В 3-й группе ИНФ-у до лечения инфликсимабом составил 976,67 ± 101,46 пг/г ткани, после — 534,5 ± 48,9 (р < 0,05), а-ФНО до лечения — 675,84 ± 76,2 пг/г ткани, после — 122,7 ± 10,7, ИЛ-4 — до лечения 214,8 ± 22,6 пг/г ткани, после — 593,54 ± 49,97. Данные изменения являются подтверждением коррекции иммунного дисбаланса под влиянием МСК костного мозга. Установлено, что под влиянием МСК происходит постепенное снижение уровня провоспали-тельных цитокинов ИНФ-у, а-ФНО в ткани ко 2-му месяцу наблюдения. Однако и уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-4 также уменьшился, что может быть обусловлено обеспечением баланса про- и противовоспалительных цитокинов по мере стихания воспалительной активности.
Отсутствие снижения а-ФНО и ИНФ-у в ткани слизистой оболочки кишки в 1-й группе больных коррелировало с отсутствием положительного эффекта после трансплантации МСК. Повторное введение МСК устраняло цитокиновый дисбаланс в организме; в последующим снижение провоспалительных цитокинов было зарегистрировано в экстрактах слизистой оболочки кишки.
Аналогичная динамика цитокинового баланса была отмечена нами в сыворотке крови больных: происходит постепенное снижение уровня провоспалительных цитокинов ИЛ-ф, ИНФ-у, а-ФНО ко 2-му месяцу наблюдения. Уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-4 под влиянием МСК резко повышался, и значения этого показателя были достоверно выше по сравнению с другими группами.
Через год у 4 (26,6%) больных БК определялись антитела к ИНФЛ (АИНФЛ) от 165 до 314 нг/мл, в среднем 235,5 ± 37,5 нг/мл. У данных больных повышение уровня АИНФЛ сопровождалось ухудшением клинической картины — появление болевого синдрома, увеличение частоты стула, снижение уровня гемоглобина. Индекс Беста в среднем повысился со 103,9 ± 13,2 до 135,2 ± 15,0 (р > 0,05). Больным осуществлена однократная системная трансплантация аллогенных МСК костного мозга с целью повышения эффективности проводимой противовоспалительной терапии. Через 2 недели уровень АИНФЛ у всех четверых больных снизился до 7-15 нг/мл, в среднем до 8,5 ± 2,2 нг/мл (р < 0,001). Данное снижение сопровождалось уменьшением активности БК (снижение индекса Беста до 68,5 ± 4,6).
Применение новых медицинских технологий согласно Приказу Минздравсоцразвития России от 20.07.07 № 488 классифицируется в зависимости от степени потенциального риска применения в медицинских целях по трем классам. Клеточная терапия является медицинской технологией третьего класса. К данному классу относятся медицинские технологии с высокой степенью риска осложнений. Учитывая то, что клеточная терапия является медицинской технологией третьего класса, больным данной группы в период ремиссии необходимо проводить контрольные эндоскопические (коло-носкопию 1 раз в год, ректороманоскопию 4 раза в год) и рентгенологические исследования кишки.
Помимо применения инвазивных методов ранней диагностики рака мы ежемесячно определяли уровень онкомаркеров СА 242 и СА 19-9, что способствовало выявлению группы больных повышенного риска развития рака. Специфичность СА 242 позволяет проводить диагностику уже на ранних стадиях заболевания. По различным данным, с помощью этого теста удается прогнозировать развитие рецидивов колоректального рака за 5-6 месяцев. За 24 месяца наблюдения за больными, которым провели трансплантацию МСК, ни в одном случае не было зарегистрировано повышения уровня онкомаркеров и злокачественной трансформации ВЗК. Полученные нами данные согласуются с материалами исследований, подтверждающих, что трансплантация МСК костного мозга человека не приводит к развитию опухолевого процесса. За 10 лет клинических испытаний трансплантации МСК не было выявлено побочных эффектов, связанных с опухолевой прогрессией, что позволило FDA признать введение культуры МСК безопасным медицинским мероприятием.
Биологическая терапия во многом изменила основную стратегию терапии ВЗК и представления о ее возможностях. С помощью БТ оказалось возможным добиться значительного улучшения и даже полного устранения активности заболевания у больных, резистентных ко всем предшествующим методам лечения. Впервые появилась возможность считать реальной целью лечения БК и ЯК достижение стойкой и длительной ремиссии заболевания. Дальнейшее изучение фармакокинетики мезенхимальных стволовых клеток направлено на прогнозирование эффективности клеточной терапии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, полученные нами результаты демонстрируют, что трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга может рассматриваться как часть комплексной терапии ВЗК, способствуя повышению эффективности противовоспалительной терапии. Биологическая терапия воспалительных заболеваний кишечника наиболее эффективна по сравнению с традиционной противовоспалительной терапией.
Трансплантация аллогенных МСК оказывает иммуномодулирующий эффект, повышая уровень сниженных иммуноглобулинов, обусловленный длительной иммуносупрессивной терапией, а также уменьшает интенсивность аутоиммунных реакций. Изменение иммунного статуса больных ВЗК обусловлено иммуномодулирующими свойствами мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и связано с секрецией иммуносупрессив-ных факторов и взаимодействием поверхностных молекул [24]. По современным представлениям, иммунная система в здоровом организме находится в состоянии толерантности к разнообразным антигенам собственных органов и это состояние поддерживается определенным уровнем избытка циркулирующих органных антигенов. Однако в условиях хронического стресса, при наличии хронического, а особенно непрерывно рецидивирующего характера течения заболевания, во всех органах иммунной системы (костный мозг, тимус, селезенка) наступают глубокие морфофункциональные изменения. Развивается вторичный иммунодефицит
с ослаблением клеточного и гуморального иммунитета, цитокиновым дисбалансом, перераспределением иммунных клеток в организме и нарушением их информационной и миграционной активности, что также приводит к нарушению процессов регенерации.
В недавних работах НИИ трансплантологии и искусственных органов имени Шумакова было показано, что под влиянием МСК КМ происходит стимуляция Т-зон тимуса, а также Т- и В-зон селезенки, восстановление их структуры и функции. Отражением этого является нормализация цитокинового баланса и активизация процессов репаративной регенерации паренхиматозных тканей [25]. Данный факт является очень важным в понимании системного влияния трансплантированных МСК через центральные органы иммунорегуляции организма [26].
Трансплантированные клетки, как было нами показано, вносят свой вклад в регуляцию иммунного баланса, уменьшают степень выраженности воспалительного процесса в слизистой оболочке кишки, улучшая тем самым течение заболевания. Подтверждают наше предположение проведенные эксперименты, которые демонстрировали влияние костного мозга как центрального органа иммуногенеза на процессы морфогенеза в организме, что укладывается в концепцию влияния иммунорегуляторных клеток иммунной системы на процессы репаративной регенерации.
Вместе с тем важно подчеркнуть, что в условиях хронической патологии аллогенные клетки имеют преимущества перед аутологичными МСК: последние не могут адекватно участвовать в процессах восстановительной регенерации (воспринимать и направлять сигналы на регенерацию), так как при хроническом стрессе нарушаются процессы хоуминга и продукции тканеспецифических факторов адаптивного роста.
Подводя итог, можно сказать, что данный подход к лечению воспалительных заболеваний кишечника имеет большие перспективы для клинического использования, а клеточная терапия может использоваться в комплексной терапии больных хроническими заболеваниями органов пищеварения.
Б > а
So L 2
О i
ft U о
Hi
и
и
л
L
Б
Л
V
U
ш
т
S
I-
U
ш
с
л
a
и
I-
ЛИТЕРАТУРА
1. Халиф И.Л.,ЛоранскаяИ.Д. Воспалительные заболевания кишечника (неспецифический язвенный колит и болезнь Крона): Клиника, диагностика и лечение. — М.: Миклош, 2004. — 88 с.
2. Hanauer S.B., Feagan B.G., Lichtenstein G.R. et al. Maintenance infliximab for Crohnfs disease: The Accent I randomised trial // Lancet.
— 2002. — Vol. 359. — P. 1541-1549.
3. Travis S.P.L. Advances in therapeutic approaches to ulcerative colitis and Crohn's disease // Current Gastroenterology Reports / Hanauer S.B., Richter J.E. (eds.). — 2005. — Vol. 7. — P. 475-484.
4. Sandborn W.J., Feagan B.G., Radford-Smith G. et al. A randomized, placebo-controlled trial of CDP571, a humanized monoclonal antibody to TNF-a, in patients with moderate to severe Crohn’s disease // Gastroenterology. — 2003. — Vol. 124. — A61
5. Ehrenpreis E.D., Kane S.V., Cohen L.B. et al. Thalidomide therapy for patients with refractory Crohn's disease: an open-label trial // Gastroenterology. — 1999. — Vol. 117. — P. 1271-1277.
6. van Assche G., Sandborn W.J., Feagan B.G. et al. Daclizumab, ahumanised monoclonal antibody to the interleukin 2 receptor (CD25), for the treatment of moderately to severely active ulcerative colitis: a randomised, double blind, placebo-controlled, dose ranging trial // Gut. — 2006. — Vol. 55. — P. 1568-1574.
7. van Assche G., Pearce T. Fontolizumab (Huzaftm), a humanized anti-IFN-gamma antibody, has clinical activity and excellent tolerability in moderate to severe Crohn's disease // Gut. — 2004. — Vol. 53, Suppl. VI. — A48.
8. Sandborn W., Yednock T. Novel approaches to treating inflammatory bovel disease; targeting alpha-4 integrin // Am. J. Gastroenterol. — 2003. —
Vol. 98. — P. 2372-2382.
m
№02/2011 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
9. Beck P.L., Podolsky D.K. Growth factors in infl ammatory bowel disease // Inflamm. Bowel Dis. — 1999. — Vol. 5. — P. 44-60.
10. Wayne G. Overview of stem cell therapy for Crohn’s disease // Dryden University of Louisville, Division of Gastroenterology, Department of Medicine, 550 South Jackson Street, Louisville, KY 40202, USA / Expert Opin. Biol. Ther. — 2009. — Vol. 9, № 7. — P. 841-847.
11. Sands B.E. Biologic therapy for inflammatory bowel disease // Inflamm. Bowel Dis. — 1997. — Vol. 3. — P. 95-113.
12. Friedenstein A.J., Piatetzky S., Petrakova K.V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells // J. Embryol. Exp. Morphol. — 1966. — Vol. 16. — P. 381-390.
13. Verfaillie C.M. Multipotent adult progenitor cells: an update //
Novartis Found. Symp. — 2005, № 265. — P. 55-65.
14. Dejbakhsh-Jones S. et al. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells // J. Immunol. — 1995. — Vol. 155. — P. 3338-3344.
15. Le Blanc K. et al. HLA expression and immunologic propertiesof differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells // Exp.
Hematol. — 2003. — Vol. 31. — P. 890-896.
16. Majumdar M. et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells // J. Biomed. Sci. — 2003.
— Vol. 10. — P. 228-241.
17. Schwartz R.H. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy // Science. — 1990. — Vol. 248. — P. 1349-1356.
18. Djouad F. et al. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals // Blood. — 2003. — Vol. 102. — P. 3837-3844.
19. Lee R., Pulin A., Seo M. et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6 // Cell Stem. Cell. — 2009. — Vol.
5. — P. 54-63.
20. Zangi L., Margalit R., Reich-Zeliger S. et al. Direct imaging of immune rejection and memory induction by allogeneic mesenchymal stromal cells // Stem Cells. — 2009. — Vol. 27, № 11. — P. 2865-2874.
21. Phinney D., Prockop D. Concise review: mesenchymal stem/ multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair current views // Stem Cells. — 2007. — Vol. 25. — P. 2896-2902.
22. Parekkadan B., van Poll D., Suganuma K. et al. Mesenchymal stem cellderived molecules reverse fulminant hepatic failure // PLoS One. — 2007. — Vol. 2. — e941.
23. van Poll D., Parekkadan B., Cho C. et al. Mesenchymal stem cellderived molecules directlymodulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo // Hepatology. — 2008. — Vol. 47. — P. 1634-1643.
24. Uccelli A., Pistoia V., Moretta L. Mesenchymal stem cells: a new strategy for immunosuppression? // Trends Immunol. — 2007. — Vol. 28.
— P. 219-226.
25. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А., Макарова О.В. Восстановление морфофункционального состояния органов иммуногенеза и течение длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка при трансплантации культивированных клеток аутогенного костного мозга // Клеточная трансплант. и тканевая инженерия. — 2008. — Т. 3. — С. 36-42.
26. Rivera F.J., Sierralta W.D., Minguell J.J. et al. Adult hippocampus derived soluble factors induce a neuronal-like phenotype in mesenchymal stem cells // Neurosci. Lett. — 2006. — Vol. 406, № 1-2. — P. 49-54.
