CC BY
27
- Т. 129. - С. 57-70
4. Кузнецова Е.А. Флуоресценция листьев высших растений при повышенной температуре // Биофизика. - 1982. - Т. 27, Вып.5. - С. 809-811.
5. Кочубей С.М. Организация пигментов фотосинтетических мембран как основа энергообеспечения фотосинтеза. - К.: Наукова думка,1986. - 192 с.
6. Лайск А., Расулов В.Г., Лорето Ф. Исследование теплового повреждения фотосинтеза методами газообмена и флуоресценции хлорофилла // Физиология растений.
- 1998. - Т. 45, № 4. - С. 489-499.
7. Мелехов Е.И., Долгих Т.А., Беликов П.С. Временный ход фотосинтеза в условиях быстрого и медленного нагрева // Физиология растений. - 1979. - Т. 26, № 1 - С. 167-173.
8. Починок Х.П. Методы биохимического анализа растений. - К.: Наукова думка,1976. - 334 с.
9. Photosynthesis and chlorophyll fluorescence characteristics in relationship to changes in pigment and element composition of leaves of Platanus occidentalis L. during autumnal leaf senescence/ Adams W.W., Winter K., Schreiber U., Schramel P. // Plant Physiology. - 1990. -V. 92. - P. 1184-1190.
10. Bilger W., Schreiber U. Chlorophyll luminescence as an indicator of stress-induced damage to the photosynthetic apparatus. Effects of heart-stress in isolated chloroplasts // Photosynth. Res. - 1990. - V.25, № 3. - Р. 161-171.
11. Temperature dependence of in vitro chlorophyll a fluorescence/ Naus Ya., Snablova M., Dvorak L., Kupka G. // AUPU Eac. Ker. natur. Physica XXV. - 1986. - Vol. 85. - P. 43-59.
12. Schreiber U., Armond P. Heat-induced changes of chlorophyll fluorescence in isolated chloroplasts and related heat-damage at the pigment level // Biochimica et Biophysica Acta. - 1978. - Vol. 502, Jssue. 1. - P. 138-151.
Рекомендовано к печати д.б.н. Шоферистовым Е.П.
БИОХИМИЯ РА СТЕНИЙ
БЮЛОГ1ЧНА АКТИВН1СТЬ ОСНОВНОГО СТЕРО1ДНОГО ГЛ1КОЗИДУ 13
ALLIUM PANICULATUM
Н.В. ТОЛКАЧОВА, кандидат х1м1чних наук;
В.М. СЖОВ, доктор техтчних наук;
Нштський боташчний сад - Нащональний науковий центр О З. КОМАРОВСЬКА-ПОРОХНЯВЕЦЬ, кандидат хгмгчних наук;
В.П. НОВ1КОВ, доктор х1м1чних наук Нащональний ушверситет "Львiвська пол^ехшка"
Вступ
Стерощш гшкозиди е обширним класом природних сполук з групи сапошшв, яю останшм часом привертають додалi бшьше уваги дослщниюв завдяки \х широкому спектру бюлопчно1 активносп та еколопчнш безпещ [8].
Вщомо, що екстракти рiзних рослин, яю належать до родин Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Alliaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, що мютять стерощш гшкозиди, використовуються в традицшнш медицин як протипухлинш, фунгщидш, контрацептивы, антивiруснi i цитотоксичш засоби [1, 9, 12]. Стерощш гшкозиди та i^m похщш використовуються для синтезу гормональних препара^в [8]. Також даш сполуки знижують рiвень холестерину в кровi [13] та виявляють антиоксидантну д^ [3]. Крiм
того, стимулящя росту i фiтоiмунiтету рослин стерощними глшозидами [7, 10] дозволяе розглядати ц речовини як природнi адаптогени.
Актившсть стерощних глiкозидiв залежить вщ природи аткона i кiлькостi вуглеводних залишюв в молекулi. Так, спiростаноловi гшкозиди виявляють велику фунгiцидну i антимшробну активностi [1, 5], тодi як фуростаноловi е стимуляторами росту i фiтоiмунiтету рослин [2, 11].
Перспективними в плаш пошуку сапонiноносних видiв е рослини роду Allium, як виростають в Криму, тим бшьше що в лiтературi данi про стерощш глiкозиди бiльшостi кримських цибуль вщсутш. Саме тому вивчення хiмiчноi структури i бюлопчно'1 активностi стерощних глiкозидiв представникiв родини Alliaceae е актуальним.
Об'екти та методи дослщження
За об'ект дослiдження взято основний стерощний глiкозид, видiлений з листя цибуш волотисто'1 Alliumpaniculatum L., зiбраноi у смт Нiкiта в 2009 р.
Метод А
Антимшробну актившсть речовини вивчали методом дифузп речовини в агар та методом сершних розведень дослщжувано'1 сполуки за стандартними методиками [4].
В агаризованих пластинках твердого поживного середовища (МПА - м'ясо-пептонний агар - для бактерш, СА - сусло-агар - для грибiв) робили лунки, в яю вносили вщповщну кiлькiсть дослщжувано'1 речовини. Мiкробне навантаження 109 клiтин (спор) на 1 см3. Тривашсть шкубацп бактерiй 24 год. при температурi 35°С, грибiв - 48-72 год. при 28-30°С. В контрольнi чашки вносили е^валентну кiлькiсть ДМСО.
У дослiдах використано тест-культури: бактерп Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Mycobacterium luteum та гриби Candida tenuis, Aspergillus niger.
Ступшь активносп дослщжуваних сполук оцiнювали за величиною зон пригшчення росту тест-культур мiкроорганiзмiв. Повторюванiсть дослiду трикратна.
Метод Б
Визначення мшмальних бактерицидно'1 (МБцК), бактеристатично'1 (МБсК), фунгщидно'1 (МФцК) та фунпстатично'1 концентрацiй (МФсК) сполук здшснювали методом серiйних розведень. При цьому дослщжувану речовину розчиняли у ДМСО, досягаючи необхщно'1 концентрацп.
Визначення МБсК (МФсК). Певний об'ем розчину речовини вносили у поживне середовище (МПБ - м'ясо-пептонний бульйон - для бактерш; неохмелене пивне сусло -для грибiв), до якого шокулювали поавний матерiал бактерiй або грибiв. В контрольнi чашки вносили е^валентну кiлькiсть розчинника. Засiянi пробiрки витримували у термостатi при вiдповiднiй температурi (37°С - для бактерiй; 30°С - для грибiв) протягом 24-72 годин. Результати оцшювали за наявшстю чи вiдсутнiстю росту мiкроорганiзмiв (за ступенем мшробно'1 мутностi поживного середовища).
Визначення МБцК (МФцК). Розчини середовища, яю виявились вiзуально прозорими, виавали на стерильне МПА (для бактерш) або СА (для грибiв) та шкубували в термостатi при оптимальних температурних режимах для росту мiкроорганiзмiв. Оцiнювання результатiв здiйснювали для тест-бактерш через 24 год., для тест-грибiв - 4872 год. За вщсутшстю росту колонiй мiкроорганiзмiв на шкубованих чашках Петрi визначали МБцК чи МФцК дослщжувано'1 речовини. Повторювашсть дослiду трикратна.
Досл1дження рктрегулюючоТ активност1
Рiстрегулюючу активнiсть дослщжувано'1 речовини вивчали за стандартною методикою в модифшацп Т.А. Сергеево'1 [6] на агаризованому середовищi такого складу (г/дм3): MgSO4 • 7H2O - 1; K2HPO4 - 1; FeSO4 • 7H2O - 0,02; агар-агар - 8, до якого
додавали певну кшькють розчину препарату i розливали в чашки Петрг В контрольш чашки вносили е^валентну кшьюсть ДМСО.
В дослвд використовували насшня односiм'ядольних рослин (овес) та двоам'ядольних (крес-салат), яке пророщували на агаризованому середовищi 3 доби в термостат за температури 22°С з подальшим дорощуванням проростюв протягом 4 дiб у витяжнш шафi iз штучним освiтленням при 19-20°С.
В кiнцi дослiду визначали схож1сть насiння i лiнiйнi розмiри частин рослин. Результати поданi у вщсотках порiвняно з контролем. При показнику, що перевищуе 100%, ощнювалася стимуляцiя росту, а при показнику менше 100% - пригнiчення росту. Повторювашсть дослiдiв трикратна.
Результати та обговорення
Дослщжуючи стерощш глiкозиди рослини A. paniculatum L., з листя видшили основний новий сапонш: 3-0^-й-глюкотранозил-(1^-2)-0^-й-глюкотранозид-(25К)-5ß-фуростан-3ß,22a,26-триол-[26-0-ß-D-глюкопiранозид] - глiкoзид А.
З метою первинного ощнювання антимшробно1 активносп дослщжувано1 сполуки нами проведено тестування ще1 речовини методом дифузп речовини в агар, використовуючи рiзнi концентрацп (0,1; 0,5; 1,0 i 2,5%). Аналiз отриманих результатiв свiдчить про те, що у дослщжуваних концентращях глiкозиду А зон пригнiчення росту мiкроорганiзмiв не спостерiгалось.
Метод сершних розведень речовин дозволяе встановити кшьюсш показники мшмально1 шпбуючо1 (статично") концентрацп та мшмально1 бюцидно1 концентрацп' щодо тест-культур бактерiй i грибiв. В результат експериментiв встановлено, що висок концентрацп глiкозиду А виявляють вибiркову дiю на бактерп - шпбують рiст грам-позитивних тест-бакте^ш. А саме, МБсК щодо St. aureus i Myc. luteum, вщповщно, становила 1400 мкг/см i 2000 мкг/см . При цьому грам-негативна культура бактерп E. coli виявилася нечутливою до дп глiкозиду А в дослщжуваних концентращях (табл. 1 i 4).
Таблиця 1
Показники мШмально!' бактерицидно!' концентрацп (МБцК) i мпшмально!'
бактерюстатичноТ концентрацп (МБсК) сполук __методом серiйних розведень (метод Б)_
Код сполуки Культури бактерш
E. coli St. aureus Myc. luteum
МБсК, мкг/см3 МБцК, мкг/см3 МБсК, мкг/см3 МБцК, мкг/см3 МБсК мкг/см3 МБцК мкг/см3
глшозид А + + 1400 >2000 2000 >2000
В таблицях 2 i 5 представлеш результати вивчення фунгщидних властивостей дослщжувано'1' сполуки. На основi отриманих даних встановлено, що гшкозид А в концентрацп 2000 мкг/см3 мае фунпстатичш властивостi щодо тест-культури цвшьового гриба A. niger, а дрiжджова культура C. tenuis виявилася резистентною до дп дослщжувано'1' сполуки у вивчених концентрацiях, про що свщчить активний рiст цього гриба в присутносп глiкозиду А на рiвнi контрольного зразка.
Таблиця 2
Показники мпшмально! фунгщидноТ концентрацп (МФцК) i мпшмальноТ'
Код сполуки Культури грибiв
Candida tenuis Aspergillus niger
МФсК, мкг/см3 МФцК, мкг/см3 МФсК, мкг/см3 МФцК, мкг/см3
глшозид А + + 2000 >2000
Наступним етапом наших дослщжень було вивчення потенцшно'1 рютрегулюючо'1 активностi сапонiну на тест-рослинах в умовах лабораторних випробувань за вищезгаданою методикою. Результати дослщжень, яю наведенi у таблицi 3, характеризують гшкозид А як сполуку з добре вираженими рютстимулюючими ефектами
3 *3
в концентрацп 10 мг/дм та рютшпбуючими властивостями в концентрацп 100 мг/дм .
Таким чином, отримаш результати говорять про те, що гшкозид А виявляе слабку бактерицидну i фунпцидну актившсть; водночас вш характеризуеться високою рютрегулюючою активнiстю, що цiлком узгоджуеться з л^ературними даними.
Таблиця 3
Код сполуки Концент-рашя сполук, мг/дм3 Лшшш розмiри частин рослини i схож1сть, % до контролю
овес крес-салат
корш ь стебл о схожють корш ь стебло схо жю ть
гшкози 100 72 92 100 31 53 100
д А 10 172 109 100 126 79 106
1 90 92 89 88 94 84
Таблиця 4
Встановлення мпшмальноУ бактерицидно!' концентрацн (МБцК) i мишмальноУ бактерюстатичноТ концентрацн (МБсК) сполук ___методом сершних розведень (метод Б)__
Код Культури Концентращя зечовини, мкг/см3
сполуки бактерш 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 500 250 125 62, 5 31, 2 15, 6 7,8 3,9 1,9 0,9 0 (К)
Е. евН + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
глiкози
д А аигет * ± ± ± + + + + + + + + + + + + + + +
Муе. ¡иХеиш * + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Таблиця 5
Встановлення мшмальноТ' фунпцидноТ концентрацн (МФцК) i мишмальноУ фунпстатично! концентращ! (МФсК) сполук ___методом сершних розведень (метод Б) _
Код Культ ■Сонцентращя зечовини, мкг/см3
сполуки ури грибiв 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 500 250 125 62, 5 31, 2 15, 6 7,8 3,9 1,9 0,9 0 (К)
С. + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
гшкози 1епи1$
д А А. niger * + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Позначення: + рют культури мшрооргашзму
± пригшчення росту мшрооргашзму - вiдсутнiсть росту мшрооргашзму
Висновки
1. При використанш методу дифузп речовини в агар у дослщжуваних концентращях гшкозиду А зон пригшчення росту мiкроорганiзмiв не спостерiгалося.
2. За допомогою методу сершних розведень встановлено мшмальну бактерiостатичну концентрацiю глiкозиду А щодо грам-позитивних бактерiй St. aureus
3 3
(1400 мкг/см ) i Myc. luteum (2000 мкг/см ). Грам-негативна культура бактерш E. coli виявилася резистентною щодо дано'1' сполуки в дослщжуваних концентращях.
3. Встановлено мшмальну фунгютатичну концентращю глiкозиду А щодо культури гриба Aspergillus niger, яка становить 2000 мкг/см3. Нечутливою до дослщжувано'1' речовини у вивчених концентращях виявилася культура Candida tenuis.
4. Дослщжувана сполука у концентрацп 10 мг/дм3 на 72% (порiвняно з контролем) стимулюе рют кореня вiвса i на 26% - рют кореня крес-салату.
5. Суттевий пригнiчувальний ефект на рiст частин тест-рослин спостер^аеться
3
при концентрацп гшкозиду А 100 мг/дм .
Список лггератури
1. Васильева И.С., Пасешниченко В.А. Состав и биологическая активность стероидных гликозидов из суспензионной культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall. // Прикл. биохим. и микробиол. - 1995. - Т. 31. - С. 238-242.
2. Кинтя П.К. Природные биорегуляторы стероидного типа в сельском хозяйстве // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. II конф., 29 июня - 1 июля 1993 г., г. Москва. - М., 1993. - Ч. 1. - С. 97.
3. Кинтя П.К., Ковальчук Л.П., Бурцева С.А. Поиск антиоксидантов в ряду стероидных гликозидов // Хим. фарм. журнал. - 1982. - № 1. - С. 95-97.
4. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований - М.: Медицина, 1972. - С. 91-93.
5. Лазурьевский Г.В., Кинтя П.К., Ковальчук Л.П. Антимикробная активность стероидных гликозидов в связи с их химическим строением // ДАН СССР. - 1980. - Т. 6. - С. 1479-1482.
6. Сергеева Т.А. Методика лабораторных испытаний гербицидов // Защита растений. - 1963. - №2. - С. 42-44.
7. Стероидные фуростаноловые гликозиды - новый класс природных адаптогенов / Васильева И.С., Удалова Ж.В., Зиновьева С.В., Пасешниченко В.А. // Прикладная биохимия и микробиология - 2009. - Т. 45, № 5. - С. 517-526.
8. Строение и биологическая активность стероидных гликозидов ряда спиростана и фуростана / Кинтя П.К., Лазурьевский Г.В., Балашова Н.Н. и др. -Кишинев: Штиинца, 1987. - 142 с.
9. Multiple functions of sterols in yeast endocytosis / Heese-Peck A., Pichler H., Zanolari B., Watanabe R, Daum G, Riezman H. // Mol. Biol. Cell. - 2002. - Vol. 13. - P. 2664-2680.
10. Hoagland R.E., Zablotowicz R.M., Reddy K.N. Studies of the phytotoxicity of saponins on weed and crop plants // Adv. in Exp. Med. and Biol. - N.Y.-London: Plenum Press. - 1996. - Vol. 405. - P. 57-73.
11. Nohara T., Yahara S., Kinjo J. Bioactive saponins from solanaceous and leguminous plants // Adv. in Exp. Med. and Biol. - N.Y.- London: Plenum Press. - 1996. -Vol. 404. - P. 263-276.
12. Oleszek W., Marston A. Saponins in food, feedstuffs and medicinal plants // Phytochemical Society of Europe. - 2000. - Vol. 45. - Р. 241-254.
13. Steroid saponins from fenugreek and some of their biological properties /Sauvaire Y., Baissac Y., Leconte O., Petit P., Ribes G. // Adv. in Exp. Med. and Biol. N.Y. - London: Plenum Press. - 1996. - Vol. 405. - P. 37-46.
Рекомендовано до друку д.б.н. Митрофановою 1.В.
