CC BY
101
РАЗДЕЛ III
УДК Б1Б.211/.23-03Б.12:579.83
биологическая характеристика бактерий, колонизирующих слизистые оболочки дыхательных путей, при хронических заболеваниях
Е.В. Беляева, Е.В. Борискина, Г.Б. Ермолина, В.В. Кичикова, Н.А. Любавина,
Е.В. Макарова, Н.В. Меньков, И.С. Шкуркина, ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора», ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития»
Беляева Елена Вячеславовна - раб. тел.: (831) 433-79-03.
Исследован состав микрофлоры верхнего и нижнего отделов респираторного тракта больных
хроническими заболеваниями: ХОБЛ, хронические бронхиты, бронхиальная астма. Проведено изучение факторов патогенности и персистениии у выделенных культур стафилококков,
энтеробактерий и псевдомонад: лизоиимной, антилизоиимной, протеолитической активности и способности к образованию биопленки. Показано, что комплексом таких факторов в большей степени обладают стафилококки и псевдомонады, чем энтеробактерии.
Ключевые слова: хронические заболевания, респираторный тракт, адгезия, инвазия, персистениия,
микробиоиеноз.
Microflora composition of upper and low parts of respiratory passages of patients with chronic diseases (COPD, chronic bronchitis, bronchial allergy) has been studied. Factors of pathogenicity and persistency of the chosen cultures of staphylococci, enterobacteria and pseudomonads: lysozymic, antilysozymic, proteolytic activity and formation capability of biofilm have been investigated. Staphylococci and pseudomonads have demonstrated to possess the complex of these factors in a greater degree than enterobacteria.
Key words: chronic diseases, respiratory passages, adhesion, invasion, persistency, microbiocenosis.
Хронические заболевания нижних дыхательных путей (НДП), в частности хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), являются серьезной проблемой для здравоохранения из-за широкой распространенности, прогрессирующего течения, сокращения продолжительности жизни. Обострения хронических заболеваний НДП, способствующие прогрессированию болезни, могут быть вызваны различными инфекционными агентами, отличающимися выраженной способностью персистировать на слизистых оболочках респираторного тракта. Выявление таких микроорганизмов и изучение их свойств, способствующих адгезии, инвазии и персистенции на слизистых оболочках дыхательных путей, может расширить представление о течении воспалительного процесса и помочь в осуществлении адекватной терапии хронических легочных заболеваний.
Цель исследования - характеристика антибиотикорези-стентности, комплекса факторов патогенности и персистенции бактерий в составе микробиоценозов респираторного тракта больных хроническими заболеваниями НДП.
Материалы и методы
Была исследована микрофлора образцов мокроты больных ХОБЛ (61 чел.), хроническим необструктивным бронхитом (ХНБ) (11 чел.), бронхиальной астмой (БА) (17 чел.), а также
взятых от них мазков со слизистой зева и носа. Были выделены 573 культуры микроорганизмов, проведена их идентификация до рода и у 222 - до вида общепринятыми методами с использованием систем индикаторных бумажных для идентификации бактерий (НПО «Микроген») и СТРЕПТО-теста 16 («ЛАХЕМА», Чехия).
Определена чувствительность диско-диффузионным методом к антибиотикам у 227 культур бактерий в соответствии с МУК 4.2.1890-04 [1] и к антифунгальным препаратам - у 59 культур грибов рода Candida.
У 46 культур, выделенных при ХОБЛ (29 штаммов), ХНБ (6 штаммов), БА (11 штаммов), были определены антилизо-цимная и лизоцимная активности [2,3], протеолитическая активность по гидролизу казеина при рН 8,0 и гемоглобина при рН 4,0 с использованием внеклеточных экстрактов бактерий [4], гемагглютинирующие свойства [5], способность образовывать биопленку на полистироловом планшете по методике [6] в нашей модификации: окрашенную кристалвиолетом биопленку бактерий экстрагировали этанолом, декантировали, разводили в 20 раз и измеряли оптическую плотность (ОП) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 540 нм. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами.
Результаты и обсуждение
В составе микрофлоры мокроты больных хроническими заболеваниями НДП были выявлены представители 16 родов микроорганизмов - Streptococcus, Neisseria, Moraxella, Stomatococcus, Corynebacterium, Haemophilus, Staphylococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Escherichia, Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia и Candida. Многие из этих микроорганизмов были выделены также со слизистой зева и носа этих больных (таблица 1), за исключением пневмококков и энтеробактерий, обнаруженных фактически только в мокроте. В связи с этим в составе микробиоценоза НДП диагностически значимыми считались изоляты стрептококков, нейссерий, стоматококков, коринебактерий, моракселл и гемофильных палочек в количестве более 106 КОЕ/мл; кандид - в количестве более 500 КОЕ/мл; а стафилококков, энтеробактерий и неферментирующих глюкозу грамотрицательных бактерий (НФГГОБ) - более 102 КОЕ/мл при условии их стократного преобладания в мокроте по сравнению со слизистой зева.
Условно-патогенные бактерии (УПБ), выделенные от больных в диагностически значимых количествах, были проверены на чувствительность к антибактериальным препаратам
(таблица 2). Чувствительность пневмококков к пенициллиновому ряду антибиотиков проводили с использованием дисков, содержащих 1 мкг оксациллина [7]. Было выявлено
42,9±20,2% резистентных штаммов.
Исследуемые культуры проявляли высокую резистентность к ампициллину (за исключением р-гемолитических стрептококков и дифтероидов), гентамицину (кроме коагулазоотри-цательных стафилококков (КОС), энтеробактерий, дифтероидов), к эритромицину, тетрациклину. Грамотрицательные бактерии были высокоустойчивы к линкозамидам, и среди а-гемолитических стрептококков и дифтероидов наблюдался рост устойчивости к линкомицину. Высокая чувствительность сохранялась к левомицетину (за исключением стафилококков и гемофильных палочек), к цефалоспориновым антибиотикам I и III поколений (кроме а-гемолитических стрептококков, гемофильных палочек и НФГГОБ), к офлоксацину. Резистентность бактерий к другому представителю фторхино-лоновых антибиотиков - ципрофлоксацину, напротив, была высокой, за исключением энтеробактерий и дифтероидов.
Что касается грибов рода Candida, то все выделенные культуры были чувствительны к нистатину, но к амфотерицину В и
таблица 1. Частота высеваемости микроорганизмов из мокроты и со слизистой ВДП больных хроническими заболеваниями НДП
Г
таблица 2. Резистентность бактерий, выделенных при хронических заболеваниях НДП, к антибиотикам (%), н. о. - не определяли
Бактерии Число культур Ампициллин Эритромицин н и ц и г £ н еГ н и т е ц S м о со е н и л о со п ф е ц н о с к а и р т ф е ц н и ц и г о к н и =; н и л к и а р т ? н и ц а с аг о л ф о н и ц а с к о с ф о р п и ц
а - гемолитические стрептококки 90 36,7±4,7 52,2±5,3 58,9±5,2 18,8±10,1 37,5±12,5 22,2±4,4 30,0±4,9 68,6±6,6 16,7±4,0 72,2±4,7
Ь - гемолитические стрептококки 10 10,0±10,0 30,0±15,2 40,0±16,3 0 25,0±25,0 20,0±13,3 10,0±10,0 75,0±25,0 10,0±10,0 50,0±16,7
пневмококки 7 н.о. 28,6±18,4 71,4±18,4 0 н.о. н.о. 14,3±14,3 33,3±33,3 0 42,9±20,2
стафилококки 39 82,1±6,2 48,7±8,1 23,1±6,8 36,4±15,2 4,8±4,8 20,5±6,6 15,4±5,9 39,1±10,4 10,3±4,9 25,6±7,1
в т.ч. КОС 23 82,6±8,1 69,6±9,8 17,4±8,1 50,0±22,4 7,7±7,7 17,4±8,1 17,4±8,1 46,2±14,4 17,4±8,1 30,4±9,8
дифтероиды 14 0 57,2±13,7 7,1±6,9 0 0 0 28,6±12,5 37,5±18,3 7,1±6,9 14,3±9,7
гемофильные палочки 5 40,0±24,5 80,0±20,0 60,0±24,5 >20,0 н.о. 40,0±24,5 80,0±20,0 >40,0 0 40,0±24,5
энтеробактерии 26 62,5±10,1 100 15,4±7,2 0 26,3±10,2 7,7±5,3 100 45,4±15,7 0 3,8±3,8
НФГГОБ 6 83,3±16,7 100 50,0±22,4 0 н.о. 50,0±22,4 100 100 33,3±21,1 33,3±21,1
РАЗДЕЛ III
клотримазолу проявили резистентность 15,3±4,7% и 5,1±2,9% культур соответственно.
У 46 культур стафилококков, энтеробактерий и НФГГОБ, выделенных из ВДП и НДП больных хроническими болезнями легких, был определен комплекс свойств, способствующих их персистенции и обеспечению патогенного потенциала. Известно, что для успешной колонизации тканей бактерии должны обладать адгезивными, инвазивными свойствами и функцией защиты от факторов неспецифического и специфического иммунитета хозяина [8].
Ранее было показано, что адгезивную способность корине-бактерий можно оценить по их гемагглютинирующей активности, которая коррелировала со степенью адгезии на клетках буккального эпителия [5]. Исходя из этого, была определена способность к гемагглютинации у вышеназванных культур бактерий. Однако из 16 штаммов Staphylococcus aureus только 5 обладали активностью с титром гемагглютинации от 1:2 до 1:16, а 11 исследованных культур КОС вообще не агглютинировали эритроциты человека. Из 18 культур энтеробактерий разных видов только 1 штамм Enterobacter cloacae вызывал гемагглюти-нацию в титре 1:128, и еще 2 штамма (E.cloacae, Klebsiella oxytoca) показали агглютинацию эритроцитов в исходной бактериальной суспензии (без разведения), так же, как и одна культура Pseudomonas aeruginosa. При этом в предварительных опытах было выяснено, что энтеробактерии, а также в большей степени стафилококки и синегнойная палочка обладали способностью к адгезии на буккальном эпителии. По-видимому, в случае данных культур гемагглютинация не является адекватным методом исследования адгезивных свойств.
Способность к образованию биопленки бактериями является одним из механизмов их выживания на поверхности различных тканей и органов. Эту способность можно оценить по адгезии микробов к такому материалу, как полистирол, в плоскодонных пластиковых планшетах [6]. В наших исследованиях степень образования биопленки оценивалась в единицах ОП 540 нм, умноженной на 20 (фактор разведения). Очень низкие значения (до 1) показали 6 штаммов энтеробактерий и 1 культура S.epidermidis. В целом распределение исследованных культур по степени адгезии к полистиролу представлено на таблице 3. Энтеробактерии показали, в основном, низкую способность к формированию биопленки (12 из 17 культур), стафилококки - среднюю (S. aureus - 10 из 14 штаммов, КОС - 6 из 9 штаммов), а культура P. aeruginosa - высокую.
В качестве факторов патогенности бактерий с инвазивной функцией были определены лизоцимная и протеолитическая активность.
Лизоцимная активность (ЛА) микробов создает селективные преимущества для патогенов в экологической нише и часто ассоциируется с высокой вирулентностью культур бактерий, вызывающих длительное и тяжелое течение инфекционного процесса [9, 10]. В нашем исследовании ЛА в качественном тесте проявляли 15 из 16 штаммов S. aureus и 1 культура P. aeruginosa. Видимо, это свидетельствует о высокой агрес-
сивности данных бактерий в составе микробиоценоза респираторного тракта. Ни один из исследуемых штаммов КОС и энтеробактерий не показал наличия ЛА.
таблица 3.
Способность бактерий к образованию биопленки на поверхности полистиролового планшета (в единицах 0П540Х20)
бактерии низкая (до 3,0) средняя (3,0 - 6,0) высокая (более 6,0)
S.aureus 3 10 1
S.epidermidis 3 5 0
S.chromogenes о 1 0
P.aeruginosa о 0 1
C.freundii l 0 0
K.oxytoca о 1 1
K.pneumoniae l 0 0
E.cloacae б 0 0
E.aerogenes l 1 0
E.sakazaki l 0 0
E.coLi 2 0 1
S.rubidae о 1 0
Определение протеолитической активности (ПА) по гидролизу двух субстратов (казеина и гемоглобина) при различных рН (8,0 и 4,0) дало возможность оценить наличие щелочных и
кислых внеклеточных протеиназ у исследованных бактерий. Как выяснилось, ПА отсутствовала только у 7 культур энтеробактерий (3 штаммов Klebsiella spp., 2 из 9 - Enterobacter spp., 1 из 4 - E. coli и 1 - Citrobacter freundii). Активность по гидролизу казеина обнаружена у 4 штаммов E. cloacae, 1 штамма Serratia rubidae, 4 штаммов S. aureus и одного штамма Staphylococcus epidermidis. ПА в кислых условиях выявлена у 2 культур Enterobacter aerogenes, 2 - E. coli, 1 - S. aureus, 5 - КОС. Некоторые бактерии расщепляли оба субстрата (9 штаммов S. aureus, 5 - КОС и по одному штамму P. aeruginosa, E. coli и E. cloacae), что, по-видимому, свидетельствует о наличии у них комплекса ферментов с различной специфичностью. Таким образом, внеклеточные протеиназы микробов, обеспечивая их энергетические потенциалы, разрушают гликопротеиновые комплексы бронхиальной слизи, чем в конечном итоге не только готовят место для агрессии, но потенцируют вирулентность продуцирующих ферменты штаммов.
В качестве одного из факторов персистенции исследуемых культур была определена антилизоцимная активность (АЛА). Предварительное исследование АЛА у 11 культур а-гемолитических стрептококков, выделенных из мокроты больных ХОБЛ и БА и со слизистой зева больных хроническим фаринготонзиллитом, показало либо отсутствие, либо очень низкие значения АЛА (менее 1 мкг/мл). Известно, что АЛА< 2 мкг/мл, как у аэробных, так и у анаэробных возбудителей, соответствует благоприятному течению заболеваний. Повышение АЛА микроорганизмов >2 мкг/мл свидетельствует об их высоком патогенном потенциале [11]. В наших исследованиях АЛА отсутствовала у 2 штаммов E. coli и 3 штаммов S. aureus, причем 2 из последних были выделены от одного
больного (из мокроты и со слизистой зева), низкой АЛА (<2 мкг/мл) обладали 20,0±6,0% исследованных культур, высокой - 68,9±7,0%. Распределение АЛА по родам бактерий выглядело следующим образом: активность >2 мкг/мл проявляли 61,1±11,8% энтеробактерий, 62,5±12,5% S. aureus и все КОС. Еще более высокие значения АЛА (>4 мкг/мл) были выявлены у 44,4±12,1% энтеробактерий, 31,3±12,0% S. aureus и 60,0±16,3% КОС. Высокие значения АЛА у КОС, видимо, свидетельствуют о большом персистентном потенциале этих бактерий, часто колонизирующих респираторный тракт и приспособившихся к выживанию в условиях неспецифической иммунной защиты макроорганизма.
В наших исследованиях было показано, что одновременно ПА и АЛА проявляли 24 из 27 культур стафилококков (13 из 16 штаммов S. aureus и все 10 штаммов КОС), 9 из 18 культур энтеробактерий и 1 штамм P. aeruginosa. Кроме того, 7 штаммов энтеробактерий обладали АЛА, не проявляя ПА. В отличие от них стафилококки, обладающие АЛА, во всех случаях демонстрировали ПА, хотя бы по одному субстрату. Исходя из этого, можно предположить протеолитическую деградацию лизоцима стафилококками, однако для энтеробактерий сохраняется вероятность инактивации лизоцима не только за счет действия протеаз.
Заключение
В составе микробиоценозов верхнего и нижнего отделов респираторного тракта больных хроническими заболеваниями НДП были выявлены представители 16 родов микроорганизмов. Помимо присущих нормальной микрофлоре носоглотки а-гемолитических стрептококков, нейссерий, стомато-кокков, большой процент выделения был отмечен также для энтеробактерий (28,1±4,8% - из мокроты), грибов рода Candida (48,3±5,3% - из мокроты, 19,7±4,6% - со слизистой зева) и стафилококков (34,8±5,1% - из мокроты, 14,5±4,1% и 64,3±5,8% - со слизистой зева и носа соответственно), причем большую часть последних составляли коагулазоотрица-тельные стафилококки. Культуры энтеробактерий, НФГГОБ и стафилококков отличались полирезистентностью, однако подавляющее большинство исследованных культур сохраняли чувствительность к офлоксацину, цефалоспориновым антибиотикам I и III поколения (кроме НФГГОБ), левомицети-ну (кроме стафилококков).
Анализ способности к формированию биопленки бактериями показал, что все исследованные штаммы обладали этим свойством, однако оно выражено слабее у бактерий рода Citrobacter, Enterobacter и E. coli, чем у S. aureus, P. aeruginosa, некоторых КОС. В наших исследованиях лизоцимная активность была обнаружена только у S. aureus и P. aeruginosa, тогда как энтеробактерии и КОС ею не обладали. Большинство изученных культур имели выраженную антилизоцимную активность, причем наиболее высокие ее значения были выявлены у КОС. Протеолитическая активность была более выражена у S. aureus и P. aeruginosa. В целом, такие факторы патогенности и персистенции, как ПА и АЛА, в большей степени были присущи культурам S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa, чем представителям семейства Enterobacteriaceae.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4.2.1890-04. Клин. микробиол. антимикроб. химиотерапия, 2004. Т. 6. № 4. С. 306-359.
2. Ермолина Г.Б. Исследование факторов патогенности бактерий, выделенных от детей в многопрофильном стационаре /Г.Б. Ермолина, Е.А. Нестерова, О.А. Баранова, Е.В. Беляева. Современные проблемы эпидемиологии. Сборник статей, посвященных 65-летию кафедры эпидемиологии Нижегородской гос. мед. академии. Н. Новгород.: Изд-во НГМА, 2007. С. 62-67.
3. Беляева Е.В. Оценка секретируемых факторов персистенции возбудителей воспалительных процессов респираторного тракта: пособие для врачей /Е.В. Беляева, Г.Б. Ермолина, Г.К. Дегтева, Е.В. Борискина, Н.В. Меньков. Н. Новгород, 2005. 14 с.
4. Дегтева Г.К. Микробные гидролазы - ферментные препараты. Монография /Дегтева Г.К., Лавровский С.Н., Беляева Е.В. Н. Новгород: Изд-во ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2001. 224 с.
5. Беляева Е.В. Оценка адгезивных свойств коринебактерий дифтерии: пособие для врачей /Е.В. Беляева, Г.Б. Ермолина, Г.К. Дегтева, В.В. Немов. Н. Новгород, 1999. 10 с.
6. Шагинян И.А. Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик /И.А. Шагинян, Г.А. Данилина, Н.Ю. Чернуха и др. Журн. микробиол., 2007. № 1. С. 3-9.
7. Современные методы клинической микробиологии. Вып. 1. Смоленск: МАКМАХ, 2003. 104 с.
8. Бухарин О.В. Механизмы выживания бактерий /О.В. Бухарин, А.Л. Гинзбург, Ю.М. Романова, Г.И. Эль-Регистан. М.: Медицина, 2005. 367 с.
9. Костюкова Н.Н. Начальный этап инфекционного процесса - колонизация и пути ее предотвращения. Журн. микробиол., 2001. № 9. С. 103-109.
10. Бухарин О.В. Лизоцим микроорганизмов /О.В. Бухарин, Н.В. Васильев, Б.Я. Усвяцов. Томск: Томск. университет, 1998. 214 с.
11. Валышев А.В. Факторы персистенции энтеробактерий и влияние на них пробиотиков при дисбиозе кишечника: автореф. дис. канд. мед. наук. Оренбург, 1997. 18 с.
РАЗДЕЛ III
