CC BY
11
06.02.00 ВЕТЕРИНАРИЯ И ЗООТЕХНИЯ
06.02.02 - ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ. ЭПИЗООТОЛОГИЯ, МИКОЛОГИЯ С _МИКОТОКСИКОЛОГИЕЙ И ИММУНОЛОГИЯ (БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ)
УДК 579.62 DOI 10.18286/1816-4501-2020-4-174-183
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГА PHAGUM B.C. 11 УГСХА
Мартынова Ксения Вячеславовна, соискатель кафедры «Микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы»
ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 8(8422)55-95-47
e-mail: belova_kcenya@mail.ru
Ключевые слова: Bacillus coagulons, бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА, биологические свойства, моле-кулярно-генетическая характеристика, биопрепарат.
В статье представлены результаты исследований по изучению биологических свойств бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА. Биоинформационные данные сиквенса Bacillus coagulans phage Phagum B.c. 11 УГСХА: длина: 42609 bp, содержание GC: 37,1 %, молекулярный вес: 27 014 203,97 Da, молярность 1 мкг/мкл раствора: 0.04 мкм, количество молекул в 1 мкг: 2.23 x 1010, А 260 из 1 мкг/мкл раствора после 100-кратного разведения: 0,259. Экспериментально были подобраны технологические параметры культивирования системы фаг/хозяин (0,2 мл бактериофага к 0,2 мл индикаторной культуры B. coagulans), время пассажа - 6 часов при температуре культивирования - 35±20С. Для очистки Phagum B.c. 11 УГСХА рекомендовано использовать мембранные фильтры фирмы Millipore 0,22 цm GV. Определено, чтолитическая активность по Аппельману составила 10-9, по Грация показатель равен 4,0+0,1х1010 (БОЕ/мл); Phagum B.c. 11 УГСХА обладал строгой специфичностью по отношению к штаммам B. coagulans; морфология бляшкообразующих единиц (округлая форма с прозрачным центром, зоны неполного лизиса, диаметр 1-4 мм, вторичного роста не наблюдалось). Эмпирически установлено, что Phagum B.c. 11 УГСХА не терял литической активности спустя 3 месяца при хранении при температуре 2-40С, а через 12 месяцев показатель снижался до 108.
Изученные биологические свойства бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА, выделенного из свежего томата с признаками порчи, специфичного для 46 из 50 бактериальных штаммов Bacillus coagulans, позволяют рекомендовать Phagum B.c. 11 УГСХА для изготовления фагового биопрепарата, применяемого не только в лаборатории в целях индикации и идентификации специфичных ему бактерий Bacillus coagulans, но и для де-контаминации пищевого сырья и продовольственных товаров, профилактики пищевых отравлений, так как данные проведенного нами генетического и протеомного картирования позволяют сделать вывод о том, что бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА не содержит локусов патогенности и их гомологов.
Исследования проводятся в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ,
выполняемых по заданию МСХ РФ в 2019 году.
Введение
Бактерии вида ВасШш соади1а^ благодаря высоким адаптивным возможностям имеют широкое распространение как в воздухе, так и в почве, так же заражению ими подвергаются продукты питания, сырье и материалы, которые используют для их изготовления. Бактерии данного вида, выделяя токсины, вызывают болезни растений, и как следствие этого, развивается
порча как самого сырья, так и готовой продукции [1-2]. Чаще всего плодоовощные консервы подвержены плоско-кислой порче, при которой слабо выражены внешние изменения продукта и отсутствуют какие-либо изменения банки, но при этом токсины могут содержаться в этих консервах. Человек, употребивший такой продукт, может отравиться этими токсинами, так же токсины негативно воздействуют и на животный
организм, в итоге пораженный продукт подлежит только уничтожению [3-5]. Однако, есть сообщения ученых, где описаны патологические процессы у теплокровных, вызываемые Bacillus coagulans [1, 6, 7],
Предприятия, занимающиеся производством консервной продукции, могут избежать материальных потерь, так же не стать распространителями массовых отравлений данными продуктами благодаря использованию при изготовлении овощных и мясорастительных консервов биопрепарата на основе бактериофага [8-9]. Главная особенность биопрепарата на основе фагов заключается в том, что он не влияет ни на сам продукт, ни на организм человека, а связано это с тем, что бактериофаг - это вирус, который активизируется только тогда, когда есть искомая микрофлора, если её нет, то активации бактериофага не происходит [10].
Цель работы - изучить биологические свойства бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА, включая его молекулярно-генетическую характеристику.
Для осуществления поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
- изучить морфологию бляшкообразую-щих единиц,
- провести эксперименты по определению показателей литической активности;
- установить спектр литического действия;
- определить специфичность действия;
- проанализировать характер 30-ти минутного влияния на бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА температуры в диапазоне 45-90 0С и 5-15 минутного воздействия трихлорметана в соотношении 1:10;
- дать молекулярно-генетическую характеристику.
Объекты и методы исследований
Объекты исследования - свежие томаты с признаками порчи. Штаммы Bacillus coagulans: 566, 732, 948, 2770, 3042, 4521, 6668, 10268, 10468, 10473 из музея НИИЦМиБ ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ: Bacillus thuringiensis 2 штамма, Bacillus megaterium - 2, Bacillus anthracis - 4, B. sub-tilis - 6, Bacillus. mesentericus (pumilus) - 8, ВасШш mycoides - 12, Bacillus. cereus - 50; 40 штаммов бактерии ВасШш coagulans, выделенные нами в рамках научных исследований из проб пищевого сырья и продуктов питания и идентифицированные по Bergey's [11].
Выделение бактериофагов и изучение их биологических свойств осуществляли, используя методы Отто, Грациа, Аппельмана [10-16], опро-
бированные сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ [12-14].
Методом метагеномного секвенирова-ния осуществляли получение полногеномных нуклеотидных последовательностей выделенного бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА, так же подтверждали отсутствие лизогении индикаторного бактериального штамма B. coagulans 10268. Используя набор К-Сорб (ООО «НПФ Синтол», Россия), выделяли ДНК бактериофага по протоколу, рекомендованному производителем. У исследуемого бактериофага определяли нуклеотидные последовательности, используя полупроводниковое секвенирование на платформе Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific, США). Прибором Bioanalyzer 2100 и набором реагентов Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, США) осуществляли оценку распределения длин фрагментов библиотек и их концентрацию, используя протокол производителя. Клональная амплификация библиотек осуществлялась предварительно эквимолярно, была пулирована и проводилась с использованием набора Ion PI Template OT2 200 Kit v3 (Thermo Fisher Scientific, США) по протоколу рекомендованному производителем. Используя наборы реагентов Ion PI Sequencing 200 Kit v3 на чипе Ion PI Chip Kit v2 секвенатора Ion Proton (Thermo Fisher Scientific, США) по протоколу производителя проводили секвенирование. Применяя программное обеспечение BLAST Ring Image Generator (BRIG) проводили визуализацию выравнивания собранных геномов с известными. Программным обеспечением UGENE (Унипро, Россия) проводили поиск открытых рамок считывания. Жизненный цикл бактериофага (вирулентный или умеренный) изучали с помощью программы PHACTS (San Diego State University, США). Используя алгоритм blastp (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) определяли потенциально умеренный бактериофаг или подтверждали его вирулентность в ходе определения отсутствия или наличия генов, которые кодируют известные интегразы, репрессоры транскрипции или их гомологи. Программным обеспечением BASys (Bacterial Annotation System) (https:// www.basys.ca) осуществляли визуализацию аннотированного генома.
Исследования были проведены автором самостоятельно под научным руководством д.б.н., профессором Д.А. Bаcильевым и к.б.н., доцентом Н.А. Феоктистовой (ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ).
Результаты исследований
Бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА был выделен из свежего томата с признаками порчи. Выделение бактериофага проводили следующим образом: кусочек томата измельчали в ступке и разводили в мясопептонном бульоне (МПБ) в соотношении 1:10, в полученное содержимое добавляли по 1,0 мл бактериальных штаммов B. coagulans, ставили в термостат на 24 часа при температуре 35±20С. Инкубированное содержимое фильтровали ватно-марлевым фильтром для очищения его от механических примесей. Затем для устранения остатков бактериальной массы осуществляли 30 минутное центрифугирование этого фильтрата при 3000 об./мин. Пока осуществлялось центрифугирование, делали газон на чашках Петри с мясо-пептонным агаром (МПА), используя индикаторные суточные культуры B. coagulans. После подсушивания газона в течение 35-40 минут в условиях термостата исследовали центрифугат на наличие в нём фага. Для этого методом Отто («дорожки») делали посев на газон бактериальной культуры, при этом центрифугат наносили только на половину газона. Другую часть газона использовали для контроля и наносили на неё стерильный МПБ. Этот процесс осуществляли для подтверждения наличия необходимого бактериофага только в изучаемом субстрате. Чашки с посевами ставили на 18 часов в термостат при 35±20С. Зона лизиса культуры в виде «дорожки» (рис. 1) указывала на то, что в исследуемой пробе присутствует искомый бактериофаг.
Рис. 1 - Искомый бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА на газоне культуры B. coagulans 10268
Очистка и селекция бактериофага. Стерильным МПБ заливали чашку с бактериальным газоном и бляшкообразующими единицами фага, далее стерильным стеклянным шпателем аккуратно счищали верхний слой МПА с диффундировавшим в него бактериофагом. Стерильной пипеткой собирали с чашки Петри полученное содержимое, сливали его в чистую пробирку и затем проводили его очищение от бактериальных клеток мембранными фильтрами фирмы Millipore (0,22 мкм).
Алгоритм 10-ти кратного пассирования бактериофага: в одну пробирку с 4,5 мл МПБ добавляли бактерифаг Phagum B.c. 11 УГСХА в количестве 0,2 мл и в неё же вносили 18-часовую индикаторную культуру B. coagulans 10268 0,2 мл, в другую пробирку (контрольную) засевали только 18-часовую индикаторную культуру B. coagulans 0,2 мл. Пробирки с полученными посевами ставили в термостат, содержащий температуру 35±20С, время культивирования завершали тогда, когда в контрольной пробирке наблюдали рост индикаторной культуры (пленка на поверхности МПБ). В отличие от контрольного посева, опытный посев должен был быть прозрачным и без пленки на поверхности [15]. Было визуально зафиксировано, что в контрольном посеве рост бактериальной культуры проявлялся через 6 часов термостатирования при температуре 35±20С.
Оптимальное соотношение бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА и индикаторного штамма B. coagulans 10268 определяли, используя несколько соотношений фага и культуры, такие как 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5. С помощью этого исследования было установлено, что оптимальное соотношение- это 1:1 (0,2 мл бактериофага к 0,2 мл индикаторной культуры B. coagulans.).
Изучение литической активности бактериофага проводили, используя классические методы Аппельмана и Грациа [10-13]. Эмпирически установлено, что выделенный бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА имел литическую активность по Аппельману 10-9, а по Грация 4,0+0,1х1010 (БОЕ/мл).
Основная биологическая характеристика бактериофага - диапазон лизиса гомологичных к фагу бактерий, данное свойство используют для идентификации бактерий [4, 6]. Для определения спектра литического действия изучаемого бактериофага использовали 40 полевых штаммов и 10 референс-штаммов бактерий B. coagulans. Определено, что показатель составил 92% на 50 штаммах.
Затем изучали специфичность бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА в пределах вида. В результате исследования установили, что данный фаг обладал строгой специфичностью по отношению к бактериальным штаммам B. coagulans и не лизировал бактерии гомологичного рода: Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus anthracis, B. subtilis, Bacillus. pumilus, Bacillus my-coides, Bacillus cereus.
Морфология бляшкообразующих единиц фага Phagum B.c. 11 УГСХА: округлая форма с прозрачным центром, зоны неполного лизиса, диаметр 1-4 мм, вторичного роста не наблюдалось (рис. 2).
Изучение влияния температурного фактора (30-ти минутное воздействие температуры в диапазоне 45-90 0С с интервалом в 5 0С) и химических веществ (на примере трихлорметана) позволило бы подобрать дополнительный метод очистки фагов от бактериальных клеток. В результате исследований было определено, что бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА и индикаторная культура B. coagulans 10268 не устойчивы к температурному воздействию, поэтому данный способ очистки применять не следует.
Затем проводили обработку фага Phagum B.c. 11 УГСХА и индикаторной культуры B. coagulans 10268 трихлорметаном, который в большинстве случаев оказывает губительное воздействие на бактерии [11, 12]. В результате индикаторные культуры B. coagulans смогли выдержать только пятиминутную экспозициию с трихлорметаном, а фаг Phagum B.c. 11 УГСХА выдержал воздействие трихлорметана в течение 15 минут. В связи с длительным и трудоемким способом очистки данным методом, нами было решено отказаться от этого способа очистки бактериофага.
Проанализировав результаты проведенных исследований, становится ясно, что для очистки фаголизата от бактерий Bacillus coagulans лучше использовать мембранные фильтры фирмы Millipore 0,22 ^m GV в связи с их быстрой постановкой и эффективным результатом в отличие от применения трихлорметана [14, 17].
Бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА культивировали на коммерческом мясопептонном бульоне с индикаторной культурой Bacillus coagulans 10268, которая хранилась в пробирке на полужидком МПА, рН которого составлял 7,27,4 и содержал 0,3% бактериологического агара, температура хранения - 2-4оС, пересев бактериальной культуры - 1 раз в 4 месяца. Перед использованием производственного штамма
Рис. 2 - Бляшкообразующие единицы бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА
Bacillus coagulans 10268 не реже одного раза в 6 месяцев проводили проверку типичности его тинкториальных, морфологических, культураль-ных биохимических свойств.
Бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА хранили в холодильнике 12 месяцев и в течение этого времени проводили проверку изменения его литической активности по классической методике, используя метод Грациа. Установлено, что в течение 3 месяцев показатели остались прежними 4,0+0,1х1010 бляшкообразующих единиц в 1 мл фаголизата, через 6 месяцев - 6,0+0,1х109 бляшкообразующих единиц в 1 мл фаголизата, спустя 9 месяцев - 5,0+0,1х108 бляшкообразующих единиц в 1 мл фаголизата, через 12 месяцев - 3,0+0,1х108 бляшкообразующих единиц в 1 мл фаголизата. Было эмпирически установле-
■ GC skew
Рис. 3 - Сравнительный анализ гомологии геномов исследуемого бактериофага Bacillus coagulans Phagum B.c. 11 УГСХА и Bacillus phage GIL16c
Таблица 1
Сравнительный анализ генома Phagum B.c. 11 УГСХА с данными геномов, представленных в системе NCBI
Микроорганизм, фрагмент генома Кол-во совпад. п.н. Общее кол-во п.н. микр-ма, фрагмента генома % совпадения E value % идентич-ности фрагмента Код микроорга-низ-ма в базе NCBI
Bacillus thurinaiensis phage GIL16c, complete genome 27401 27401 34% 0.0 100.00% AY701338.1
Bacillus thurinaiensis serovar kurstaki str. HD-1 plasmid pBMBLin15, complete se- 27231 27317 34% 0.0 99.83% CP004882.1
quence
Bacillus thurinaiensis serovar kurstaki strain HD 1 plasmid unnamed9 sequence 27143 27143 34% 0.0 99.84% CP010012.1
Bacillus thurinaiensis strain YC-10 plasmid pYC10, complete sequence 17834 17834 22% 0.0 99.79% CP011355.1
Bacillus thurinaiensis serovar galleriae strain HD-29 plasmid pBMBLin15, complete 15191 22323 33% 0.0 97.04% CP010096.1
sequence
Bacillus anthracis strain 2002013094, complete genome 14482 88202 52% 0.0 99.97% CP009902.1
Bacillus anthracis phage Gamma isolate 53, complete genome 14482 41072 52% 0.0 99.99% DQ222855.1
Bacillus anthracis phage Gamma isolate 51, complete genome 14482 39305 49% 0.0 99.99% DQ222853.1
Bacillus anthracis bacteriophage Fah, complete sequence 14482 41093 52% 0.0 99.99% DQ150593.1
Bacteriophage bacillus 14482 39132 49% 0.0 99.99% DQ221100.2
Bacillus anthracis phage Cherry, complete genome 14475 39300 49% 0.0 99.96% DQ222851.1
Bacillus anthracis phage W Beta, complete genome 13291 39881 51% 0.0 98.41% DQ289555.1
Bacillus anthracis phage Gamma isolate d'Herelle, complete genome 12914 37721 49% 0.0 97.51% DQ289556.1
Bacillus cereus strain JEM-2, complete genome 12205 17766 28% 0.0 94.76% CP018935.1
Bacillus cereus strain ISSFR-9F, complete genome 12205 17766 28% 0.0 94.76% CP018933.1
Bacillus cereus strain ISSFR-3F, complete genome 12205 17766 28% 0.0 94.76% CP018931.1
Bacillus phage AP631, complete genome 12118 31313 45% 0.0 95.54% MK085976.1
Bacillus thurinaiensis strain HD1011, complete genome 11513 18081 29% 0.0 94.20% CP009335.1
Bacillus cereus D17, complete genome 11459 48090 46% 0.0 94.12% CP009300.1
Bacillus thurinaiensis strain XL6, complete genome 10641 23058 30% 0.0 92.28% CP013000.1
Bacillus cereus ATCC 4342, complete genome 10630 15579 27% 0.0 92.12% CP009628.1
Bacillus sp. SYJ chromosome, complete genome 10536 15505 27% 0.0 91.84% CP036356.1
Bacillus cereus strain AR156, complete genome 10475 15534 27% 0.0 91.70% CP015589.1
Bacillus tropicus strain LM1212-W3 chromosome, complete genome 9954 14052 27% 0.0 90.36% CP041071.1
Bacillus cereus strain AR156, complete genome 10475 15534 27% 0.0 91.70% CP015589.1
Bacillus tropicus strain LM1212-W3 chromosome, complete genome 9954 14052 27% 0.0 90.36% CP041071.1
Bacillus thurinaiensis LM1212 chromosome, complete genome 9954 14052 27% 0.0 90.36% CP024771.1
Uncultured Caudovirales phage clone 9AX 2, partial genome 9585 14385 28% 0.0 88.74% MF417893.1
Bacillus anthracis strain MCCC 1A02161 chromosome, complete genome 9577 18873 30% 0.0 94.76% CP031642.1
Bacillus sp. FDAARGOS 527 chromosome, complete genome 8154 18667 26% 0.0 90.59% CP033795.1
Bacillaceae bacterium C05 chromosome, complete genome 8131 19180 29% 0.0 90.52% CP045537.1
Bacillaceae bacterium C02 chromosome, complete genome 7239 14478 28% 0.0 87.93% CP045533.1
Bacillus thurinaiensis strain JW-1 plasmid p5, complete sequence 6722 16595 30% 0.0 92.57% CP045027.1
Bacillus phage pGIL02, complete sequence 6722 16595 30% 0.0 92.57% CP013282.1
Bacillus thurinaiensis HD1002 plasmid 5, complete sequence 6722 16595 30% 0.0 92.55% CP009346.1
Bacillus thurinaiensis HD-789 plasmid pBTHD789-4, complete sequence 6722 16595 30% 0.0 92.57% CP003767.1
Bacillus phage pGIL01, complete genome 6722 16595 30% 0.0 92.57% AJ536073.2
Bacillus thurinaiensis bacteriophage Bam35c, complete genome 6700 16573 30% 0.0 92.49% AY257527.1
Bacillus thurinaiensis serovar morrisoni strain BGSC 4AA1, complete genome 6399 32666 44% 0.0 92.45% CP010577.1
Bacillus thurinaiensis strain L-7601, complete genome 6394 50571 44% 0.0 92.43% CP020002.1
Bacillus paranthracis strain PR1 chromosome, complete genome 5746 12335 25% 0.0 88.12% CP040515.1
Bacillus thurinaiensis strain c25, complete genome 5042 12403 28% 0.0 85.47% CP022345.1
Bacillus cereus B4264, complete genome 5025 12376 28% 0.0 85.41% CP001176.1
Bacillus thurinaiensis strain SCG04-02, complete genome 5003 11089 26% 0.0 85.33% CP017577.1
Bacillus anthracis strain MCCC 1A01412 chromosome, complete genome 4726 8569 17% 0.0 88.51% CP031643.1
Bacillus anthracis phage Gamma collagen region, complete sequence 4229 4229 5% 0.0 100.00% DQ222854.1
Bacillus thurinaiensis serovar tolworthi plasmid pKK6 DNA, complete genome, strain: 4226 8163 16% 0.0 91.38% AP014870.1
Pasteur Institute Standard strain
Bacillus thurinaiensis YBT-1518, complete genome 4117 23120 28% 0.0 82.08% CP005935.1
Bacillus cereus strain HBL-AI chromosome, complete genome 3965 8070 25% 0.0 82.17% CP023245.1
Bacillus thurinaiensis serovar coreanensis strain ST7, complete genome 3956 18590 26% 0.0 82.16% CP016194.1
Bacillus cvtotoxicus strain CH23 chromosome, complete genome 3855 10327 28% 0.0 82.25% CP024104.1
Bacillus cvtotoxicus strain CH25 chromosome, complete genome 3855 10327 28% 0.0 82.25% CP024101.1
Bacillus cvtotoxicus NVH 391-98, complete genome 3843 10001 27% 0.0 82.20% CP000764.1
Bacillus cvtotoxicus strain CH2 chromosome, complete genome 3832 9802 27% 0.0 82.16% CP024116.1
Bacillus cvtotoxicus strain CH3 chromosome, complete genome 3832 9802 27% 0.0 82.16% CP024113.1
Bacillus cvtotoxicus strain CH4 chromosome, complete genome 3832 9802 27% 0.0 82.16% CP024111.1
Bacillus cvtotoxicus strain CH13 chromosome, complete genome 3832 9802 27% 0.0 82.16% CP024109.1
Bacillus cvtotoxicus strain CH15 chromosome, complete genome 3832 9802 27% 0.0 82.16% CP024107.1
Bacillus cvtotoxicus strain CH38 chromosome, complete genome 3832 9857 27% 0.0 82.16% CP024098.1
Bacillus cvtotoxicus strain CH39 chromosome, complete genome 3832 9802 27% 0.0 82.16% CP024096.1
Bacillus thurinaiensis strain HS18-1, complete genome 3362 11976 26% 0.0 85.88% CP012099.1
Bacillus paranthracis strain CFSAN068816 chromosome, complete genome 2796 4539 11% 0.0 82.50% CP045777.1
Bacillus phage vB BceS-MY192, partial genome 2796 4539 11% 0.0 82.50% KT725776.1
Bacillus phage PfEFR-5, complete genome 2791 4534 11% 0.0 82.46% KX227760.1
Bacillus phage PfEFR-4, complete genome 2791 4534 11% 0.0 82.46% KX227757.1
Bacillus virus PBS1, complete genome 2717 9839 6% 0.0 99.86% NC 043027.1
Bacillus virus PBS1, complete genome 2717 4919 6% 0.0 99.86% MF360957.1
Bacillus phage AR9, complete genome 2717 4919 6% 0.0 99.86% KU878088.1
Bacillus phage BtiUFT6.51-F, complete genome 2662 8810 23% 0.0 84.67% MG710484.1
Bacillus thurinaiensis strain Bc601, complete genome 2662 27911 26% 0.0 84.67% CP015150.1
Bacillus phage phi4I1, complete genome 2662 8810 23% 0.0 84.67% KT967075.1
Bacillus thurinaiensis strain YWC2-8, complete genome 2662 27911 26% 0.0 84.67% CP013055.1
Bacillus thurinaiensis strain YC-10, complete genome 2662 27911 26% 0.0 84.67% CP011349.1
Bacillus thurinaiensis serovar tolworthi DNA, complete genome, strain: Pasteur 2662 20500 27% 0.0 84.67% AP014864.1
Institute Standard strain
Bacillus thurinaiensis serovar kurstaki strain HD 1, complete genome 2662 27911 26% 0.0 84.67% CP010005.1
Bacillus thurinaiensis serovar kurstaki str. YBT-1520, complete genome 2662 26506 27% 0.0 84.67% CP004858.1
Bacillus thurinaiensis serovar kurstaki str. YBT-1520, complete genome 2656 27451 27% 0.0 84.64% CP007607.1
Bacillus thurinaiensis strain JW-1 chromosome, complete genome 2593 11251 25% 0.0 85.64% CP045030.1
Bacillus thurinaiensis strain BT-59 chromosome, complete genome 2593 11251 25% 0.0 85.64% CP039721.1
Bacillus thurinaiensis serovar israelensis strain AM65-52, complete genome 2593 11251 25% 0.0 85.64% CP013275.1
Bacillus thurinaiensis HD1002, complete genome 2593 11251 25% 0.0 85.64% CP009351.1
Bacillus thurinaiensis HD-789, complete genome 2593 11251 25% 0.0 85.64% CP003763.1
Bacillus phage phIS3501, complete genome 2593 10375 25% 0.0 85.64% JQ062992.1
Bacillus thurinaiensis serovar kurstaki str. HD73, complete genome 2569 29293 26% 0.0 85.91% CP004069.1
Bacillus thurinaiensis strain YGd22-03, complete genome 2566 10358 27% 0.0 85.44% CP019230.1
Bacillus phage BtCS33, complete genome 2553 7706 20% 0.0 85.79% JN191664.1
Bacillus phage phiCM3, complete genome 2525 8478 23% 0.0 85.58% KF296718.1
Bacillus wiedmanniibv. thurinaiensis strain FCC41 chromosome, complete genome 2508 4419 7% 0.0 83.60% CP024684.1
Bacillus anthracis CZC5 DNA, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% AP018443.1
Bacillus anthracis strain London 499 chromosome, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP029805.1
Bacillus anthracis strain 14RA5914, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP023001.1
Bacillus anthracis str. A16R, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP001974.2
Bacillus anthracis str. A16, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP001970.2
Bacillus anthracis strain Stendal, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP014179.1
Bacillus anthracis DNA, nearly complete genome, strain: Shikan-NIID 2486 6181 10% 0.0 86.88% AP014833.1
Bacillus anthracis strain A1144, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP010852.1
Bacillus anthracis strain Canadian bison, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP010322.1
Bacillus anthracis strain Ames, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP009981.1
Bacillus anthracis str. V770-NP-1R, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP009598.1
Bacillus anthracis strain BA1015, complete genome 2486 6181 10% 0.0 86.88% CP009544.1
Рис. 4 - Линейная диаграмма гомологии геномов исследуемого бактериофага Bacillus coagu-lans Phagum B.c. 11 УГСХА и Bacillus phage GIL16c
но, что семикратное пассирование бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА на бактериальном штамме Bacillus coagulans 10268, можно восстановить его литическую активность на 1 порядок. Изменение литической активности фага Phagum B.c. 11 УГСХА в диапазоне от 108 до 1010 не существенно влияет на свойства фагового биопрепарата, который был сконструирован на основе данного бактериофага [6, 8].
Следующие исследования были направлены на изучение у фага Phagum B.c. 11 УГСХА локусов патогенности и их гомологов.
Нами были получены биоинформационные данные сиквенса Bacillus coagulans phage Phagum B.c. 11 УГСХА: длина: 42609 bp, содержание GC: 37,1 %, молекулярный вес: 27 014 203,97 Da, молярность 1 мкг/мкл раствора: 0.04 мкм, количество молекул в 1 мкг: 2.23 x 1010, А 260 из 1 мкг/мкл раствора после 100-кратного разведения: 0,259.
При сравнительном анализе полного генома Bacillus coagulans phage Phagum B.c. 11 УГСХА были получены результаты, представленные в таблице 1.
В результате сравнительного анализа генома Bacillus coagulans phage Phagum B.c. 11 УГСХА с аннотированными в системе NCBI была доказана его уникальность с наибольшим соответствием геному Bacillus phage GIL16c (34% идентичности).
В результате проведения сравнительного анализа секвенированного генома Bacillus coagulans phage Phagum B.c. 11 УГСХА с эталонным геномом бациллярного бактериофага, представленного в системе NCBI было установлено, что геном Bacillus phage GIL16c оказался по гомологии наиболее близким к изучаемому фагу. На рисунках 3 и 4 отражен сравнительный анализ.
Используя генетические данные, был проведен анализ протеома бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА. На рисунке 5 и в таблице 2 отра-
Рис. 5 - Протеомная карта гомологии бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА генетическим маркерам, аннотированным в системе NCBI
жены результаты соответствия протеома и генома (на основе генетического кода аминокислот, характерного для вирусов и бактерий).
Каждый из протеомных компонентов бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА был сопоставлен с аналогами и составлено его филогенетическое картирование для поиска подобия возможных локусов патогенности (рис. 6) и распределение протеомов исследуемого бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА соответственно их молекулярным массам (рис 7).
По полученным данным генетического и протеомного картирования сделали вывод, что бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА не содержит локусов патогенности и их гомологов. Полученные в результате молекулярно-гентических исследований данные позволяют рекомендовать Phagum B.c. 11 УГСХА для изготовления фагового биопрепарата, применяемого не только в лаборатории в целях индикации и идентификации специфичных ему бактерий Bacillus coagulans, но и для деконтаминации пищевого сырья и продовольственных товаров, а также профилактики пищевых отравлений [17-18].
Обсуждение
Изученные биологические свойства бак-
Таблица 2
Анализ состава протеома фага Phagum B.c. ll УГСХА
Feature Locaban Size u Тур»
hypothetical protein BpSpS 36 17B 143 bp я Ч- COS hypothetical protein BpSpS
hypothetical protein AR9_ffll6 542 1163 642 bp я —* CDS hypothetical protein AR9_gll6
hypothetical protein AR.9_gl]5 Ц» 1456 303 bp я CDS hypothetical protein AR9_gl35
hypothetical protein WLS_gll7 1654 2124 471 bp я 4— CDS hypothetical protein AR9_(jl37
putative secreted/nwmbrane protein 1117 2617 501 bp я CDS putative secreted.1 membrane protein
phage terminate small subunit Pi7 family Î714 31» «6 bp я —» CDS p hage terminase small subunit P27 {a...
terminase large subunit 313« 3714 519 bp я —♦ CDS terminase large subunit
putative phage terminase large subunit 3674 4S7Ï 999 bp я —► CDS putative phage terminase large subunit
inositol kinase 2 iscform X3 3772 4179 408 bp я CDS inositol hexakisphosphate anddiphosp,
phage portal protein 7746 3334 1089 bp я -* CDS phage portal protein
HK97 family ph age prohead protease STBS 9417 630 bp я —► CDS HK97 family phage prohead protease
phage major capsid protein S45Í . 10 63+ 1179 bp я COS phage major capsid protein
phage head closure protein 30 93? . 11 Z62 324 bp Ñ —* CDS phage head closure protein
phage protein, HK97 ^plO family 11 255 . 11 395 441 bp я —* CDS phage protein, HK97 gp 10 family
DLlF31 Si domain-c^ntaining protein 11 692 . 12 051 360 bp я —► CDS DUF316S domain-containing protein
hypothetical protein B4158_5709 12 D15 . 12 395 381 bp я *- CDS hypothetical protein B415fl_57 09
hypothetical protein B415B_5709 12 D15 . 12 395 301 bp t—1 misc_fe»tur*
phage tail tape measure protein 12 052 . 14 389 2138 bp я —* CDS phage tail tap« measure protein
phage tail tape measure protein 1 15 448 , 13 гя 3852 bp я —► COS phage tail tape measure protein
hypothetical protein B415B_S7Q9 18 398 . IG 305 408 bp я COS hypothetical protein B415a_57 09
phage tail protein 19 302 . 20 304 1503 bp я —* CDS phage tail protein
peptidase S74 20 SD1 . 22 903 2103 bp ш —» CDS peptidase S74
hypothetical protein J 23 132 . 23 932 501 bp я CDS hypothetical protein 2
hypothetical protein Glliic_gp04 34 IÎ7 . 33 02+ 738 bp я —► COS hypothetical protein G3L16c_gpO<l
putative DNfl polymerase 14 954 . 17 HS 1162 bp я —* CDS putative DMA polymerase
putative DMA-packaging protein 27 B78 . за 384 807 bp я CDS putabwe DNA-packaging protein
hypothetical protein GILltic_gp04 27 925 . 23 302: 378 bp я —» CDS hypothetical protein G311tic_ijpDQ
hypothetical protein G2Ll<ic_gplO 23 128 . 28 B74 747 bp я —► CDS hypothetical protein GIL16c_gplO
hypothetical protein 3 23 925 . 29 239 315 bp я CDS hypothetical protein 3
hypothetical protein G2Ll<ic_gplS 30 560 . 31 330 1071 bp я —» CDS hypothetical protein GIL16c_gpl8
hypothetical protein A 32 020 . 32 «i 444 bp я COS hypothetical protein 4
hypothetical protein 5 32 138 . 32 569 432 bp я —► CDS hypothetical protein 5
hypothetical protein 6 33 176 . 33 790 615 bp я —» CDS hypothetical protein 3
lytic enzyme 33 794 . 34 54« 753 bp я —* CDS lytic enzynie
hypothetical protein 7 34 485 . 35 0№ 522 bp я CDS hypothetical protein 7
hypothetical protein 8 33 Dil . 35 913 903 bp я —► CDS hypothetical protein 3
hypothetical protein 3 35 917 , 36 798 882 bp я CDS hypothetical protein 9
putative lytic enzyme 36 740 . 37 606 867 bp я —► CDS p utative lytic enzyme
hypothetical protein 10 37 323 . 37 370 348 bp я COS hypothetical protein 10
CLipin domain protein 37 934 . за 515 532 bp я 4— CDS cupin domain protein
hypothetical protein wp43 39 413 . 39 718 303 bp я —► CDS hypothetical protein wp43
hypothetical protein ACS52_00520 39 668 . 40 003 336 bp я CDS hypothetical protein ACS51_00 520
conserved phage protein 40 317 , 40 794 408 bp я CDS conserved phage protein
eradon udease 42 179 . 42 562: 384 bp я —► CDS endonuclease
териофага Phagum B.c. 11 УГСХА, выделенного из свежего томата с признаками порчи, специфичного для 46 из 50 бактериальных штаммов Bacillus coagulans, позволяют рекомендовать Phagum B.c. 11 УГСХА для изготовления фагового биопрепарата, применяемого не только в лаборатории в целях индикации и идентификации специфичных ему бактерий Bacillus coagulans, но и для деконтаминации пищевого сырья и продовольственных товаров, профилактики пище-
вых отравлений, так как данные проведенного нами генетического и протеомного картирования позволяют сделать вывод о том, что бактериофаг Phagum B.c. 11 УГСХА не содержит ло-кусов патогенности и их гомологов. Биоинформационные данные сиквенса Bacillus coagulans phage Phagum B.c. 11 УГСХА: длина: 42609 bp, содержание GC: 37,1 %, молекулярный вес: 27 014 203,97 Da, молярность 1 мкг/мкл раствора: 0.04 мкм, количество молекул в 1 мкг: 2.23 x 1010, А
U
ш QQ
260 из 1 мкг/мкл раствора после 100-кратного разведения: 0,259.
Экспериментально были подобраны технологические параметры культивирования системы фаг/хозяин (0,2 мл бактериофага к 0,2 мл индикаторной культуры B. coagulans), время пассажа - 6 часов при температуре культивирования - 35±20С. Для очистки Phagum B.c. 11 УГСХА рекомендовано использовать мембранные фильтры фирмы Millipore 0,22 цт GV.
Определено, что литическая активность по Аппельману составила 10-9, по Грация показатель равен 4,0+0,1х1010 (БОЕ/мл); Phagum B.c. 11 УГСХА обладал строгой специфичностью по отношению к штаммам B. coagulans; морфология бляшкообразующих единиц (округлая форма с прозрачным центром, зоны неполного лизиса, диаметр 1-4 мм, вторичного роста не наблюдалось).
✓ conserved phage protein 40 387.. 40 794 408 bp CDS /transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid) /product = conserved phage protein
/translation = VNHHLFNWLRDYQKLEEDIAYLEYNLDKTKAELRRWVSGDLREVRLTAESEGAKVENRIEAIEYELAHKMND MYKLKKLISKFRGLENQILKLKYVDGMTLEEIAEAVNYSSSHIKKKHAELVRLIKFVEREGVI* 135 amino acids = 16,0 kDa
rypc:hfrTxaJ prcnia [Biulhiciiui]
bypoth*iic*i prcsua [BjcdJui thsmgwiitj HTH ttutchptice ng^btc: [Bkciliu (mi Rjock3-29]
: i. preigia [Biziljni
lllHTH
F
IUb - -LO,
Ьтс
g'
ЯП
H
hypeûtâcal prt-îftin [Sk:L» rtrrrinfwaual
1 bypoth«o:il prcifra [Bicilhi*. th^rmpmiii] hypothetical protón [Bacdhu toapwu] hypocàeàcal рсс:ьл [Bacill&i ctntu]
prouva [Bacî-hn ïoyoaaaûi] ' bypo(fa*ocil ргоска [BaciJw ip. VCYb209] hypothetical picrtis [B«cilbi c«i»] hypothetical prv<«a [Bacdbu ces*»] MULTISPtCIES: hypothetical pcoîsia [BaoÜai село» çrcap] û prcw л [Bicdhi; Anuyan] MULTISPECIES phin protKS [EkîIHu c«eui poop] ; hypothetical pro rua [Bicù-uv thanaf :«a*.ii ]
k-70 firr>'.îy SNA pclvciicai« up^i £ictoi [BioI2ii certsi} , hypothetical ргожа [Bacilhii wiedcaaseï:] 11 2 lw-и
byp«à«cal proTsia [BkjUsi t¿nnap*oi;v hrpotheOcj] prot»is [Bac illas wiednaaaniv
hypothetical pro tua 'Bacill-v thuriaxieauj] --^HTK Bantcnpàca refulaece [Bacilliî timriajieaui Mfc.ir vono ic. T04001j
114 kavet
pic tua [BacUtai »p KZIl?]
17 lum
Рис. 6 - Пример филогенетического картирования бактериофага Phagum B.c. 11 УГСХА
■ .III 1 1 1 11
ill lili ■ Iii1illir.ii.il 1 III 1 1 1 1 II III
с i с с 1 1 ТУ £ о .с гч с го с « е
о. о. Û о- g о
& о. тз гй Е ? ñ с с О s 1 1 M 1
Б. s о.
» б с "ÏB Е » J- й. 1 2 а s
V (Л> >а rv со cri
а. о. о. ■ — Ô S 0 О
ш LO Îvî СП -
S 3
§ s ±i
с Ç С i
о. £ a. a о û. fi g
1 G 1 Cl 0
"ô i £ ■s; í ■g
Ж JC S
£
g 5" » в о
и' иУ is 4J< с £ С 2 П л VD vo — — *
£ \5 О \5 Q .£ .£• ,£ ,£ -= ra <sj *¡j U
г s г > s
J= JZ xz J= ■s s s s
5 * £ 3 % Я
ïrf ï
E u. g
«f ЯГ
E л в E S «
■ £ S — « ^
о û. a ° ÍÜ E о.
'л e îiïf ï
- # - а
A О Л
S ~ î
a| I î S
Я _ -я £ —
e ¿ л с
i. e s r* » * £ i * С 3 Q
lili
— ^
2 Ü
ï =
» I
Rf
E g
В = I J
I E S E
S -s s ï к H" s
3
Мол. масса, hi Да B.c. 11 УГ-
Рис. 7 - Диаграмма распределения протеомов исследуемого бактериофага Phagum СХА соответственно молекулярным массам
Эмпирически установлено, что Phagum B.c. 11 УГСХА не терял литической активности спустя 3 месяца при хранении при температуре 2-40С, а через 12 месяцев показатель снижался до 108.
Заключение
Биологические свойства Phagum B.c. 11 УГСХА позволяют использовать фаговый препарат, сконструированный на его основе, как для идентификации и видовой дифференциации ВacШus coagulans, так и для обработки консервной тары, консервируемого сырья и готовых продуктов питания.
Библиографический список
1. Современная пищевая микробиология / Под ред. Дж. М. Джеймс; пер. с англ. Е. Баранова. - Москва, Бином, 2012. - с. 888.
2. Порча пищевых продуктов: виды, причины и способы предотвращения / В.Н. Леонтьев, Х.М. Элькаиб, А.Э. Эльхедми // Труды БГУ.
- 2013. - Т. 8, ч. 1. - С. 125-130.
3. Anderson, R.E. Growth and corresponding elevation of tomato juice pH by Bacillus coagulans / R.E. Anderson // J. Food Sci, 1984. - 49: 647, 649.
4. Gustavsson, J. Global food losses and food waste: extent, causes and prevention / J. Gustavsson [et al.]. - Rome : FAO, 2011. - 38 p.
5. Kirkbride, C.A. Porcine abortion caused by Bacillus spp. 1986 / C.A Kirkbride, J. Collins // J. Am. Vet. Med. Assoc, 1996. - 188:1060-1061.
6. McKillip, J.L. Prevalence and expression of enterotoxins in Bacillus cereus and other Bacillus spp., a literature review / J.L McKillip // Antonie Leeuwenhoek, 2000. - 77:393-399.
7. Production of Diarrheal Enterotoxins and Other Potential Virulence Factors by Veterinary Isolates of Bacillus Species Associated with Nongastro-intestinal Infections / Neil J. Rowan, George Caldow, Curtis G. Gemmell, Iain S. Hunter // Applied and environmental microbiology.- 2003. - Vol. 69, No.
- p. 2372-2376. - DOI: 10.1128/AEM.69.4.2372-2376.2003.
8. Алешкин, А.В. Биодеконтаминация и продление сроков годности мясных и рыбных полуфабрикатов с помощью бактериофагов / А.В. Алешкин, Э.Р. Зулькарнеев, Ю.В. Ларина // Астраханский медицинский журнал. - 2015. - Т. 10. - № 4. - С. 40-48.
9. Золотухин, С. Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий : 03.00.07 - микробиология, 03.00.23 - биотехнология: автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук / Золотухин Сергей Николаевич, Ульяновская ГСХА. - Ульяновск, 2007. - 32 с.
10. Kutter, E. Bacteriophages: biology and applications / Е. Kutter, А. Sulakvelidze. - Boca Raton, FL : CRC Press, 2005. - 510 p.
11. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria / W. B. Whitman, P. De-Vos, J. Chun, S. Dedysh, B. Hedlund, P. Rainey, M. Trujillo. - Hoboken, New Jersey: Wiley, 2015 - URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ book/10.1002/9781118960608 (дата обращения 12.07.2018).
12. Юдина, М.А. Перспективы применения бациллярных бактериофагов / М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, Д.А. Bаcильев // «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях»: материалы III Международной научно-практической конференции. - Москва, 2011. - С. 449 - 451.
13. Бактериофаги рода Bacillus: монография / Д.А. Bаcильев, Н.А. Феоктистова, С.Н. Золотухин, А.В. Алешкин - Ульяновск, УГСХА им. П. А. Столыпина, НИИЦМиБ, 2013. - 80 с.
14. Методы выделения бактериофагов рода Bacillus / Н.А. Феоктистова, В.А. Макеев, М.А. Юдина, А.И. Калдыркаев // Вестник ветеринарии. -2011.- № 4 (59). - С. 88-89.
15. Wommack, K.E. Effects of sunlight on bacteriophage viability and structure / K.E. Wommack, R.T. Hill, N.F. Miller, R.R. Colwell // Appl Environ Microbiol. - 1996. - V. 62. - p. 1336-1341.
16. Bacteriophages. Methods and Protocols / Martha R.J. Clokie, A. M. Kropinski, R. Lavigne. -Humana Press, Volume 3. - 2018. - 311 p.
17. Knoll, B.M. Antibacterial bioagents based on principles of bacteriophage biology: an overview / В.М. Knoll, Е. Mylonakis E. // Clin. Infect. Dis. - 2014. -Т. 58. - № 4. - Р. 528-34.
18. Borysowski, J. Phage Therapy: Current Research and Application. J. Borysowski, R. Miedzybrozki, A. Gorsi (Eds.). - Warsaw, 2014. - 378 p.
BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF BACTERIOPHAGE PHAGUM B.C. 11 UGSHA
Martynova K. V. FSBEI HE Ulyanovsk SAU 432017, Ulyanovsk, Novy Venets boulevard, 1; 8(8422)55-95-47 e-mail: belova_kcenya@mail.ru
Key words: Bacillus coagulans, B. bacteriophage Phagum gr. 11 UGSHA, biological properties, molecular genetic characteristics, biopreparation.
The article presents the results of research on the biological properties of the bacteriophage Phagum B. c. 11 UGSHA. Bioinformatic sequence data of Bacillus coagulans phage Phagum B. c. 11 UGSHA: length: 42609 bp, GCcontent: 37,1 %, molecular weight: 27 014 203,97 Da, the molarity of 1 ^g/^l: 0.04 Hm, the number of molecules in 1 g: 2.23 x 1010, And 260 of 1 ng/mql after 100-fold dilution: 0,259. Experimentally technological parameters of cultivation system phage/host were selected(0.2 ml of bacteriophage to 0.2 ml of the indicator culture B. coagulans), passage time-6 hours at the cultivation temperature-35±20C. It is recommended to use Millipore membrane filters of 0.22 ^m GV for cleaning Phagum B. c. 11 UGSHA. It was determined that the lytic activity by Appelman was 10-9, by Grazia the indicator was4,0+0,1x1010 ((BFU / ml); Phagum B. c. 11 UGSHA had strict specificity in relation to B. coagulans strains; morphology of plaque-forming units (rounded shape with a transparent center, zones of incomplete lysis, diameter 1-4 mm, secondary growth was not observed). It is empirically established that Phagum B. c. 11 UGSHA did not lose its lytic activity after 3 months when stored at a temperature of 2-40C, and after 12 months the indicator decreased to 108. The studied biological properties of bacteriophage Phagum B. c. 11 UGSHA isolated from fresh tomatoes with signs of spoiling, specific for 46 out of 50 bacterial strains of Bacillus coagulans, allow us to recommend Phagum B. c. 11 UGSHA for the production of phage biopreparations used not only in the laboratory for the indication and identification of Bacillus coagulans bacteria specific to it, but also for decontamination of food raw materials and food products, prevention of food poisoning, since the data of our genetic and proteomic mapping allow us to conclude that the Phagum B. c. 11 UGSHA bacteriophage does not contain pathogenicity locuses and their homologues.
Bibliography
1. Modern food Microbiology /Edited by J. M. James; transl. from Eng. E. Baranova. - M.: Binom, 2012. - p. 888.
2. Food spoilage: types, causes, and ways to prevent it / V.N. Leontyev, Kh.M. Elkaib, A.E. Elkhemdi //Works of BSU. - 2013. - V. 8, p. 1. - p. 125-130.
3. Anderson, R.E. Growth and corresponding elevation of tomato juice pH by Bacillus coagulans /R.E. Anderson //J. Food Sci, 1984. - 49: 647, 649.
4. Gustavsson, J. Global food losses and food waste: extent, causes and prevention / J. Gustavsson [et al.]. - Rome : FAO, 2011. - p. 38.
5. Kirkbride, C.A. Porcine abortion caused by Bacillus spp. 1986/ C.A Kirkbride, J. Collins //J. Am. Vet. Med. Assoc, 1996. -188:1060-1061.
6. McKillip, J. L. Prevalence and expression of enterotoxins in Bacillus cereus and other Bacillus spp., a literature review/ J.L McKillip//Antonie Leeuwenhoek, 2000. - 77:393-399.
7. Production of Diarrheal Enterotoxins and Other Potential Virulence Factors by Veterinary Isolates of Bacillus Species Associated with Nongastrointestinal Infections / Neil J. Rowan, George Caldow, Curtis G. Gemmell, Iain S. Hunter // Applied and environmental microbiology.- 2003. - Vol. 69, No. - p. 2372-2376. -DOI: 10.1128/AEM.69.4.2372-2376.2003.
8. Biodecontamination and extension of expiry dates of meat and fish semi-finished products using bacteriophages / A.V. Aleshkin, E. R. Zulkarneev, Yu. V. Larina //Astrakhan medical journal. - 2015. - V. 10. - № 4. - p. 40-48.
9. Zolotukhin, S. N. Creation and development of schemes for the use of diagnostic biopreparations based on isolated and studied enterobacteria bacteriophages: 03.00.07-microbiology, 03.00.23-biotechnology: abstract of the dissertation for the degree of doctor of biological sciences / Zolotukhin Sergey Nikolaevich, Ulyanovsk SAA. - Ulyanovsk, 2007. - 32 p.
10. Kutter, E. Bacteriophages: biology and applications / E. Kutter, A. Sulakvelidze. - Boca Raton, FL: CRC Press, 2005. - 510 p.
11. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria/ W. B. Whitman, P. DeVos, J. Chun, S. Dedysh, B. Hedlund, P. Rainey, M. Trujillo. - Hoboken, New Jersey: Wiley, 2015 - URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/book/10.1002/9781118960608 (refernce data 12.07.2018).
12. Yudina, M.A. Perspectives of application of bacillar bacteriophages / M. A. Yudina, N. A. Feoktistova, D. A. Vasiliev // «Scientific and technical creativity of youth — the way to a society based on knowledge»: materials of the III International scientific and practical conference. - Moscow, 2011. - P. 449-451.
13. Bacteriophages of genus Bacillus: monograph / D. A. Vasiliev, N. A. Feoktistova, S. N. Zolotukhin, A.V. Aleshkin-Ulyanovsk, USAA named after P. A. Stolypin, NRCEM, 2013. - P. 66-67 (80 p).
14. Feoktistova, N.A. Methods of isolation of bacteriophages of the genus Bacillus / N. A. Feoktistova, V. A. Makeev, M. A. Yudina, A. I. Kaldyrkaev// Vestnik of veterinary medicine. - 2011. - № 4 (59). - P. 88-89.
15. Wommack, K.E. Effects of sunlight on bacteriophage viability and structure / K.E. Wommack, R. T. Hill, N.F. Miller, R.R. Colwell//Appl Environ Microbiol. -1996. - V. 62. - p. 1336-1341.
16. Bacteriophages. Methods and Protocols, Volume 3 /Martha R.J. Clokie, A. M. Kropinski, R. Lavigne. - Humana Press, 2018. - 311 p.
17. Knoll, B.M. Antibacterial bioagents based on principles of bacteriophage biology: an overview / B.M. Knoll, E. Mylonakis E. // Clin. Infect. Dis. - 2014. - V. 58. - № 4. - P. 528-34.
18. Borysowski, J. Phage Therapy: Current Research and Application. J. Borysowski, R. Miedzybrozki, A. Gorsi (Eds.). - Warsaw, 2014. - 378 p.
