CC BY
27
Инновационное направление науки 15
УДК 577.17
Биологическая аттестация наночастиц системы CuO на бактериальных моделях
Е.А. Сизова1'2, Е.В. Яушева1, Т.Н. Холодилина1'2
1 ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук»
2 ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет»
Аннотация. Одним из направлений совершенствования нанопрепаратов является модификация размера частиц вещества, что определяет различия в их биологических свойствах. По динамике люминесценции lux-биосенсора - генно-инженерного штамма Echerichia coli K12 TG1, конститутивно экспрессирующего luxCDABE-гены природного морского микроорганизма Photobacte-rium leiongnathi 54D10, установлено, что наименьшей токсичностью среди сравниваемых препаратов обладали наночастицы (НЧ) системы CuO(1). Выявлено, что степень токсичности НЧ находилась в зависимости от их физико-химических параметров: удельная поверхность, размер и др., зависящих от условий синтеза. Регуляция условий синтеза путём изменения давления аргона сопровождалась модификацией удельной поверхности и размерности, что в свою очередь отразилось на степени токсичности НЧ. Таким образом, управляемый синтез позволит получить НЧ с заданными показателями, что в рамках дальнейшей работы, позволит изменить токсичность исследуемых НЧ.
Ключевые слова: наночастицы CuO, токсичность, Escherichia coli K12 TG1 pF1, биолюминесценция.
Введение.
Одним из направлений совершенствования нанопрепаратов является модификация размера частиц вещества, что определяет различия в их биологических свойствах [1-3]. Уменьшение размера НЧ повышает абсорбцию и сопровождается изменениями биологического действия частиц элемента, в то же время это сопровождается ростом токсичности [4]. Подобные изменения объясняются различиями в свойствах отдельных частиц и их кластеров, степенью корреляции геометрической структуры и структурной электронной оболочки при взаимодействии с биологическим объектом [5]. Аналогичные зависимости биологической активности НЧ от размера описаны многими учёными [6-9]. Современные исследования демонстрируют наличие как бактерицидных, так и бак-териостатических эффектов НЧ [10, 11]. В то же время используют ультрадисперсные препараты металлов для создания новых пищевых и кормовых добавок-микроэлементов [12-14]. Интерес к их исследованию определяется более высокой биодоступностью и относительно меньшей токсичностью НЧ металлов-микроэлементов [15, 16].
Перспективы использования НЧ обусловлены возможностью контролировать при синтезе их физико-химические характеристики, такие как размер, удельная поверхность, фазовый состав, электрическая проводимость, теплопроводность, каталитическая активность и др., а следовательно, и свойства [17, 18]. Расширить прикладное значение и практическую значимость НЧ микроэлементов позволяет модификация условий их синтеза.
Цель исследования.
Изучение токсичности НЧ системы CuO, синтезированных при различных условиях, в тесте ингибирования бактериальной биолюминесценции с использованием Echerichia coli.
Материалы и методы исследования.
Объект исследования. НЧ CuO(1,2), синтезированные газофазным методом при различных режимах, отличающиеся физико-химическими характеристиками.
16 Инновационное направление науки
Схема эксперимента. В качестве объектов воздействия использовался генно-инженерный люминесцирующий штамм Echerichia coli K12 TG1, конститутивно экспрессирующий luxCDABE-гены природного морского микроорганизма Photobacterium leiongnathi 54D10 (производство НВО «Иммунотех», г. Москва, Россия), в лиофилизированном состоянии под коммерческим названием «Эколюм».
Проведение теста ингибирования бактериальной люминесценции осуществлялось путём внесения в ячейки 96-луночных планшетов из непрозрачного пластика исследуемого вещества и суспензии люминесцирующих бактерий в соотношении 1:1, после чего планшет помещали в измерительный блок микропланшетного спектрофотометра Infinite PROF200 (TECAN, Австрия), динамически регистрирующего интенсивность свечения полученных смесей в течение 180 мин с интервалом 5 мин. Результаты влияния наноматериалов на интенсивность бактериальной биолюминесценции (I) оценивали с использованием формулы
где Ik и Io - интенсивность свечения контрольных и опытных проб на 0-й и n-й минутах измерения.
Учитывали 3 пороговых уровня токсичности:
1. Меньше 20 - образец «не токсичен» (тушение люминесценции < 20 %);
2. От 20 до 50 - образец относительно токсичен (тушение люминесценции 50 %);
3. Равно или больше 50 - образец токсичен (тушение люминесценции > 50 %).
Пробы суспензий НЧ готовили в диапазоне концентраций 0,5 М-0,0002 М и подвергали обработке ультразвуком в течение 30 мин.
Оборудование и технические средства. Размеры НЧ оценивались с помощью измерений удельной поверхности на приборе СОРБИ-М (ЗАО «МЕТА», Россия), визуализация поверхности осуществлялась с помощью сканирующего зондового микроскопа микроскопа Certus Light V (ООО «Нано Скан Тех Трейд», Россия).
Статистическая обработка. Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики с помощью офисного программного комплекса «Microsoft Office» с применением программы «Excel» («Microsoft», США) с обработкой данных в программе «Statistica 10.0» («Stat Soft Inc.», США). Выводы об уровне значимости различий делали, исходя из полученной величины коэффициента Стьюдента (t-критерий) и количества наблюдений в анализируемых выборках. Достоверными считали различия при вероятности ошибки P<0,05, высокозначимыми считали различия при P<0,01 и P<0,001.
Результаты исследований.
НЧ синтезированы газофазным методом с применением разных режимов синтеза (табл. 1).
Таблица 1. Параметры синтеза и характеристики НЧ
Образцы Характеристики газовой системы Удельная поверхность, м2/г Размер, нм Z- потенциал, мВ
давление, Торр скорость, л/час
CuO(1) CuO(2) 150 130 12 100 15.2 80 130 15.5 50 13.8
Контакт E. coli K12 TG1 pF1 c НЧ CuO(1) в диапазоне концентраций 0,5-0,0313 М сопровождался полным ингибированием свечения микроорганизмов в первые 30 мин экспозиции, в дозах 0,0156-0,0078 М через 85-90 мин (рис. 1).
Инновационное направление науки
17
ел —
1000000
100000
10000
1000
100
40 80 120
Время, мин.
0,5
0,25
0,125
0,0625
0,0313
0,0156
0,0078
0,0039
0,0020
0,001
0,0005
Рис. 1 - Динамика свечения E. coli K12 TG1 с клонированными lux CDABE-генами P.leiongnathi 54 D10 при контакте с НЧ CuO(1)
Последующее увеличение разведений от 0,0039 до 0,001 М приводило к полному ингиби-рованию биолюминесценции тест-организма через 125-150 мин контакта, что свидетельствует об острой токсичности концентраций в диапазоне 0,5-0,001 М.
В дозе 0,0005 М НЧ CuO(1) вызывали 30 % ингибирование биолюминесценции бактерий спустя 130 мин контакта и являлись слаботоксичными, тогда как концентрация 0,0002 не оказывала значимого влияния на динамику свечения микроорганизмов и являлась не токсичной.
НЧ CuO(2) являлись более токсичными чем CuO(1) и вызывали полное подавление свечения бактерий E. coli K12 TG1 pF1 в концентрациях 0,5-0,125 М спустя 30-35 мин эксперимента, в дозах 0,0313-0,001 М через 60-75 мин экспозиции (рис. 2). юооооо
юоооо
юооо
юоо
100
ю
80 120 Время, мин.
•0,5 •0,25 •О, 125 0,0625 -0,0313 •0,0156 -0,0078 ■0,0039 0,0020 0,0010 -0,0005
Рис. 2 - Динамика свечения E. coli K12 TG1 с клонированными lux CDABE-генами P.leiongnathi 54D10 при контакте с НЧ CuO(2)
Концентрации 0,0005 и 0,0002 М являлись не токсичными для используемого тест-организма и не оказывали влияния на уровень свечения бактерий.
18 Инновационное направление науки
Обсуждения полученных результатов.
Основными параметрами, определяющими токсичность НЧ, являются химический состав, размеры и форма [19-21]. Так, сравнивая два разноразмерных образца НЧ CuO, было установлено, что более токсичным в одних и тех же концентрациях являются НЧ с меньшим размером. Снижение давления газовой смеси со 150 до 80 Торр привело к уменьшению размерности НЧ в 2 раза. По мере уменьшения размера частиц отмечалось возрастание их токсичности в отношении тест-системы. Согласно литературным данным, подобные изменения объясняются различиями в свойствах отдельных частиц и их кластеров, степенью корреляции геометрической структуры и структурной электронной оболочки при взаимодействии с биологическим объектом [5]. Аналогичные зависимости биологической активности НЧ от размера описаны для ряда НЧ [6-9]. В то же время присутствие кислородных форм на поверхности НЧ является одним из основных факторов биотоксичности [22, 23].
Возможные подходы к пониманию механизма токсического действия НЧ меди на тест-культуру E. coli в условиях контактного взаимодействия связаны с увеличением зарядовой плотности электронов на внешней мембране E. coli при контакте с НЧ, что коррелирует с их ингибирую-щей способностью подавлять рост бактерий и меньшей энергией активации переноса электрона в месте контакта НЧ-E. coli. Анализ этих данных позволяет корректировать условия получения образцов НЧ с заданными свойствами оксидных пленок.
В свою очередь формирование электростатического контакта положительно заряженных агрегатов НЧ (Z=+15.9±8.63 мВ) с отрицательно заряженной поверхностью E. coli K12 MG1655 pSoxS::lux и pKatG::lux с индуцибельным характером свечения (Z=-50.0±9.35 мВ) показало развитие окислительного стресса модельных микроорганизмов, предположительно определяемого переносом электронов через интегрированные с цитоплазматической мембраной НЧ на молекулярный кислород. Итоговым результатом данного процесса явилось повреждение ДНК активными формами кислорода, детектированное с использованием репортерного штамма E. coli pRecA::lux, приводящее к развитию бактерицидного эффекта [24].
Выводы.
Изменение давления газовой смеси влияет на размерные характеристики НЧ. Из исследуемых образцов наименьшей токсичностью обладали НЧ CuO(1). Снижение токсичности НЧ возможно посредством изменения удельной поверхности путём регуляции давления аргона во время синтеза.
Исследования проведены по Программе УрО РАН: Фундаментальные проблемы развития агропромышленного комплекса, проект № 18-8-9-19
Литература
1. Comparison of gene expression profiles in mice liver following intravenous injection of 4 and 100 nm-sized PEG-coated gold nanoparticles / W.S. Cho, S. Kim, B.S. Han, W.C. Son, J. Jeong // Toxicology Letters. 2009. No. 191. P. 96-102.
2. Nano-sized and micro-sized polystyrene particles affect phagocyte function / B. Prietl, C. Mei-ndl, E. Roblegg, T.R. Pieber, G. Lanzer, E. Fröhlich // Cell Biology and Toxicology. 2014. No. 30(1). P. 1-16.
3. Size dependent biodistribution and toxicokinetics of iron oxide magnetic nanoparticles in mice / L. Yang, H. Kuang, W. Zhang , Z.P. Aguilar, Y. Xiong, W. Lai, H. Xu, H. Wei // Nanoscale. 2014. V. 11. No. 7(2). P. 625-636.
4. Synthesis, characterization, and bioavailability in rats of ferric phosphate nanoparticles / F. Rohner, F.O. Ernst, M. Arnold, M. Hilbe, R. Biebinger, F. Ehrensperger, S.E. Pratsinis, W. Langhans, R.F. Hur-rell, M.B. Zimmermann // Journal of Nutrition. 2007. No. 137(3). P. 614-619.
Инновационное направление науки 19
5. Christy L. Haynes and Richard P. Van Duyne. Nanosphere Lithography: A Versatile Nanofab-rication Tool for Studies of Size-Dependent Nanoparticle Optics // Journal of Physical Chemistry B. 2001. 105(24). P. 5599-5611.
6. Size- and charge-dependent non-specific uptake of PEGylated nanoparticles by macrophages / S. Yu Shann, M. Lau Cheryl, N. Thomas Susan, W. Gray Jerome, J. Maron David, H. Dickerson James, A. Hubbell Jeffrey, D. Giorgio Todd // International Journal of Nanomedicine. 2012. 7. P. 799-813. doi: 10.2147/IJN.S28531.
7. Size dependent biodistribution and toxicokinetics of iron oxide magnetic nanoparticles in mice / L. Yang, H. Kuang, W. Zhang, Z.P. Aguilar, Y. Xiong, W. Lai, H. Xu, H. Wei // Nanoscale. 2015. 14. 7(2). P. 625-636.
8. The toxicity effect of cerium oxide nanoparticles on blood cells of male Rat / Masomeh Hamrahi-michak, Seyedeh Anousheh Sadeghi, Hamed Haghighi, Yousoof Ghanbari- kakavandi, Seyed Alireza Razavi-sheshdeh, Mahdi Torkamani Noughabi, Masoud Negahdary // Annals of Biological Research. 2012. 3(6). P. 2859-2866.
9. The Influence of Magnetite Nanoparticles on Human / Anezka Dzarova, Martina Dubnickova, Vlasta Zavisova, Martina Koneracka, Peter Kopcansky, Hubert Gojzewski and Milan Timko // Journal of Life Sciences. 2010. Vol. 4. No. 5. P. 37-43.
10. Toxicological sanitary characterization of titanium dioxide nanoparticles introduced in gastrointestinal tract of rats. Communication 2. Intestinal microbiocenosis condition and allergic sensitivity / S.A. Sheveleva, G.G. Kuznetsova, S.Iu. Batishcheva, N.P. Efimochkina, V.M. Vernikov, V.V. Smirnova, N.E. Sharanova, I.V. Gmoshinskii, S.A. Khotimchenko, V.A. Tutelian. // Voprosy Pitaniia. 2010. 79(5). P. 29-34.
11. Quantifying the Sensitivity of Soil Microbial Communities to Silver Sulfide Nanoparticles Using Metagenome Sequencing / C.L. Doolette, V.V. Gupta, Y. Lu, J.L. Payne, D.J. Batstone, J.K. Kirby, D.A. Navarro, M.J. McLaughlin // PLoS One. 2016. 30. 11(8). e0161979. doi: 10.1371/journal.pone.0161979.
12. О перспективности нанопрепаратов на основе сплавов микроэлементов-антагонистов (на примере Fe и Co) / Е.А. Сизова, С.А. Мирошников, С.В. Лебедев, А.В. Кудашева, Н.И. Рябов // Сельскохозяйственная биология. 2016. 51(4). С. 553-562.
13. Сравнительные испытания ультрадисперсного сплава, солей и органических форм Cu и Zn как источников микроэлементов в кормлении цыплят-бройлеров / Е.А. Сизова, С.А. Мирошников, С.В. Лебедев, Ю.И. Левахин, И.А. Бабичева, В.И. Косилов // Сельскохозяйственная биология. 2018. 53(2). С. 393-403. doi: 10.15389/agrobiology.2018.2.393rus.
14. Морфо-биохимические показатели крови у бройлеров при коррекции рациона солями и наночастицами Cu / Е.А. Сизова, В.Л. Королёв, Ш.А. Макаев, Е.П. Мирошникова, В.А. Шахов // Сельскохозяйственная биология. 2016. № 51(6). С. 903-911.
15. Comparison of short-term toxicity between Nano-Se and selenite in mice / J. Zhang, H. Wang, X. Yan, L. Zhang // Life Science. 2005. No. 76(10). P. 1099-1109.
16. Zhang J., Wang X., Xu T. Elemental selenium at nano size (Nano-Se) as a potential chemo-preventive agent with reduced risk of selenium toxicity: comparison with se-methylselenocysteine in mice // Toxicological Science. 2008. No. 101(1). P. 22-31.
17. Изучение безопасности введения НЧ меди с различными физико-химическими характеристиками в организм животных / О.А. Богословская, Е.А. Сизова, В.С. Полякова, С.А. Мирошников, И.О. Лейпунский, И.П. Ольховская, Н.Н. Глущенко // Вестник Оренбургского государственного университета. Оренбург. 2009. № 2. С. 124-127.
18. Comparative characteristic of toxicity of nanoparticles using the test of bacterial bioluminescence / Е. Sizova, S. Miroshnikov, E. Yausheva, Dianna Kosyan // OSPC. Biosciences, Biotechnology Research Asia. Vol. 12 (Spl. End. 2). P. 361-368.
20 Инновационное направление науки
19. Selvamurugan N. Bio-composite scaffolds containing chitosan/nano-hydroxyapatite/nano-copper-zinc for bone tissue engineering / A. Tripathi, S. Saravanan, S. Pattnaik, A. Moorthi, N.C. Partridge // International Journal of Biological Macromolecules. 2012. 1 January 2012. 50(1). P. 294-299. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2011.11.013.
20. Synthesis of Cu, Zn and Cu/Zn brass alloy nanoparticles from metal amidinate precursors in ionic liquids or propylene carbonate with relevance to methanol synthesis / K. Schütte, H. Meyer, C. Ge-mel, J. Barthel, R.A. Fischer, C. Janiak // Nanoscale. 2014. 21. 6(6). P. 3116-3126. doi: 10.1039/c3nr05780a.
21. Nanobrass CuZn Nanoparticles as Foliar Spray Nonphytotoxic Fungicides / O. Antonoglou, J. Moustaka, I.S. Adamakis, I. Sperdouli, A.A. Pantazaki, M. Moustakas, C. Dendrinou-Samara // ACS Applied Materials & Interfaces. 2018. 7. 10(5). P. 4450-4461. doi: 10.1021/acsami.7b17017.
22. Risom L., M0ller P., Loft S. Oxidative stress-induced DNA damage by particulate air pollution // Mutation Research. 2005. 30. 592(1-2). P. 119-137. Epub 2005. Aug 8. Review.
23. Sayes C, Ivanov I. Comparative study of predictive computational models for nanoparticle-induced cytotoxicity // Risk Analysis. 2010. 30(11). P. 1723-1734. doi: 10.1111/j.1539-6924.2010.01438.x.
24. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминисценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М.: Наука, 2009. 246 с.
Сизова Елена Анатольевна, доктор биологических наук, руководитель центра «Нанотех-нологии в сельском хозяйстве» ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и аг-ротехнологий Российской академии наук», 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, 29, тел.: 8(3532)77-39-97; доцент кафедры биологии и почвоведения ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет», 460018, г. Оренбург, просп. Победы, д. 13, e-mail: Sizova.L78@yandex.ru
Яушева Елена Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник центра «Нанотехнологии в сельском хозяйстве» ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук», 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, 29, тел.: 8(3532)77-39-97, e-mail: icvniims@mаil.ru
Холодилина Татьяна Николаевна, кандидат сельскохозяйственных наук, заведующий Испытательным центром ЦКП ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук», 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, 29, тел.: 8(3532)77-39-97, e-mail: icvniims@mаil.ru; доцент кафедры «Экологии и природопользования» ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет», 460018, г. Оренбург, просп. Победы, д. 13, e-mail: post@mail.osu.ru
Поступила в редакцию 27 ноября 2018 года
UDC 577.17
Sizova Elena Anatolievna1,2, Yausheva Elena Vladimirovna1, Kholodilina Tatyana Nikolaevna1,2
'FSBSI «Federal Research Center for Biological Systems and Agrotechnologies of the Russian Academy of Sciences», e-mаil: Sizova.L78@yandex.ru 2 FSBEIHE «Orenburg State University», e-mail: post@mail.osu.ru Biological certification of CuO nanoparticles on bacterial models
Summary. One of ways to improve nanopreparations is the modification of the particle size of a substance, which determines the differences in their biological properties. According to the luminescence dynamics of lux-biosensor - genetically engineered strain of Echerichia coli K12 TG1, the constitutively expressing luxCDABE-genes of the natural marine microorganism Photobacterium leiongnathi 54D10 was found that nanoparticles of CuO system (1) had the lowest toxicity among the compared drugs. It was revealed that the degree of toxicity of NPs was dependent on their physicochemical parameters: specific surface area, size, etc., depending on the synthesis conditions. The regulation of the synthesis conditions by changing the argon pressure was accompanied by a modification of the specific surface and dimension, which in turn affected the degree of toxicity of the NPs. Thus, controlled synthesis will allow one to obtain NPs with given parameters, which, in the framework of further work, will allow changing the toxicity of the NPs under study.
Key words: CuO nanoparticles, toxicity, Escherichia coli K12 TG1 pF1, bioluminescence.
